微柱凝胶卡标准操作程序.docx
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微柱凝胶卡标准操作程序
文件类别：
医疗管理
编码：
XC-DJPS-YLGL-XK-001-01
初审人：
审核人：
批准人：
初审日期：
2014年1月20日
批准日期：
2014年10月20日
执行日期：
2014年10月20日
回顾日期：
2014年10月20日
微柱凝胶卡标准操作程序
（SOP）
襄城县人民医院血库
目录
1、ABO.RhD血型抗原检测卡标准操作程序（SOP）.......................3
2、ABO、RhD血型检测卡标准操作程序（SOP）...............................5
3、不规则抗体筛检卡标准操作程序（SOP）.............................................8
4、抗人球蛋白交叉配血卡标准操作程序（SOP）............................10
5、新生儿溶血病检测卡标准操作程序（SOP）....................................11
6、新生儿溶血病母体IgG抗体效价检测卡标准操作程序（SOP）.....................................................................................................13
7、新生儿溶血病母体IgG抗体效价检测卡标准操作程序（SOP）.....................................................................................................15
8、微柱凝胶检测卡在实验室操作的注意事项..................................17
一、ABO.RhD血型抗原检测卡标准操作程序（SOP）
一、准备工作
1、微柱凝胶试剂卡的准备：
观察外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡放置室温
（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。
2、检测标本的准备：
红细胞悬液的制备：
取被检者压积红细胞10微升，加入1毫升红细胞稀释液，此浓度大约为0.8%－1%。
外观应为均匀淡红色，无絮状物和血块。
二、操作步骤
1．将准备好的微柱凝胶试剂卡做好标记。
2．将配制好的被检者红细胞悬液分别加入第1至第3管或第第4至第6管中，每管50微升。
3．即刻使用专用离心机离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟），取出肉眼判定结果。
血型判定见表：
血型
抗A
抗B
抗D
D
阳
性
A
+
—
+
B
—
+
+
O
—
—
+
AB
+
+
+
D
阴
性
A
+
—
—
B
—
+
—
O
—
—
—
AB
+
+
—
三、注意事项
1、检测标本必须为抗凝血。
2、红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。
尽可
能应用当日采集的新鲜血做本试验。
3、如在微柱凝胶管中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体
阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。
4、若结果为±或1＋需进一步分析，可能为亚型或弱化抗原。
5、红细胞悬液的浓度控制在0.8％－1％之间，否则可能出现漏检或混合凝集。
6、每日实验前，先取出微柱凝胶卡放置一段时间至室温，
以防冷凝集。
7、试剂卡应放在18-25℃储存，如若长期放在4℃冰箱，建议
每1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。
四、参考文献：
1、《输血技术学》
2、《全国临床检验操作规程》第三版
二、ABO、RhD血型检测卡标准操作程序（SOP）
一、准备工作
（一）微柱凝胶试剂卡的准备：
观察外观，如有干胶、杂质、气
泡不可使用，之后将卡放置室温（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。
（二）检测标本的准备：
1．红细胞悬液的制备：
取被检者压积红细胞10微升，加入1毫
升红细胞稀释液，外观应为均匀淡红色，无絮状物和血块。
2．血清标本的制备：
采集被检对象静脉血，放入兔脑粉或其它
促凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后离心，2000r/min,10分钟，取上清（该上清不得有絮状物或沉淀）。
二、操作步骤
1.将准备好的ABO.RhD血型定型试剂卡做好标记
2.将待检者0.8%－1％红细胞悬液分别加入第1至第4管中，每管50ul
3.将待检者血清分别加入第5和第6管，每管50ul
