逆境下植物的生长情况.docx
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逆境下植物的生长情况
目录
中文摘要……………………………………………………………………………
英文摘要……………………………………………………………………………
1引言………………………………………………………………………………
2材料与仪器………………………………………………………………………
2.1材料与试剂……………………………………………………………………
2.2主要仪器………………………………………………………………………
3实验方法…………………………………………………………………………
3.1试剂配制……………………………………………………………………
3.2烟草叶片暗处理方法………………………………………………………
3.3脯氨酸、牛血清蛋白标准曲线测定………………………………………
3.4烟草叶片叶绿素提取与含量测定…………………………………………
3.5烟草叶片脯氨酸提取与含量测定…………………………………………
3.6烟草叶片丙二醛提取与含量测定…………………………………………
3.7烟草叶片可溶性蛋白提取与含量测定……………………………………
4结果与讨论………………………………………………………………………
4.1脯氨酸叶片与可溶性蛋白标准线…………………………………………
4.2烟草内叶绿素含量变化分析………………………………………………
4.3烟草叶片脯氨酸含量变化分析……………………………………………
4.4烟草叶片丙二醛含量变化分析……………………………………………
4.5烟草叶片内可溶性蛋白含量变化分析……………………………………
结论…………………………………………………………………………………
致谢…………………………………………………………………………………
参考文献……………………………………………………………………………
植物暗逆境下抗性生理研究
摘要：
本文通过对烟草植物进行不同时长的暗处理，然后与正常植株比较来研究植物对无光逆境的抗性反应。
通过测定烟草体内的叶绿素，脯氨酸，丙二醛以及可溶性蛋白的含量来研究暗逆境下植物体内的生理变化。
关键词：
烟草，暗处理，逆境，植物抗性，生理指标
TheResearchofPlantDarkstressresistance
Abstract：
Darkstressisaveryimportantfactorinplantgrowth.Basedonthetobaccoplantswereindifferenttimeoflongdarktreatment,andthencomparedwiththenormalplants,westudiedplantresistanceresponsestodarkstress.Bymeasuringchlorophyll,proline,MDA,andsolubleproteinintobaccotostudythephysiologicalchangesinplantswhichunderthedarkstress.
Keywords:
tobacco,darktreatment,stress,plantresistance,physiological.
1引言
植物体是一个开放的体系,生存于自然环境.自然环境并非恒定不变的,即使同一地区,一年四季也有冷热旱涝之分.对植物产生伤害的环境称为逆境,又称胁迫.如低温，弱光，干旱，缺氧等。
而植物对不良环境的适应性和抵抗力称为植物的抗性.植物为了适应不良环境,在形态结构和生理上都发生了相应的变化.
其实，作为生态系统的一分子,植物无时无刻不在同环境进行着物质、信息和能量的交流。
环境中与植物相关的因子多种多样,且处于动态变化之中,植物对每一个因子都有一定的耐受限度,一旦环境因子的变化超越了这一耐受限度,就形成了逆境。
因此,植物的生长过程中,逆境是不可避免的。
作为影响植物生长发育最重要的环境因子之一,光对植物最直接的作用是光合作用,提供同化力形成所需要的能量,活化参与光合作用的关键酶等。
光同时通过形态建成,控制植物的生长和发育。
不同的植物对光照的要求和反应都不相同，但对每种植物来说，都存在这影响其生长，限制其生存的最低光照强度。
生长在弱光或无光环境中的植物，会产生一系列的生态适应性反应，这些反应这些反应包括形态、结构、生理生化过程和基因表达各个方面,是植物对无光胁迫信号进行感受、转导和适应调节的结果。
这些变化既是影响植物生长的原因,也是植物对光环境产生适应性的结果。
本文便是对几个重点生理指标的变化做些研究。
烟草（tobaccoplants）是茄科一年生草本植物，烟草属大约有60多种，但真正用于制造卷烟和烟丝的，基本只有红花烟草，此外还有少部分用黄花烟草，其他品种很少用。
一般来说“烟草”在台湾称为作菸草，港澳称为作烟草。
辛，温。
有毒。
有消肿解毒，杀虫的功能。
用于疔疮肿毒，头癣，白癣，秃疮，毒蛇咬伤。
灭钉螺、蚊、蝇、老鼠。
2材料与仪器
2.1材料与试剂
2.1.1实验材料：
健康的烟草幼苗，
2.1.2主要试剂
丙酮,甲醇,醋酸酮,盐酸,氢氧化钾,石英砂,碳酸钙（粉）,无水硫酸钠,四氯化碳,乙醚、冰醋酸；甲苯；10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液；80﹪乙醇；95﹪酒精；石油醚；20﹪KOH甲醇溶液；30﹪醋酸；醋酸铜粉；氯化钠；酸性茚三酮；磺基水杨酸；脯氨酸；考马斯亮蓝；牛血清蛋白等。
2.2实验仪器
分光光度计；电子分析天平；高速冷冻离心机；恒温水浴锅；培养箱；电炉；剪刀；镊子；滤纸；移液管；研钵和研棒；试管；容量瓶；烧杯；离心管等。
