第十四章 男科实验室检查商学军.docx

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第十四章男科实验室检查商学军

第十四章男科实验室检查

男性不育与精液质量密切相关，精液分析是是生殖评价的重要手段。

男科实验室检测项目主要包括：

精液常规、精子形态、精子存活率、抗精子抗体、精浆生化、精子功能、生殖激素、前列腺按摩液、前列腺特异抗原以及性传播疾病病原体等。

本章主要介绍男科实验室精液分析。

第一节精液采集

1．准备受检者采集精液前，工作人员给受检者提供准确指导，需要询问禁欲时间和受检目的，提供留样容器，并嘱咐留样时的注意事项。

2．禁欲时间精液采集者通常禁欲48小时以上，但不超过7天。

如需复查,每次禁欲的天数应尽可能相对稳定。

如果仅仅是为了观察受检者精液中有无精子，禁欲时间没有严格的限制。

3．完整性精子浓度受精囊腺和前列腺分泌液量的影响，如果标本不完整，尤其是富含精子的初始部分丢失时，要在检测报告上注明，并在禁欲2～7天后重新采集标本检测。

4．采集方法为避免精液暴露于温度波动过大的环境和控制从采集到检测的时间，安排靠近实验室的私密房间进行标本采集。

推荐用手淫的方法采集精液，取精前洗净双手和阴茎。

充分勃起阴茎并尽量兴奋，将精液全部射入指定容器中。

如确有困难，可选择家中样本采集或避孕套采集，后者只能用经特殊设计对精子没有毒性的避孕套来采样。

以上受检者应记录采集的时间，并在1小时内送至实验室。

在送至实验室途中样本应保持在20℃~37℃的环境中。

对要进行微生物检测精液样本的采集：

必须避免来自精液以外的污染（外周皮肤等），受检者需按下列步骤进行：

排尿；用肥皂清洗手和阴茎；冲去残留肥皂；用一次性无菌毛巾擦手和阴茎；精液射入无菌容器中。

精液样本的收集和实验室微生物操作开始的时间间隔不超过3小时。

淋球菌对温度和氧气敏感，精液标本要求在20分钟之内检查。

精液是潜在的传染源，精液标本应视为生物危险品，其可能含有有害的感染物质，如HIV、HBV、HSV等，操作者应注意自身安全防护。

第二节常规分析

精液的常规检查包括精液外观、体积、液化时间、酸碱度、黏稠度、精子浓度、精子活力和精子活率等。

1.外观正常精液外观呈灰白色、均质、半流体状。

禁欲时间长者射出精液可呈淡黄色；黄疸患者的精液和服用某些药物者的精液可呈黄色；精液清亮、透明常见于无精子或少精子症男性；精液呈红褐色或带血，称为血精，常见于精囊炎、前列腺炎等生殖系统疾病，也可见于苗勒管囊肿、结石、肿瘤如前列腺癌、输精管的微小损害等。

