平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究.docx

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平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究

平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究

【摘要】目的为开发利用平白术的药用价值提供理论依据，分别提取分离平白术中有效成分多糖和氨基酸，并分别测定平白术多糖和氨基酸的含量。

方法采用L9实验因素设计实验，苯酚-硫酸法测定白术多糖的含量。

以茚三酮为衍生试剂，采用柱后衍生法测定平白术中氨基酸含量。

结果平白术多糖的含量为%。

平白术中至少含有17种氨基酸，总氨基酸含量为mg·g-1。

结论方法简单、有效、快速、准确、灵敏，适合于分析测定白术中多糖和氨基酸的含量。

【关键词】平白术；多糖；氨基酸

　　Abstract:

ObjectiveToextractpolysaccharideandaminoacid　anddeterminetheircontentsinordertoofferthebasisforusingAtractylodesmacrocephalaKoidzfromPingjiang.MethodsUsingL9orthogonaltest，PhenolsulfuricmethodwasusedtotestpolysaccharidecontentinAtractylodesmacrocephalaandtoassayaminoacidusingmethodofNinhydrinpost-columnderivation.ResultsTheanalysisofAtractylodesmacrocephalaKoidzshowedthatthecontentofpolysaccharidewas%andtherewereatleast17kindsofaminoacids，thetotalcontentwas　mg·establishedmethodisquitesuitableforidentificationandquantificationofpolysaccharideandaminoacidsinAtractylodesmacrocephala　issimple，effective，rapid，accurateandsensitive.

　　Keywords:

AtractylodesmacrocephalaKoidz；Polysaccharide;Aminoacid

白术是传统中药，《中国药典》收载的白术为菊科植物AtractylodesmacrocephalaKoidz的干燥根茎，白术具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎之效［1］。

《中国药典》2005年版第一部记载含白术的处方有91个。

近几年以来，中国对白术的需求量大增，居全国大宗常用中药材之首。

由于其含有白术多糖、挥发油、氨基酸等多种有效成分而倍受药物研究工作者的关注，使白术的临床应用日趋广泛［2］，其研究也更为深入、更为多元化。

然而，迄今为止，对白术中营养成分氨基酸研究甚少。

为了开发利用白术的药用价值，本文对湖南平江产白术——平白术进行研究，提取平白术多糖、氨基酸，采用正交实验选择多糖显色条件，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

以茚三酮作衍生试剂，采用柱后衍生法测定氨基酸含量。

　　1材料

　　仪器

　　UV2150型分光广度计，日立L8800全自动氨基酸自动分析仪

　　试剂无水乙醇、硫酸锌、氢氧化钡、硫酸、苯酚、茚三酮、柠檬酸。

三钠、醋酸钠,平江白术、果糖标准品、氨基酸标准品。

　　2方法与结果

　　显色条件的考察

　　苯酚浓度对显色单因素的影响吸取标准溶液1ml于10ml具塞试管中，精密加入1ml不同浓度的苯酚和5ml浓硫酸，混匀，放置5min。

移入25℃的水浴中保温20min。

冷却。

以蒸馏水1ml加相应的试剂作空白，测定吸收度。

见图1，表1。

表1苯酚浓度的考察

实验结果表明,苯酚浓度在4%～7%范围内所得吸收值相近,苯酚浓度为5%时所得吸收值较大,故选择苯酚浓度为5%。

　　苯酚-硫酸法正交实验设计［3］实验因素水平表设计：

实验选择苯酚用量、浓硫酸用量、水浴温度和水浴中的放置时间4个因素作为考察对象，根据初步实验，每个因素确定3个水平，采用L9正交表进行实验。

以吸收度为评价指标。

对结果进行统计学处理，得方差分析见表4。

表2实验因素水平表3L9正交实验结果表4方差分析

经方差分析可知，苯酚用量、浓硫酸用量、水浴温度及水浴放置时间对吸收度影响不显着，但综合比较，本实验选择苯酚-硫酸法最佳显色条件为A3B1C3D2即苯酚ml，浓硫酸4ml，水浴温度25℃，水浴放置时间30min。

　　测定波长的选择精密称取一定量多糖样品置小烧杯中，加水溶解，定量转移至100ml量瓶中，加水至刻度，混匀。

吸取该样品2ml于试管中，加5%苯酚水溶液ml混匀，迅速加入4ml浓硫酸，振摇10min，在25℃水浴保温放置30min，取出冷却，以苯酚-硫酸溶液为空白，于400～800nm范围扫描，选择最大吸收波长nm为测定波长。

　　标准曲线精密称取105℃干燥至恒重的标准果糖mg，加水溶解至250ml，配成μg/ml的标准储备液。

取10ml具塞试管，分别加上述标准液，，，，，，，ml，加水稀释至1ml，摇匀，每个试管各加5%苯酚水溶液ml混匀，再迅速加入4ml浓硫酸，振摇10min，在25℃水浴保温放置30min。