3实验方法
3.1试剂配制
2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：
将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol·L－1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。
3％磺基水杨酸配配制：
3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：
精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml,加蒸馏水稀释定容至100ml,即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。
）提取液
50mmol·L－1Tris－HCl，pH7.8，含0.5mmol·L－1MgCl2，1mmol·L－1EDTA，1mmol·L－1二硫苏糖醇,缩写：
DTT。
考马斯亮蓝溶液配制：
称取考马斯亮蓝G－250100mg，加95％乙醇50ml，和85％磷酸100ml，然后定容至1000ml。
牛血清蛋白标准母液配制:
用0.15mol·L－1NaCl溶液配成100μg·ml－1牛血清蛋白标准液。
3.2烟草叶片暗处理和测定方法
取十盘生长状态良好的烟草幼苗。
先在相同培养条件（25℃，湿度适中，光照8小时/天）下培养三天，取烟草叶片测定初始状态叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白、丙二醛含量。
之后，取出五盘烟草幼苗用暗箱盖住，和其他五盘幼苗处于同一培养箱中，培养条件同上，注意每天适当浇水。
随后五天，每隔24小时分别取出一盘暗处理烟草幼苗和一盘正常环境烟草幼苗，各测定叶片内四种物质的含量。
最后分析其变化规律。
因实验材料不足，实验中未作重复，故数据分析时对个别数据会有所取舍。
3.3脯氨酸、牛血清蛋白标准曲线测定
实验通过测定四种物质在不同波长下的吸光度来计算烟草叶片中的物质含量，故事先须测定实验条件下物质的标准曲线。
3.3.1脯氨酸标准曲线测定
（1）取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。
表3.1脯氨酸标准液配制
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
10μg·ml-1脯氨酸标准液（ml）
蒸馏水（ml）
冰醋酸（ml）
2.5﹪酸性茚三酮（ml）
0
2
2
2
0.2
1.8
2
2
0.4
1.6
2
2
0.6
1.4
2
2
0.8
1.2
2
2
1.0
1.0
2
2
每管脯氨酸含量（μg）
0
2
4
6
8
10
加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。
取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
（2）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。
（3）标准曲线的绘制
以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3.3.2牛血清蛋白标准曲线的制作
（1）取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～100μg的牛血清蛋白标准液。
表3.2牛血清蛋白标准液配制
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
100μg·ml－1牛血清蛋白标准液（ml）
Tris缓冲液（ml）
考马斯亮蓝溶液（ml）
0
1
5
0.2
0.8
5
0.4
0.6
5
0.6
0.4
5
0.8
0.2
5
1.0
0
5
每管牛血清蛋白含量（μg）
0
20
40
60
80
100
加入表中试剂后，摇匀，以0号管为空白对照，在595nm波长处测定其吸光度（A）值。
（2）标准曲线绘制
以牛血清蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3.4烟草叶片叶绿素提取与含量测定
3.4.1叶绿素的提取
称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml容量瓶中，然后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。
3.4.2测定
取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白对照，在652nm波长下读取吸光度（A）值。
3.4.3计算
将测得的吸光度A652值代入公式
（1）,即可求得提取液中叶绿素浓度。
所得结果再代入公式
（2），即可得出样品中叶绿素含量（mg·g－1Fw）。
A652
C（mg·ml－1）=————
（1）
34.5
注：
C—叶绿素（a和b）的总浓度（mg·ml－1）。
A652—表示在652nm波长下测得叶绿素提取液的吸光度。
34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光径为1cm,样品浓度为1g·L－1时的吸光度）。
C（mg·ml－1）×提取液总量（ml）
叶绿素含量（mg·g－1）=————————————————
（2）
样品鲜重（g）
3.5烟草叶片脯氨酸提取与含量测定
3.5.1脯氨酸的提取