2.体积WHO推荐精液体积测定方法有两种：

称重法和直接测量法。

首选称重法测量精液体积，精液密度的变化范围通常在1.043~1.102g/ml。

3.液化精液射出后经历先凝固后液化的过程。

精液射出最初呈现半固体凝胶状，几分钟后便开始液化，常在15分钟内完全液化，很少超过60分钟。

对于液化不全精液标本，可采用机械混匀或酶消化等方法处理。

精液液化不全常见于前列腺疾病，其中以前列腺炎症最多见。

4.酸碱度正常精液的pH在7.2~8.0之间。

当附属性腺或附睾存在急性感染时，精液的pH值可大于8.0。

当射精管阻塞或先天性精囊腺缺如时，精液pH值降低。

精液pH应在精液液化后立即测定，放置时间长会影响pH值测定。

5.粘稠度正常精液拉丝长度小于2cm。

6.精子凝集精子凝集特指活动精子以不同方式，如头对头、头对尾、尾对尾或混合型，彼此黏在一起的现象。

凝集分为4级：

1级：

零散的凝集，每个凝集＜10个精子，有很多自由活动精子。

2级：

中等的凝集，每个凝集＜10～50个精子，存在自由活动精子。

3级：

大量的凝集，每个凝集＞50个精子，仍有一些自由活动精子。

4级：

全部的凝集，所有的精子凝集，数个凝集又粘连在一起。

活动精子黏附细胞或细胞碎片，或不活动精子之间相互黏附（聚集），不应该记为凝集。

存在凝集不足以推断免疫因素导致不育，但暗示存在抗精子抗体，需进一步实验证明严重的凝集影响精子活力。

7.精子活力与活动率妊娠与前向运动精子活力程度相关。

WHO-4版将精子活力分为a、b、c、d4级：

a级为快速前向运动（即37℃时速度≥25μm/s，或20℃时速度≥20μm/s）；b级为慢速或呆滞的前向运动；c级为非前向运动（<5μm/s）；d级为不活动。

精子活动率为a＋b＋c级精子百分率总和。

鉴于检测者很难无偏差地精确区分a级与b级前向运动精子，因此使用手工分析时，WHO-5版推荐使用简单的3级分类系统进行活力分级：

前向运动（PR）：

精子呈直线或沿一大圆周运动，不管其速度如何。

非前向运动（NP）：

所有非前向运动的形式，如以小圆周运动，尾部动力几乎不能驱使头部移动，或仅有尾部摆动。

不动（IM）：

没有运动。

第三节精子形态学分析

精子形态学分析是评价精子受精能力的重要指标之一，正常形态精子百分率与人工授精或卵细胞质内单精子注射的成功率密切相关。

精子涂片染色方法有巴氏染色法、Diff-Quik染色法、苏木精-伊红（HE）染色法、瑞氏染色法、瑞-吉氏染色法和Shorr染色法等。

WHO-5推荐采用巴氏、Shorr或Diff-Quik染色法。

巴氏、Diff-Quik和Shorr染色法可以清楚地区分精子顶体和核，但各种染色方法的染色效果、对精子头大小的影响以及所采用的形态学评估标准略有不同。

巴氏染色是一种较好的染色方法，能够使精子头部的顶体区与顶体后区、过量残留胞质、尾部的中段与主段染上颜色，有利于精子的形态学分析、精液中未成熟生精细胞和非精子细胞的检查。

巴氏染色的另一个优点是制备的精液涂片可长期保存。

临床可使用新鲜的液化精液或生理盐水洗涤过的精子悬液制备涂片，每份标本作双份涂片，涂片间可能存在显著性差异，故对两张涂片均进行形态学评估。

WHO-5使用的涂片方法有拉薄技术和滴管法。

拉薄技术是将一滴精液沿成角度的载玻片后缘展开，载玻片向前拖拉，制成涂片；滴管法是对于已洗涤的精液持移液管水平向前推动，将一滴精子悬液沿载玻片的表面展开。

精液的粘稠度越低，拉薄效果越好，拉薄技术常常不适用于高粘稠度的精液，低浓度、粘稠的或充满杂质的标本，或使用计算机辅助精子形态学评估的标本，一般先离心去除精浆，沉淀的精子团重新悬浮以获得合适浓度，通常不应超过50×106/ml。

离心洗涤等技术操作可能影响精子形态，如果使用这些方法必须记录下来。

WHO-4和WHO-5均推荐使用严格标准进行精子形态学评估。

5版的正常形态精子标准为：

精子头轮廓规则、外形光滑，大体呈椭圆形。

顶体区清晰可辨，占头部的40%～70%。

顶体区空泡不超过2个，空泡大小不超过头部的20%。

顶体后区不含任何空泡。

精子中段细长、规则，与头部长度相仿。

中段主轴与头部长轴成一条直线。

残留胞质只有在超过精子头大小的1/3时才被认为过量残留胞质。

精子主段比中段细，且均一，其长度约为头部长度的10倍。

精子尾部没有鞭毛折断的锐利折角。

此标准要求将所有形态学处于临界状态的精子均列为异常。

精子缺陷的类型大体分为以下几类：

1．头部缺陷：

大头、小头、锥形头、梨形头、圆头、无定形头、有空泡的头（超过2个空泡，或者未染色的空泡区域占头部的20%以上）、顶体后区有空泡、顶体过小或过大的头（小于头部的40%或大于头部的70%）、双头等。