4.将已知的A型和B型红细胞0.8%-1%浓度悬液或ABO血型反定型红细胞试剂，每管50ul分别加入第5和第6管
5.即刻使用专用离心机离心，900rpm2分钟，1500rpm3分钟，取出肉眼判定结果。
结果判定：
阳性结果：
红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应。
阴性结果：
被检红细胞抗原无相应的抗体结合，不出现特异性抗原抗体复合物，红细胞沉于微柱凝胶的尖底部。
血型判定：
血型
抗A
抗B
抗D
阴性对照
A细胞
B细胞
D
阳
性
A
+
—
+
—
—
+
B
—
+
+
—
+
—
O
—
—
+
—
+
+
AB
+
+
+
—
—
—
D
阴
性
A
+
—
—
—
—
+
B
—
+
—
—
+
—
O
—
—
—
—
+
+
AB
+
+
—
—
—
—
三、注意事项
1.检测标本必须为抗凝血。
2.红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。
尽可能应用当日采集的新鲜血做本试验。
3.血清标本：
血清标本必须充分去纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍阴性红细胞沉淀，呈假阳性反应。
4.如在微柱凝胶管中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。
5.若结果为±或1＋需进一步分析，可能为亚型或弱化抗原。
6.红细胞悬液的浓度控制在0.8％--1%之间，否则可能出现漏检或混合凝集。
7.每日实验前，先取出微柱凝胶卡放置一段时间至室温，以防冷凝集。
8试剂卡应放在18-25℃储存，如若长期放在4℃冰箱，建议每1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。
四、参考文献：
1、《输血技术学》
2、《临床检验操作规范》第三版
三、不规则抗体筛检卡标准操作程序（SOP）
一、准备工作
（一）微柱凝胶试剂卡的准备：
观察外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡放置室温（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。
（二）检测标本的准备：
1．红细胞悬液的制备：
取被检者压积红细胞10微升，加入1毫
升红细胞稀释液，外观应为均匀淡红色，无絮状物和血块。
2．血清标本的制备：
采集被检对象静脉血，放入兔脑粉或其它
促凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后离心，2000r/min,10分钟，取上清（该上清不得有絮状物或沉淀）。
二、操作步骤
1、将准备好的不规则抗体筛检卡做好标记。
2、将配好的筛检细胞或谱细胞悬液加入标好的微管中，各一滴（或50μl）。
3、分别立即加入被检者血清1滴（或50μl）。
4、加样后的试剂卡，置37℃中孵育15分钟。
5、使用专用离心机离心5分钟，（900rpm2分钟，1500rpm3
分钟），取出肉眼观察结果。
结果判定：
根据所提供的筛检红细胞或谱细胞的反映格局来判定结果
例：
按Ⅰ（-）；Ⅱ（4+）；
（-）的实验结果及提供如下的筛检红细胞反应格局来分析
筛检细胞反应格局
D
C
E
c
e
Jka
JKb
M
N
S
s
Fya
Fyb
Dia
K
k
Lea
Leb
P1
Ⅰ
＋
＋
－
－
＋
－
－
－
＋
－
＋
＋
－
－
－
＋
－
＋
－
Ⅱ
＋
－
＋
＋
－
－
－
－
＋
－
＋
＋
－
－
－
＋
－
＋
＋
Ⅲ
＋
＋
－
＋
＋
－
－
＋
＋
－
＋
＋
－
－
－
＋
－
＋
－
阴性结果用排除法；阳性结果用可能包含法
以前五种抗原为例：
Ⅰ（-）可排除D、C、e；
Ⅱ（4+）判断可能含有D、E、c；
（-）可排除D、C、c、e；
综上，可认为：
此样品血清中可能含有－E
三、注意事项
1、应用直接抗人球蛋白微柱凝胶免疫试验检测病人红细胞
时，一定要用适量EDTA的试管采血液标本，该标本不能放入4℃-10℃冰箱保存，以避免红细胞在病人体外致敏所致假阳性反应。
2、红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。
尽可能应用当日采集的新鲜血做本试验。
3、血清标本：
血清标本必须充分去纤维蛋白，否则标本中纤维
蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍阴性红细胞沉淀，呈假阳性反应。
4、如在微柱凝胶管中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗
体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论其原因。
5、每日试验前，先取出微柱凝胶卡放置至室温。
6、筛检细胞或谱细胞悬液的浓度严格控制在0.8%－1％之间。
7、试剂卡应放在18-25℃储存，如若长期放在4℃冰箱，建议
