新型生物材料聚β苹果酸β羟基丁酸酯共聚物的合成及其性质研究论文.docx

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新型生物材料聚β苹果酸β羟基丁酸酯共聚物的合成及其性质研究论文

新型生物材料聚β-苹果酸/β-羟基丁酸酯共聚物的合成及其性质研究

目录

缩略语表1

中文摘要3

Abstract5

前言8

文献回顾10

1天然药用高分子材料10

1.1多糖类10

1.2蛋白质类11

1.3多肽类12

1.3聚酯类和其他13

2脂肪族聚酯类的研究及应用14

2.1β-聚苹果酸的研究及应用14

2.1.1β-聚苹果酸及其共聚物的合成研究15

2.1.2β-聚苹果酸及其共聚物在药物载体方面的应用16

2.2聚-β-羟基丁酸酯的研究及应用17

2.2.1聚-β-羟基丁酸酯的性质及其改性研究17

2.2.2聚-β-羟基丁酸酯及其衍生物在药物物载体方面的应用18

3课题的提出19

正文21

第一部分聚-β-羟基丁酸酯和共聚物的合成21

1材料与仪器21

1.1实验试剂21

1.2实验仪器22

2实验方法23

2.1聚-β-羟基丁酸酯的合成23

2.2共聚物的合成23

2.2.1β-苹果酸苄基内酯单体的合成及密度测定23

2.2.2P（MLABe-co-BL）和PMLABe-co-PHB的合成24

2.2.3P（MLA-co-BL）和PMLA-co-PHB的合成25

2.3测试与表征26

3结果与讨论26

3.1聚-β-羟基丁酸酯的合成26

3.2β-苹果酸苄基内酯单体的合成29

3.3P（MLABe-co-BL）和PMLABe-co-PHB的合成30

3.3微观聚合机理分析34

3.4P（MLA-co-BL）的合成37

第二部分共聚物的性质研究39

1材料与仪器39

1.1实验试剂39

1.2实验仪器39

2实验方法40

2.1共聚物粒径、zeta电位和溶解度的测定40

2.1.1粒径测定40

2.1.2Zeta电位测定40

2.1.3溶解度测定40

2.2共聚物的降解40

2.2.1P（MLABe-co-BL）的降解40

2.2.2P（MLA-co-BL）和PMLA-co-PHB的降解41

2.3细胞毒性测定41

2.3.1细胞的培养41

2.3.2P（MLABe-co-BL）的细胞毒性实验41

2.3.3P（MLA-co-BL）和PMLA-co-PHB的细胞毒性实验42

2.4溶血实验42

2.4.1兔全血的采集和2%红细胞混悬液的配制42

2.4.2P（MLABe-co-BL）的溶血实验43

2.4.3P（MLA-co-BL）和PMLA-co-PHB的溶血实验43

3结果与讨论43

3.1粒径、zeta电位和溶解度的测定43

3.2共聚物的降解44

3.2.1P（MLABe-co-BL）的降解44

3.2.2P（MLA-co-BL）和PMLA-co-PHB的降解46

3.3细胞毒性测定47

3.3.1P（MLABe-co-BL）的细胞毒性测定47

3.3.2P（MLA-co-BL）和PMLA-co-PHB的细胞毒性测定47

3.4溶血实验48

3.4.1P（MLABe-co-BL）的溶血实验48

3.4.2P（MLA-co-BL）和PMLA-co-PHB的溶血实验48

第三部分PMLA-co-PHB的应用和展望50

1材料与仪器50

1.1实验材料50

1.2实验仪器50

2实验方法51

2.1PMLA-co-PHB空白胶束的制备51

2.2PMLA-co-PHB包封色胺酮胶束的制备52

2.3PMLA-co-PHB胶束包封率和载药率的测定52

2.4PMLA-co-PHB临界胶束浓度（CMC）的测定53

3结果与讨论53

3.1PMLA-co-PHB胶束的制备53

4材料的应用展望54

4.1在药物载体方面的应用55

4.2在其它方面的应用55

小结57

参考文献58

附录67

研究成果71

致谢72

缩略语表

缩略词

英文全称

中文全称

BL

β-butyrolactone

β-丁内酯

MLABe

benzyl β-malolactone

β-苹果酸苄基内酯

TFAA

Trifluoroaceticanhydride

三氟乙酸酐

P（MLABe-co-

BL）

Poly （benzyl β-malolactone-co-β-butyrolactone）

聚（β-苹果酸苄基酯-co-β-羟基丁酸酯）

P（MLA-co-BL）

Poly（β-malicacid-co-β-butyrolactone）

聚（β-苹果酸-co-β-羟基丁酸酯）

IR

InfraredSpectroscopy

红外光谱

CMC