2．颈部和中段缺陷：

颈部弯曲指颈和尾形成的角度大于头部长轴的90%、中段非对称地接在头部、粗的或不规则的中段、锐角弯曲、异常细的中段等。

3.主段缺陷：

短尾、多尾、发卡形平滑弯曲、锐角弯曲、尾部断裂、尾部弯曲（大于90度）、尾部宽度不规则、卷曲等。

4.过量残留胞质（ExcessresidualcytoplasmERC）：

ERC通常是精子异常发生过程产生的异常精子所伴有的。

这类异常精子的特征是含有大量不规则已染色的细胞质，胞质的大小超过精子头部的三分之一，常同时伴有中段缺陷。

图14-1人类异常精子形态示意图（引自本章参考文献1）

WHO手册第4版与第5版的评估标准略有不同，尽管WHO-5将正常形态精子的参考值下限从4版的15%改为4％，但也提到有生育力男性（TTP≤12个月，使其性伴侣在停用避孕措施后12个月内怀孕的男性）精子正常形态中位数为15%。

第四节精子存活率检测

精子存活率是通过精子膜的完整性间接评价的，通常使用染料拒染法或低渗膨胀试验来鉴别细胞膜完整性。

染料拒染法基于损伤的细胞膜（死细胞膜）允许非透过膜性染料进入膜内染色。

低渗膨胀试验假设只有细胞膜完整的活细胞能在低渗溶液中发生膨胀。

1.伊红-苯胺黑染色法

取50ul精液与等体积的伊红-苯胺黑液混合，30s后制片，用亮视野显微镜在×1000倍油镜下检查。

每个样本重复评估200个精子。

结果评定：

活精子头部呈白色或淡粉红色，死精子头部呈红色或暗粉红色。

2.伊红Y染色法

将新鲜精液与伊红Y溶液等体积混匀，并覆以盖玻片，30s后用光学显微镜观察，活精子不着色，死精子被染成红色。

3．低渗膨胀试验

可用低渗液或蒸馏水作为膨胀液。

本实验可用于须避免精子染色时，如为ICSI选择精子。

膜完整的精子在低渗溶液中5min内发生膨胀，在30min之内所有尾部的形状是稳定的。

故常规诊断时，孵育30min，用于治疗用途时，孵育5min。

第五节精液白细胞检测

精液中过多的白细胞可能与感染和精液质量差有关。

白细胞精子症在男性不育中约占10%～20%。

精液白细胞在吞噬过程中产生活性氧（超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢等），氧自由基产生脂质过氧化作用，导致精子膜功能障碍和膜酶损伤，导致精子活力下降；大量白细胞在附睾、前列腺上皮浸润，可引起附属性腺功能障碍，影响精子在生殖道中的运行和成熟；白细胞产物IL-8、干扰素和TNF-α可使精子运动能力降低，而且，TNF-α可启动细胞免疫，使精液中抗精子抗体（anti-spermantibody，AsAb）产生增多，在AsAb存在情况下，白细胞具有较强杀伤精子能力；白细胞含大量蛋白酶，如过氧化物酶、弹性蛋白酶和胶原酶等，这些酶在杀灭细菌的同时也损伤精子。

因此，精液白细胞的检测十分重要。

精液常规检查白细胞是用新鲜精液直接镜检，这种判断方法往往把精液中非精子细胞误认为白细胞。

由于染色后镜检能准确地识别白细胞，因此精液中白细胞必须用染色法加以鉴别。

常用的精液白细胞的检查方法有:

邻甲苯胺蓝过氧化物酶染色法和基于白细胞特异性抗原的单克隆抗体技术。

1.邻甲苯胺蓝过氧化物酶染色法由于白细胞含有过氧化物酶，能分解H2O2，氧化正甲苯胺蓝显色。

含过氧化物酶的白细胞呈棕色，而过氧化物酶阴性细胞不着色。

基本操作程序为：

①正甲苯胺蓝染液的配制：

先分别配制饱和NH4Cl溶液（250g/L）、Na2EDTA磷酸盐缓冲液（pH6.0,50g/L）和正甲苯胺蓝液（0.25mg/ml），三者按1∶1∶9（ml）混合后，加入1滴30％H2O2混合，即为正甲苯胺蓝染液，配制后可使用24h；②将0.1ml精液与0.9ml正甲苯胺蓝染液混合，振摇2min，室温放置20～30min，再振摇；③取1滴混匀液置于载玻片上，置盖玻片后，光学显微镜镜检，观察200个精子视野中的白细胞数。