每1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。
四、参考文献：
1、《输血技术学》
2、《全国临床检验操作规程》第三版
四、抗人球蛋白交叉配血卡标准操作程序（SOP）
一、准备工作
（一）微柱凝胶试剂卡的准备：
观察外观，如有干胶、杂质、气
泡不可使用，之后将卡放置室温（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。
（二）检测标本的准备：
1．红细胞悬液的制备：
将受血者与献血者的红细胞和血浆分离，各取其压积红细胞10微升，分别加入含1毫升红细胞稀释液的两个试管中，外观应为均匀淡红色，无絮状物和血块。
2．血清标本的制备：
采集被检对象静脉血，放入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后离心，2000r/min,10分钟，取上清（该上清不得有絮状物或沉淀）。
二、操作步骤
1、将准备好的抗人球交叉配血卡做好标记。
2、将受血者血清1滴（或50μl）与献血者红细胞1滴（或50μl）加入主侧管中。
3、将受血者红细胞1滴（或50μl）与献血者血清1滴（或50μl）加入次侧管中。
4、加样后的试剂卡，置37℃中孵育15分钟。
5、使用专用离心机离心5分钟，900rpm2分钟，1500rpm3分钟，取出肉眼观察结果。
三、结果判定：
1、阴性结果：
红细胞完全沉降于凝胶管底部，表明受血者与献血者血型相合。
2、阳性结果：
红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中，表明受血者与献血者血型不相合。
四、注意事项
1、应用直接抗人球蛋白微柱凝胶免疫试验检测病人红细胞时，一定要用适量EDTA的试管采血液标本，该标本不能放入4℃-10℃冰箱保存，以避免红细胞在病人体外致敏所致假阳性反应。
2、红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。
尽可能应用当日采集的新鲜血做本试验。
3、血清标本：
血清标本必须充分去纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍阴性红细胞沉淀，呈假阳性反应。
4、如在微柱凝胶管中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论其原因。
5、每日试验前，先取出微柱凝胶卡放置至室温。
6、红细胞悬液的浓度控制在0.8%－1％之间。
7、试剂卡应放在18-25℃储存，如若长期放在4℃冰箱，建议每1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。
五、新生儿溶血病检测卡标准操作程序（SOP）
一、准备工作
（一）微柱凝胶试剂卡的准备：
观察外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡放置室温（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。
（二）试剂的制备：
6%牛血清白蛋白（盐水稀释）
（三）标本采集：
采集被检对象静脉血，将该同一人血液分别制备成红细胞标本和血清标本。
（四）红细胞标本的制备：
用红细胞稀释液配制红细胞悬液，红细胞最终浓度为0.8%－1％。
（五）血清标本的制备：
将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促
凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后离心，2000rpm，10分钟，取上清。
该上清不得有絮状物或沉淀。
（六）放散试验：
1、充分洗涤红细胞至少三次，取同体积洗涤
后的压积血和6%牛血清白蛋白（或生理盐水）混匀，置于56℃孵育10分钟，期间不断摇动，离心1000rpm，2－3分钟，取上清。
即放散液。
2、充分洗涤红细胞至少三次，用博讯公司生产的酸性放散试剂
盒做室温放散。
参见酸性放散试剂盒使用说明书。
二、实验步骤
1、直接抗人球蛋白实验，取新生儿的红细胞0.8%－1％悬液50ul分别加入卡1中的1或其它孔中。
－6孔中。
2、使用专用离心机离心5分钟，900rpm2分钟，1500rpm3分钟。
3、取出，判读结果。
4、第二卡游离试验1－3孔分别加入50ul新生儿血清，放散试验4－6孔分别加入50ul新生儿红细胞放散液。
5、将A型红细胞悬液50ul分别加入1号、4号；将B型红细胞
悬液50ul分别加入2号、5号；将O型红细胞悬液50ul分别加入3号6号孔中。
6、37℃孵育15分钟。
7、取出，使用专用离心机离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟），取出，判读结果。
结果判定
阳性结果：
红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中。
表明被检者血