CriticalMicelleConcentration

临界胶束浓度

GPC

GelPermeationChromatography

凝胶渗透色谱

PHB

Poly（β-hydroxybutyrate）

聚-β-羟基丁酸酯

PMLA

Poly（β-malicacid）

β-聚苹果酸

Mw

Weight-averageMolecularWeight

重均分子量

PMLABe-co-PHB

Poly （benzyl β-malolactone）-co-Poly（β-hydroxybutyrate）

聚-β-苹果酸苄基酯-co-β-聚羟基丁酸酯

PMLA-co-PHB

Poly （ β-malicacid）-co-Poly（β-hydroxybutyrate）

β-聚苹果酸-co-β-聚羟基丁酸酯

PHAs

polyhydroxyalkanoates

聚羟基脂肪酸

Mn

Number-averageMolecularWeight

数均分子量

PCL

polycaprolactone

聚己内酯

NMR

NuclearMagneticResonance

核磁共振

PBS

PhosphateBufferedSaline

磷酸盐缓冲液

THF

Tetrahydrofuran

四氢呋喃

PEO 

polyoxyethylene

聚氧化乙烯

PVA 

Poly （vinyl alcohol）

聚乙烯醇

PLA

Poly（lacticacid）

聚乳酸

PDI

PolydispersityIndex

多分散系数

PLGA

Poly（lactide-co-glycolide）

聚（丙交酯-co-乙交酯）

ROP

Ring-openingPolymerization

开环聚合法

PASP

Polysucciuimide

聚天冬氨酸

Y-PGA

Polyglutamicacid

聚谷氨酸

PLH

Poly-L-histidine

聚组氨酸

PArg

Poly-L-arginine

聚精氨酸

PL

Polylysine

聚赖氨酸

GSH

Glutathione

谷胱甘肽

PEG

Polyethyleneglycol

聚乙二醇

MDI

MethylenediphenylDiisocyanate

二苯基甲烷二异氰酸酯

新型生物材料聚β-苹果酸/β-羟基丁酸酯共聚物

的合成及其性质研究

中文摘要

聚苹果酸（PMLA）是一种结构规整的水溶性脂肪族聚酯，具有生物降解性、生物相容性和无免疫原性，主链上具有多个悬挂羧基，可以很好的被修饰或改性形成聚合物前药，但PMLA亲水性强、降解过快，用作生物高分子材料存在诸多缺陷。

聚-β-羟基丁酸酯（PHB）是一种由细菌发酵产生的热塑性聚酯，具有良好的生物相容性，但存在易结晶、疏水性强和降解时间长等缺点。

本课题拟采用PHB改性PMLA，以期达到优势互补，改善聚苹果酸的性能。

以苯甲酸四乙铵为引发剂，通过阴离子开环引发β-苹果酸苄基内酯（MLABe）和β-丁内酯（BL）开环共聚。

研究中考察了不同比例的混合单体在不同的反应时长、反应温度及不同的加入顺序等条件对共聚的影响。

两单体通过混合均匀后同时聚合或是分时段加入而分别得到两种疏水性的共聚物：

无规共聚物聚（β-苹果酸苄基酯-co-β-羟基丁酸酯）（P（MLABe-co-BL））和嵌段共聚物β-聚苹果酸苄基酯-co-β-聚羟基丁酸酯（PMLABe-co-PHB）。

氢化苄基后分别得到两亲性的共聚物：

聚（β-苹果酸-co-β-羟基丁酸酯）（P（MLA-co-BL））和β-聚苹果酸-co-β-聚羟基丁酸酯（PMLA-co-PHB）。

在共聚之前，先优化了β-苹果酸苄基内酯单体的合成过程。

课题组前期的研究已表明引发剂苯甲酸四乙铵能够引发β-苹果酸苄基内酯单体开环聚合形成PMLA，但未证实对β-丁内酯有同样的引发作用，本实验用1H-NMR，13C-NMR和FT-IR表征了β-丁内酯开环聚合形成的产物聚-β-羟基丁酸酯，证实该引发剂对β-丁内酯有同样的开环作用，为β-苹果酸苄基内酯和β-丁内酯单体共聚提供实验基础。

对无规共聚物P（MLABe-co-BL）聚合过程的研究发现，加入不同聚合单体的比例，共聚物组成有明显差别。

MLABe的竞聚率比BL的大，加入BL的比率越多，聚合时间就越长。

MLABe/BL为50/50（mol/mol）时的微观聚合机理表明，聚合过程中酯交换剧烈，趋向于无规共聚。

MLABe/BL为75/25（mol/mol）时，聚合时间短、共聚产物分子量适中且分布宽度窄，所以后续实验均使用该比例聚合。

P（MLA-co-BL）、PMLA-co-PHB的亲水性、降解性和溶解度分别介于P（MLABe-co-BL）和PMLA之间，改善了PMLA用做药物载体降解快、负电性大的特点。