以水作空白在nm处测定各标准液的吸收度，得回归方程A=3C+6。

其在1～μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。

　　换算因素测定精密称取干燥的平白术多糖20mg，用蒸馏水溶解后定容至100ml，作为多糖储备液。

精确量取多糖储备液ml，加水至ml，按测定标准曲线同样的方法测其吸光度值。

按下式计算换算因素：

f=W/CD，试中：

W为多糖质量，C为多糖液中果糖的浓度，D为多糖的稀释因素，测得f=。

　　平白术多糖、氨基酸的提取

　　平白术多糖的提取［4］精密称取白术粗粉50g置于1000ml的容量瓶中，加6倍量70%的乙醇回流2h。

过滤，取滤渣加8倍蒸馏水回流2h，趁热过滤。

在滤渣中加6倍水回流1h，趁热过滤。

再在滤渣中加3倍量水回流1h，趁热过滤，合并3次滤液，浓缩至100ml，加无水乙醇至乙醇浓度达85%，再用75%乙醇冲洗，离心，反复6次，去溶液取沉淀。

加水溶解，用5%ZnSO44ml和饱和Ba2溶液16ml振摇，离心去蛋白，反复10次［5］。

将所得溶液置于冰箱中过夜，次日取出溶解，在8000r/min离心15min，反复4次。

用氯仿-正丁醇与溶液按5∶1的比例混合搅拌15min，离心，反复3次，得澄清液即白术多糖溶液。

加水至100ml冷藏备用。

　　平白术氨基酸的提取称取平白术粉末40g投入装有搅拌器、温度计、回流冷凝器的三颈烧瓶中，加入6mol/L的盐酸100ml，加热水解24h，反应温度保持在（110±1）℃左右。

滤渣用少量稀盐酸浸泡，过滤，重复两次，收集3次滤液得水解液，加热7h赶盐酸。

在滤液中加入g活性碳且维持滤液在（80～90）℃，磁力搅拌脱色30min，重复2次，减压浓缩得到50ml橙红色的溶液，作为储备液。

于4℃的冰箱中保存。

　　平白术多糖和氨基酸含量的测定

　　样品多糖含量的测定平白术多糖提取液稀释至适当倍数后，精密吸取ml，按照标准曲线的方法测定吸光度，计算平白术多糖的含量。

按下式计算多糖含量：

多糖含量=CDfW×100%，式中

W为多糖质量，C为多糖液中果糖的浓度，D为多糖的稀释因素，f为换算因素。

测得多糖的含量为%。

　　回收率实验在样品液中精密加入不同浓度的果糖标准液，按项下操作，并适当稀释，以样品液为空白，测定吸收度，计算回收率。

平均回收率为%，RSD=%。

结果如表5。

表5回收率实验结果

　　稳定性实验取样品在8h内测定吸收度，1次/h。

样品在4h内稳定，RSD=%。

　　平白术氨基酸的测定条件［6］

实验条件：

L-8800型全自动氨基酸分析仪，钠型阳离子交换柱，分析时间35min，流动相柠檬酸三钠缓冲液，四元梯度洗脱，缓冲液流速ml/min，茚三酮流速ml/min，缓冲液泵压力8～Pa，茚三酮泵压力～kPa，柱温50℃，氮气压力20kPa。

柱的衍生条件：

反应液A：

390g茚三酮/L丙二醇甲醚，反应液B：

醋酸钠/醋酸：

丙二醇甲醚；供试品和对照品溶液进样量均为20μl。

　　平白术氨基酸含量的测定按上述色谱条件，使用日立L-8800AAA分析仪进行样品测定。

分离得到的氨基酸谱图如图2～3。

样品中氨基酸的含量结果见表6。

表6平白术中氨基酸含量测定结果

　　3讨论

　　本实验采用75%乙醇提取除去平白术所含单糖、低聚糖等干扰性成分后，再用水提醇沉法制得白术多糖。

在采用Sevag法去蛋白至少重复6～7次，才能基本上除去蛋白，且多糖损失率也较大。

本实验采用硫酸锌与饱和氢氧化钡溶液脱蛋白后，再加冷冻-Sevag法除蛋白，去蛋白比较彻底。

在进行乙醇沉淀时，85%的乙醇浓度已能将多糖基本沉淀出来，增加乙醇浓度对多糖的得率影响并不显着。

多糖采用真空干燥法，可避免加热干燥而出现多糖变黏稠或碳化而结块现象。

　　氨基酸是构成生物体蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动密切相关，尤其与人类健康有着紧密的关系。

本分析结果表明，平白术氨基酸至少含有17种氨基酸，总含量为mg·g-1。

必需氨基酸和半必需氨基酸在人体中具有重要的作用，缺一不可，否则可引起生理功能异常，导致疾病。

总氨基酸中含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等7种人体必需氨基酸，并含胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸等4种半必需氨基酸。

必需氨基酸和半必需氨基酸在总氨基酸中分别占%，%。

在水解氨基酸时，温度应严格控制在℃，水解24h，才能使蛋白质完全水解。

　　本研究为白术中有效成分多糖及氨基酸的提取分析、质量评价提供了一个新的定量标准，为开发利用平江白术提供了理论依据。

【参考文献】

　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：

化学工业出版社，2000：

77.

　　［2］刘思贞，邵玉芹，祝希娴.白术药理研究进展［J］.时珍国医国药，1999，10：

634.

　　［3］张维杰.复合多糖生化研究技术［M］.上海：

上海科学出版社，1987：

6.

　　［4］张立，马琼，何永利，等.灵芝、香菇、黄芪、枸杞提取物中多糖的含量测定［J］.中草药，2004，35：

167.

　　［5］陈柳蓉，邵青，陆蕴.白术及炮制品的多糖含量测定［J］.中草药，1997，28：

214.

　　［6］杨文军，李德发，王若军，等.离子交换色谱OPA柱后衍生法测定饲料中胱氨酸和蛋氨酸的含量［J］.中国畜牧杂志，2000，36：

26.