称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。
3.5.2测定
吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。
冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min。
用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。
3.5.3计算结果
从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：
X×提取液总量（ml）
脯氨酸含量（μg·g－1）＝———————————————————
样品鲜重（g）×测定时提取液用量（ml）
公式中：
X－从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）
3.6烟草叶片丙二醛提取与含量测定
3.6.1丙二醛的提取
称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。
3.6.2显色反应及测定
取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml0.6％硫代巴比妥酸溶液。
摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。
取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。
3.6.3丙二醛含量计算：
由于蔗糖－TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4×10－3，MDA－TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4×10－3和155×10－3。
532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。
按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。
方程组：
A450=（85.4×10－3）·C糖
（A532－A600）=（155×10－3）·CMDA+（7.4×10－3）·C糖
解得：
A450
C糖=——————=11.71A450（mmol·L－1）
85.4×10－3
CMDA=6.45（A532－A600）－0.56A450（μmol·L－1）
公式中：
A450—在450nm波长下测得的吸光度值
A532—在532nm波长下测得的吸光度值
A600—在600nm波长下测得的吸光度值
﹡—1.55×105为摩尔比吸收系数
C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。
按下式计算提取液中MDA浓度
反应液体积（ml）
CMDA×—————————
1000
提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）=———————————————
测定时提取液用量（ml）
按下式计算样品中MDA含量
提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）×提取液总量（ml）
MDA含量（μmol·g－1）=————————————————————————
植物组织鲜重（g）
3.7烟草叶片可溶性蛋白提取与含量测定
3.7.1蛋白质的提取
称取叶片0.3～0.5g，剪碎于冷冻过的研钵中加提取液3ml，加少量石英砂，在冰浴中快速研磨成匀浆，匀浆倒入离心管中，再用5ml提取液（分两次）将研钵中匀浆洗入离心管，然后在10000r/min，4℃条件下离心20min，上清液即为可溶性蛋白质提取液。
将离心所得的沉淀加3ml1mol·L－1NaOH溶液，在90℃恒温水浴中加热20min后，在4000r/min，4℃条件下离心10min，上清液即为非可溶性蛋白质提取液。
3.7.2测定
上述两种上清液各取0.1ml分别放入2支试管中，每管再加Tris缓冲液0.9ml，空白对照管加Tris缓冲液1ml，然后各管分别再加入考马斯亮蓝染色液5ml，摇匀，在595nm波长处测定吸光度（A）值。
3,7.3结果计算
根据所测得的样品液吸光度值，从标准曲线查出蛋白质含量，按下公式计算可溶性蛋白质和非可溶性蛋白质含量。
标准曲线上查得蛋白质含量（μg）×提取液量（ml）
可溶性蛋白质的含量＝————————————————————————
（μg·g－1）样品鲜重（g）×测定时提取液用量（ml）
标准曲线上查得蛋白质含量（μg）×提取液量（ml）
非可溶性蛋白质含量＝———————————————————————
（μg·g－1）样品鲜重（g）×测定时提取液用量（ml）
4结果与讨论
4.1脯氨酸与牛血清蛋白标准线
4.1.1脯氨酸标准曲线
表4.1脯氨酸标曲测定数据
试管号
0
1
2
3
4
5
吸光度
0.014
0.043
0.16
0.331
0.531
0.603
图4.1脯氨酸标准曲线
根据实验方案，在1-5号管中的脯氨酸含量按1/3μg·ml－1随管号递增，初始1号管脯氨酸含量为1/3μg·ml－1。
上图的细直线即为脯氨酸标准曲线。
4.1.2牛血清蛋白标准曲线
表4.2牛血清蛋白标曲测定数据
试管号
0
1
2
3
4
5
吸光度
0
0.12
0.216
0.284
0.325
0.403
0号管为对照管，1-5号试管中每管蛋白含量以10μg/3ml的幅度递增，初始1号管内蛋白含量为10μg/3ml。
图4.2牛血清蛋白标准曲线