通过细胞毒性实验和溶血实验发现P（MLABe-co-BL）有一定的细胞毒性，但没有溶血现象。

低浓度（0.4mg/mL以下）的P（MLA-co-BL）没有抑制细胞增长，反而具有促进作用；随着浓度的增加，在高于0.8mg/mL后有轻微的抑制作用。

嵌段共聚物PMLA-co-PHB随着浓度的增加没有呈现出细胞毒性。

在溶血实验中，材料浓度为0.2mg/mL时，无规共聚物的溶血率（0.5543±0.05%）小于嵌段共聚物（3.249±0.04%），可能是嵌段共聚物相比无规共聚物在溶液中更容易形成胶束。

随着材料浓度的增加，细胞成棕褐色并有沉降产生。

课题进一步开展了嵌段共聚物PMLA-co-PHB形成纳米胶束用作药物载体的研究。

以色胺酮为药物模型通过透析法制备载药胶束，包封率为8.35±0.29%，载药率为2.67±0.2%，粒径为242nm。

为PMLA-co-PHB用作聚合物纳米药物运载体系提供了前期实验基础。

下一步我们将开展PMLA-co-PHB作为药物载体以及P（MLA-co-BL）在组织工程支架方面的应用。

关键词：

β-苹果酸苄基内酯；β-羟基丁酸酯；聚合物胶束；聚合物药物载体；降解

Synthesisandbiologicalpropertiesofnewbiologicalmaterialsβ-malicacid/β-butyrolactonecopolymers

Abstract

Poly（β-L-malicacid）（PMLA）isanaturalaliphaticpolyester,anditwasprovedtobebiodegradable,non-toxicandnon-immunogenic.Furthmore,itcouldprovidemultiplesuspendcarboxyltoformpolymerpro-drugs.However,itsstronghydrophilicityandfastdegradationtimelimitsitsapplication.Poly（β-hydroxybutyrate）（PHB）isathermoplasticpolyesterproducedbyabacterialfermentation,andithasgoodbiocompatibility.Butitisstronglyhydrophobicandshowslongdegradationtime.Inthisstudy,PHBwasusedtomodifyPMLA,realizingcomplementaryadvantages.

Thecopolymerwassynthesizedby ring-opening polymerizationof  benzyl β-malo-lactone（MLABe） and β-butyrolactone（BL）,usingtetraethylammonium benzoicacid asinitiator.Ratioofthetwomonomers,reactiontimes,temperaturesandaddingorderswerestudiedtoexaminetheimpactofthesefactorsonthecopolymerization.Twomonomerswereaddedsimultaneouslyorsuccessively,andtwodifferenthydrophobicpolymerswereobtained:

randomcopolymersP（MLABe-co-BL）andblockcopolymersPMLABe-co-PHB.AmphiphiliccopolymersP（MLA-co-BL）andPMLA-co-PHBwereobtainedbyhydrogenation.Thesyntheticprocessofbenzyl β-malolactonemonomerswasoptimizedbeforethecopolymerization.Inourpreviousstudy,theinitiatortetraethylammoniumbenzoatewasusedtotriggerthering-openingpolymerizationtoformPMLA.However,thisstudystillneedtoconfirmiftheinitiatorcanalsotriggerthepolymerizationofβ-butyrolactone.1H-NMR,13C-NMRandFT-IRwereusedtocharacterizethepolymerpoly（β-hydroxybutyrate）（PHB）.Theresultsshowedthattheinitiatorcouldbeusedtoinitiatethepolymerizationofβ-butyrolactone,whichlaidthefoundationforcopolymerizationreaction.

ResearchonpolymerizationprocessoftherandomcopolymerP（MLABe-co-BL）showedthatthereisasignificantdifferencesinthecompositionofthecopolymerswhendifferentratioofmonomersadded.ScaleofmicropolymerizationmechanismindicatedthattheratioofMLABe andBLis50/50（mol/mol）,whichresultinseveretransesterificationinthepolymerizationprocess,tendstorandomcopolymerization.Whentheratiois75/25（mol/mol）,copolymerizationproductsobtainedinshorttimewhichhavemoderatemolecularweightandnarrowdistributionwidth.Therefore,allofthesubsequentpolymerizationexperimentstakethisration.