清中含有对应其抗原的抗体或血细胞被致敏。
阴性结果：
红细胞完全沉降到凝胶底部，在凝胶管底部形成红细
胞扣。
表明血清中无相应抗原免疫的抗体或血细胞没有被致敏。
反应强度：
特异性红细胞抗原抗体复合物位于胶表面，为强阳性
反应；复合物在胶中为弱阳性反应；愈靠近胶底部颗粒愈
小，反应愈弱（2+或1+）。
三、注意事项
1、红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。
尽可
能应用当日采集的新鲜血做本实验。
2、血清标本：
血清标本必须充分去除纤维蛋白，否则标本中纤维
蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍红细胞沉淀，呈假阳性反应。
3、如在微柱凝胶中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳
性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员多报告并讨论。
4、父亲红细胞标本也可用与其同型的A型或B型红细胞代替。
5．洗出尽量多红细胞进行放散；注意放散的温度不可超过56℃，
以防溶血；天冷时放散液注意保温；尽可能多得放散液吸出；注意出去放散液中残留的红细胞；放散前红细胞要充分洗涤，至少三次。
6、每日试验前，先取出微柱凝胶卡放置至室温。
7、红细胞悬液的浓度控制在0.8%－1％之间。
8、试剂卡应放在18-25℃储存，如若长期放在4℃冰箱，建议
每1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。
四、参考文献：
1、《输血技术学》
2、《全国临床检验操作规程》第三版
六、新生儿溶血病母体IgG抗体效价检测卡标准
操作程序（SOP）
一、准备工作
（一）微柱凝胶试剂卡的准备：
观察外观，如有干胶、杂质、气
泡不可使用，之后将卡放置室温（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。
（二）试剂配制：
用100mlpH7.4的PBS溶解0.154g二硫苏糖醇，
即0.01MDTT；或吸取2－Me14.7μl,加pH7.4磷酸盐缓冲液至1ml为0.2M2-Me应用液。
密闭，避光，保存于4℃冰箱内，可使用1个月。
（三）标本采集：
检查用的血样为孕妇静脉血或新生儿脐带血
5ml,一般为不抗凝血，无需空腹。
同时，提供3-4ml胎儿父亲的抗凝血，对判断母子血型的配合与否是十分有益的。
（四）红细胞标本的制备：
用红细胞稀释液配制红细胞悬液，红细胞最终浓度为0.8%－1％。
（五）血清标本的制备：
将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促
凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后离心，2000rpm，10分钟，取上清。
该上清不得有絮状物或沉淀。
二、操作步骤
1、在试管加入50ul母体血清和350ul生理盐水（为1：
8稀释）。
2、取6只干净试管，做好标记；在第1号管中加入等体积（比
如200ul）的母体稀释过的血清和2-Me应用液或DTT应用液，置37℃水浴，并密封口，45-60分钟，以充分破坏血清中的IgM类抗体，混匀（为1：
16稀释）；第2-6号管中依次加100ul的生理盐水。
取1号管的混合液100ul，加入2号管，依次做倍比稀释。
结果为：
2号1：
32稀释，3号1：
64稀释，4号1：
128稀释，5号1：
256稀释，6号1：
512稀释。
3、将卡标记好，依次将倍比稀释50ul血清分别加入标记卡中。
（可以从3号1：
64开始）
4、在所有孔中加入50ul父亲的0.8%-1%红细胞悬液（或与父亲
同型的0.8%-1%红细胞悬液），（测定孕妇ABO血型系统IgG血型抗体效价）；或在所有孔中加入50ul标准O型0.8%-1%红细胞悬液，（测定孕妇ABO血型系统以外IgG血型抗体效价）。
5、加样后的试剂卡，置37℃中孵育15分钟。
6、用专用离心机离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）,取出，判定结果。
结果判定：
产生1+凝集的最高稀释度，其倒数即为效价
1、阳性结果：
红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中。
2、阴性结果：
红细胞完全沉降到胶底部，在凝胶管底部形成红细胞扣。
传统方法（试管法）：
Rh系统抗体效价≥16有临床意义；ABO系统抗体效价≥64有临床意义
注：
据文献报道卡式抗人球蛋白法测出的母体效价值比聚凝胺和抗人球蛋白试管法高出1-2个滴度。
故微柱凝胶卡式检测法：
ABO系统抗体效价≥256作为临界值。
三、注意事项
1、红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。
尽
可能应用当日采集的新鲜血做本实验。
2、血清标本：
血清标本必须充分去除纤维蛋白，否则标本中纤