2．CD45单克隆抗体法人白细胞的所有类型表达一种特异性抗原CD45,故可用抗CD45单克隆抗体来检测不同类型的白细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞或T细胞等。

观察200个精子视野中的白细胞数。

细胞表面呈红色、细胞核呈蓝色为阳性，细胞表面不着色为阴性。

观察200个精子视野中的白细胞数。

精子及生精细胞不染荧光，T淋巴细胞膜染草绿色荧光。

精液中白细胞数/ml=（每100个精子视野中的白细胞数×精子数/ml）/100。

第六节精浆生化分析

精浆中附属性腺标志性分泌物的含量，可以大体反映对应腺体的功能。

反映附睾功能的指标有游离左旋肉碱、甘油磷酸胆碱（GPC）和中性α-葡糖苷酶等。

中性α-葡糖苷酶在反映附睾病变方面，具有很好的特异性和敏感性；并可用于鉴别诊断梗阻与非梗阻性无精子症。

精浆中存在两种α葡糖苷酶的异构体，其中中性α-葡糖苷酶仅来源于附睾；酸性α-葡糖苷酶主要来源于前列腺，后者可以被十二烷基硫酸钠（SDS）选择性抑制，从而可以测定反映附睾功能的中性α-葡糖苷酶。

用澳洲栗精胺（castanospermine）抑制剂阻断非葡糖苷酶的相关底物，可使测试更敏感。

反映精囊腺功能的有果糖和前列腺素。

精浆中果糖主要来源于精囊腺，其浓度可用于评估精囊腺分泌功能。

此外，精浆果糖浓度降低也见于射精管阻塞、双侧输精管先天性缺如、不完全逆行射精和雄激素缺乏等。

反映前列腺功能的有柠檬酸、锌、γ-谷氨酰转移酶和酸性磷酸酶等。

精液中的锌主要来自前列腺，是前列腺的功能指标之一，其含量比血清中高100倍以上，临床上常用于前列腺炎和男性不育的辅助诊断。

第七节抗精子抗体检测

精子对于男性虽为自身抗原，但由于直到青春期才出现，因此对自身免疫系统而言仍然是“异己”的。

正常生理情况下，精子为隐蔽抗原，与免疫系统处于隔绝状态。

在生殖道黏膜、血－睾屏障、血－附睾屏障的保护下，精子无法穿过生殖道黏膜或管腔壁进入血液，而且精浆中又存在免疫抑制性物质，再加上多种生理性保护机制，免疫系统不会对自身精子产生免疫应答。