Thehydrophilicity,degradabilityandsolubilityofP（MLA-co-BL）andPMLA-co-PHBwerebetweenthatofP（MLABe-co-BL）andPMLA,whichcouldovercometheshortcomingsofPMLA,suchasfastdegradationandstonglynegativecharge.InvitrocytotoxicitystudyfoundthatP（MLABe-co-BL）showedcertaincytotoxicity.TheresultofhemolysisassaysuggestedthatP（MLABe-co-BL）possessgoodbiocompatibility.P（MLA-co-BL）didnotinhibitcellgrowthatlowconcentrations（0.4mg/mLorless）.Aslightinhibitionwouldhappenwithincreasingconcentrationto0.8mg/mL.Accordingly,theblockcopolymersPMLA-co-PHBwithincreasingconcentrationdidnotexhibitcytotoxicity.Inhemolysistest,theconcentrationofmaterialat0.2mg/mL,hemolysisrateofrandomcopolymeris0.5543±0.05%,lessthanthatofblockcopolymer,3.249±0.04%.Thissuggestedthatrandomcopolymermaybeeasiertoformmicellesinaqueoussolutioncomparedtoblockcopolymer.Withtheincreasingofconcentrationofmaterial,cellsturnedintobrownandsettledontothebottom.

TheresearchofnanomicellesformedbyPMLA-co-PHBblockcopolymerusedasdrugcarrierswasfurtherstudiedinthissubject.Tryptanthrinseveredasadrugmodel,drugloadednanospherewaspreparedbydialysismethod.Entrapmentefficiencyis8.35±0.29%,drug-loadedrateis2.67±0.2%,andparticlesizeis242nm.TheresultsprovidedapreliminaryexperimentalbasisthatPMLA-co-PHBusedasPolymernanodrugdeliverysystem.ThenextstepinthisworkistodevelopPMLA-co-PHBasdrugcarriers,andexploittheapplicationofP（MLA-co-BL）intissueengineeringscaffolds.

Keyword:

benzyl β-malolactone;β-hydroxybutyrate;polymericmicelles;polymerdrugcarrier;degradation

前言

聚苹果酸（PMLA）是一类新型生物材料，具有生物可降解性、生物相容性、无免疫原性等特点。

在水溶液中PMLA主链上的酯键可发生水解或酶促降解，从而生成无毒无害的小分子苹果酸，并参与体内三羧酸循环而被生物体吸收[1]。

聚苹果酸结构规整，具有多个悬挂羧基，可以很好的被修饰或改性形成聚合物前药，应用于药物缓释和组织工程等领域[2]。

但大量羧基的存在使得PMLA亲水性强、降解过快[3]，用作生物高分子材料存在诸多缺陷，因此，对其进行疏水性修饰，在一定程度上降低其水溶性就显得非常有必要。

聚-β-羟基丁酸酯（PHB）是一种由原核微生物发酵产生的热塑性聚酯，具有良好生物相容性[4]，但存在易结晶、疏水性强和降解时间长[5]等缺点。

本课题采用PHB改性PMLA，以β-苹果酸苄基内酯（MLABe）和β-丁内酯（BL）开环共聚达到改性的目的。

通过化学方法共聚合成聚苹果酸衍生物很少有报道，除了与聚丙内酯，聚己内酯和聚丙交酯外[6]，目前仅Guillaume课题组用有机和金属有机催化剂引发β-苹果酸苄基内酯和β-丁内酯共聚，但金属引发剂和有机催化剂都存在一定的毒性残留[7]。

本实验以阴离子引发剂引发二者开环共聚。

在共聚之前，先优化了β-苹果酸苄基内酯单体的合成过程。

课题组前期的研究已表明引发剂苯甲酸四乙铵能够引发β-苹果酸苄基内酯单体开环聚合形成PMLA，但未证实对β-丁内酯有同样的引发作用，为β-苹果酸苄基内酯和β-丁内酯单体能够开环共聚提供实验基础。

以阴离子开环的机理引发MLABe和BL开环共聚得到一定分子量的疏水性共聚物P（MLABe-co-BL）和PMLABe-co-PHB，二者氢化苄基后分别得到两亲性的共聚物P（MLA-co-BL）和PMLA-co-PHB。

得到的共聚物是生物相容性和生物降解性均良好的两亲性聚羟基脂肪酸酯（PHAs），为其在药物载体、组织工程支架等后续生物医学研究方面奠定了实验基础。

1999年Cammas,S.等合成聚羟基脂肪酸酯，其在体内具有良好的生物相容性、水溶性和生物降解性，在氧气充分的情况下，通过三羧酸循环最终降解为水和二氧化碳等小分子无毒物质排出体外[2]，其在药物缓释体系