维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍红细胞沉淀，呈假阳性反应。
3、如在微柱凝胶中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。
4、父亲红细胞标本也可用与其同型的A型或B型红细胞代替。
5、每日试验前，先取出微柱凝胶卡放置至室温。
6、红细胞悬液的浓度控制在0.8%－1％之间。
7、试剂卡应放在18-25℃储存，如若长期放在4℃冰箱，建议每
1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。
四、参考文献：
1、《输血技术学》
2、《全国临床检验操作规程》第三版
七、新生儿溶血病母体IgG抗体效价检测卡标准
操作程序（SOP）
当孕妇RhD是阴性时，丈夫RhD是阳性时
一、准备工作
（一）微柱凝胶试剂卡的准备：
观察外观，如有干胶、杂质、气
泡不可使用，之后将卡放置室温（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。
（二）试剂配制：
用100mlpH7.4的PBS溶解0.154g二硫苏糖醇，
即0.01MDTT；或吸取2－Me14.7μl,加pH7.4磷酸盐缓冲液至1ml
为0.2M2-Me应用液。
密闭，避光，保存于4℃冰箱内，可使用1个
月。
（三）标本采集：
检查用的血样为孕妇静脉血或新生儿脐带血5ml,
一般为不抗凝血，无需空腹。
同时，提供3-4ml胎儿父亲的抗凝血，
对判断母子血型的配合与否是十分有益的。
（四）红细胞标本的制备：
用红细胞稀释液配制红细胞悬液，红细胞最终浓度为0.8%－1％。
（五）血清标本的制备：
将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促
凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后离心，2000rpm，10分钟，取上清。
该上清不得有絮状物或沉淀。
取同体
积的血清和DTT混匀，37℃孵育30~60分钟。
二、操作步骤
1、在试管加入200ul母体血清和200ul2-Me应用液，置37℃水
浴，30—60分钟，以充分破坏血清中的IgM类抗体。
2、取6只干净试管，做好标记；第1号管中加入处理后的血清
100ul和100ul生理盐水，混匀（为1：
4稀释）；第2-6号管中依次加100ul的生理盐水和前一号管中的血清100ul，做倍比稀释。
（1:
8/1:
16/1:
32/1:
64/1:
128）
3、将卡标记好，依次将倍比稀释50ul血清分别加入标记卡中。
4、在所有孔中加入50ul标准O型0.8%-1%红细胞（或用O形红
细胞）悬液，测定孕妇ABO血型系统以外IgG血型抗体效价。
5、加样后的试剂卡，置37℃中孵育15分钟。
6、用专用离心机离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）,取出，判定结果。
三、结果判定：
产生1+凝集的最高稀释度，其倒数即为效价
1、阳性结果：
红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中。
2、阴性结果：
红细胞完全沉降到胶底部，在凝胶管底部形成红细胞扣。
参考值：
Rh系统抗体效价≥32有临床意义
注：
据文献报道卡式抗人球蛋白法测出的母体效价值比聚凝胺和抗人球蛋白试管法高出1-2个滴度。
四、注意事项
1、红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。
尽
可能应用当日采集的新鲜血做本实验
2、血清标本：
血清标本必须充分去除纤维蛋白，否则标本中纤
维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍红细胞沉淀，呈假阳性反应。
3、如在微柱凝胶中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体
阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。
4、父亲红细胞标本也可用与其同型的A型或B型红细胞代替。
5、每日试验前，先取出微柱凝胶卡放置至室温。
6、红细胞悬液的浓度控制在0.8%－1％之间。
7、试剂卡应放在18-25℃储存，如若长期放在4℃冰箱，建议
每1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。
五、参考文献：
1、《输血技术学》
2、《全国临床检验操作规程》第三版
八、微柱凝胶检测卡在实验室操作的注意事项
1、观测卡是否正常：
首先看卡内的凝胶是否干枯，如干枯应放弃使用；凝胶分布是否均匀，抗人球蛋白试剂是否溅到反应腔的壁上，这是由于运输时倒位造成的。
建议所有卡先离心约一分钟再使用。
2、血液标本处理：
最好是2天以内的新鲜血液，时间过久，红细胞会
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