4.2烟草内叶绿素含量变化分析
因实验主要研究叶绿素含量的变化规律，且每组吸光度在相同条件下测得，故叶绿素含量变化曲线直接取用吸光度值所绘（后面同此法处理）。
实验所得叶绿素含量每日变化数据如下表：
表4.3烟草叶绿算含量变化对照（吸光度）
时间/天
1
2
3
4
5
6
7
正常
0.5377
0.5587
0.5377
0.5667
0.5463
0.5561
0.5653
暗处理
0.3770
0.3330
0.3043
0.2673
0.2412
0.2251
由上表可得正常环境（25℃,8小时光照，湿度适中）下烟草幼苗叶片中叶绿素含量平均值约为：
1.948mg/g。
根据上表所绘叶绿素变化曲线如下：
图4.3叶绿素含量变化曲线
由上图，我们可以得知，在暗处理一日后烟草幼苗的叶绿素含量已有明显降，说明光照对植物叶片叶绿素含量影响很大；随着暗处理日数的持续增加，叶绿素含量也不断降低，喻示这在持续无光的条件下，植株正在逐渐衰老。
4.3烟草叶片脯氨酸含量变化分析
植物体内的脯氨酸含量可以在一定程度上反映植物的抗逆性，本实验是利用磺基水杨酸以及酸性茚三酮对脯氨酸的特定反映，在通过甲苯萃取的方式来测定脯氨酸含量的。
实验数据如下：
表4.4脯氨酸含量变化对照（吸光度）
时间/天
1
2
3
4
5
6
7
正常
0.3300
0.3133
0.3497
0.3480
0.3443
0.3415
0.3397
暗处理
0.6763
0.6857
0.7383
0.7933
0.7992
0.8123
根据数据，可以发现处于正常环境下的烟草幼苗中，脯氨酸含量的保持相对稳定。
通过计算可得在正常环境下叶片中脯氨酸含量大约为：
20μg/g。
由上表可绘得脯氨酸变化曲线：
图4.4脯氨酸含量变化曲线
据图所示，烟草幼苗叶片中脯氨酸含量在暗处理后有明显上升，且随着暗处理时间的延长，其含量不减反增，说明植物对光环境的改变具有抗逆性，并且在这种抗性是在一定程度上是可持续的。
4.4烟草叶片丙二醛含量变化分析
丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。
它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。
本实验通过对丙二醛含量的测定来研究暗处理条件下植物的损伤情况。
所用方法是利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，最大的吸收波长在532nm。
但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。
所以，实验通过在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，来计算出丙二醛含量。
所得实验数据如下：
表4.5丙二醛含量测定D450数据
时间/天
1
2
3
4
5
6
7
正常
0.3000
0.2660
0.2833
0.2740
0.2640
0.2714
0.2720
暗处理
0.3413
0.2847
0.3540
0.4370
0.4512
0.4617
此表是用于计算可溶性糖的含量。
表4.6丙二醛含量测定D532数据
时间/天
1
2
3
4
5
6
7
正常
0.1043
0.1150
0.0977
0.0810
0.0897
0.0956
0.1026
暗处理
0.2133
0.2597
0.2820
0.3353
0.3152
0.3421
丙二醛的最大吸收波长即532nm.
表4.7丙二醛含量测定D600数据
时间/天
1
2
3
4
5
6
7
正常
0.0253
0.0273
0.0283
0.0273
0.0290
0.0287
0.0279
暗处理
0.0383
0.0377
0.0570
0.0527
0.0591
0.0635
由上三表数据可计算得正常情况与暗处理下丙二醛含量变化表：
表4.8丙二醛含量变化对照
时间/天
1
2
3
4
5
6
7
正常/μmol·g－1
0.010
0.012
0.012
0.006
0.007
0.008
0.010
暗处理/μmol·g－1
0.028
0.038
0.037
0.047
0.042
0.046
根据此表，可以绘得叶片中丙二醛正常状态与暗处理条件下的变化曲线：
图4.5丙二醛含量变化曲线
由此曲线，可以看出，暗逆境下的丙二醛含量明显高于正常条件下，因实验条件只因，在误差范围内可以观察到随着时间推移，丙二醛含量呈现波动性增长。
说明随着暗处理时间延长，植物组织损伤也越加厉害。
4.5烟草叶片内可溶性蛋白含量变化分析
植物体内的可溶性蛋白含量也是反映植物生长衰老的重要生理指标。
实验测得烟草叶片可溶性蛋白含量如下：
表4.9可溶性蛋白含量变化对照（吸光度）
时间/天
1
2
3
4
5
6
7
正常
0.2293
0.2427
0.2563
0.2507
0.2560
0.2514
0.2517
暗处理
0.1480
0.1173
0.0760
0.0623
0.0529
0.0497
根据实验数据，得到烟草幼苗叶片内可溶性蛋白含量规律如下：
图4.6可溶性蛋白含量变化曲线
根据数据和图表可以发现，暗逆境下植物的可溶性蛋白持续降低，并随着处理时间的延长，降低至相当低的值。
由此可见，长时间的暗环境严重影响了植物的生长和生命。
结论
光照是植物体生长生存所必须的环境因子之一，在对烟草幼苗进行暗处理过程中我们发现，烟草幼苗体内的叶绿素含量和可溶性蛋白含量相比正常条件明显减少。
并且，植物体在黑暗环境的时间越久，两种物质的含量越低。
证实无光环境下对植物体的组织和生理损
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