一旦屏障破坏（如手术、外伤等），就会导致抗精子抗体（AsAb）的产生。

精液中的抗精子抗体几乎都是属于两类免疫球蛋白，IgA和IgG。

IgM抗体由于其相对分子质量较大在精液中极少发现。

IgA抗体可能比IgG抗体具有更重要的临床意义。

精子表面抗体检测可采用直接免疫珠（IB）试验和混合抗体蛋白反应（MAR）试验。

检测精浆、血清、宫颈黏液中抗精子抗体的间接试验可采用间接免疫珠（IB）试验和酶联免疫吸附法（ELISA）试验。

直接免疫珠和MAR试验采用新鲜精液标本，而间接免疫珠试验采用洗涤过的精子。

这两种试验的结果并不总是一致，但间接免疫珠试验的结果与检测血清抗体的制动试验的结果相关性很好。

IB试验和MAR试验的实验方案有些不同，但这两种试验的精子/微珠制备均在显微镜下检查。

微珠黏附于带有表面结合抗体的活动和不活动精子上，记录黏附有微珠活动精子的百分率。

一、精子表面抗体检测

1.混合抗球蛋白反应试验

混合抗球蛋白反应（MAR）试验是一项廉价的、快速和敏感的筛查试验，但它提供的信息少于直接免疫珠试验。

在MAR试验中，“桥连”抗体（抗IgG或抗IgA）将包被了抗体的微珠与精液中未洗涤精子表面的IgG或IgA相接触。

直接IgG和IgA的MAR试验，是用未经处理的新鲜精液与包被人IgG或IgA的乳胶颗粒（微珠）或处理过的红细胞相混合。

向悬浮液中加入特异性的抗人IgG或抗人IgA。

颗粒与活动精子之间形成混合凝集，提示精子表面存在IgG或IgA抗体（微珠之间的凝集作为抗体－抗原识别的阳性对照）。

2.直接免疫珠试验

这项试验比混合抗球蛋白反应（MAR）试验耗费更多的时间，但它可提供精子表面特异包被抗体的信息。

在直接免疫珠（IB）试验，将包被共价键结合的抗IgG或IgA的兔抗人免疫球蛋白的微珠直接与洗涤过的精子相混合。

带有抗人IgG或IgA的微珠结合到活动精子上提示，该精子表面有IgG或IgA抗体。

体液中抗精子抗体的检测

二、体液中抗精子抗体的检测

1.间接免疫珠试验

间接免疫珠试验用于检测已热灭活、不含精子的体液（例如，血清，睾网液，精浆或菠萝蛋白酶促溶的宫颈黏液）中的抗精子抗体。

无抗体的供者精子吸附了待测定液中的抗精子抗体，然后用直接免疫珠实验来检测。

2.酶联免疫法（ELISA）

ELISA方法敏感性高且较方便快捷，可用于临床的初筛检测。

第八节精液分析结果解读

2010年WHO对精液分析的参考值进行了调整（表14-1）

表14-1精液分析参考值（WHO）

项目

第4版（1999）

第5版（2010）

精液体积

≥2.0ml

≥1.5ml

pH

≥7.2

≥7.2

精子浓度

≥20×106/ml

≥15×106/ml

精子总数/一次射精

≥40×106/ml

≥39×106/ml

精子活动率

≥60%

≥40%

前向运动精子率

（a+b）级精子≥50%或a级精子≥25%

（a+b）级精子≥32%

精子存活率

存活精子≥75%

存活精子≥58%

精液白细胞

<1×106/ml

<1×106/ml

正常形态率

≥15%

≥4%

以下为精液分析结果解释：

1．无精液症（aspermia）：

精液容积为0，没有精液射出或逆行射精。

2.精液液化异常：

WHO规定，新采集的精液标本在室温25℃，60分钟内发生液化。

若超过60分钟仍未液化，则称为精液迟缓液化症或精液液化异常。

3.无精子症：

无精子症（azoospermia）是指所射精液中没有精子。

要排除不射精和完全逆行射精，并经过3次离心镜检精液仍未见精子后才可确诊。

4.隐匿精子症（cryptozoospermia）：

精液常规检查时未发现精子，但在精液离心后沉淀中可以发现少量精子。

5.多精子症（polyzoospermia）：

多精子症的诊断标准有争议。

Jocl提出精子浓度阈值为120×106/ml，多精子症Ⅰ级为（120~200）×106/ml，多精子症

级为（200~250）×106/ml，多精子症

级为＞250×106/ml。

6.少精子症（oligozoospermia）：

少精子症是指精液中的精子数目低于正常具有生育能力男性的疾病。

一般认为当精子浓度低于15×106/ml或精子总数低于39×106/一次射精时为少精子症。

7.畸形精子症（teratozoospermia）：

生育年龄男性连续2次以上精液分析精子浓度不低于15×106/ml，前向运动（PR）精子不少于32%，正常形态的精子低于4%，可诊断为畸形精子症。

8.弱精子症（asthenozoospermia）：

弱精子症是指精液参数中前向运动精子百分率低于32%。

精子运动能力的强弱直接关系到人类生殖，只有正常作前向运动的精子才能确保精子抵达输卵管壶腹部，并与卵子结合形成受精卵。

临床上少精子症常常与精子活率低下、前向运动能力差或精子畸形率高同时存在，此时称为少弱精子症（oligoasthenozoospermia）、少畸精子症（oligoteratozoospermia）、少弱畸精子症（oligoasthenoteratozoospermia）或弱畸精子症（asthenoteratozoospermia）等。

9.坏死精子症（necrozoospermia）：

精液中活精子百分率低于58%，不活动精子百分率增高。

10.包裹抗体的精子：

混合抗球蛋白反应试验（MAR）或免疫珠试验：

≥50%的活动精子被抗体包裹。

11.白细胞精液症（leukospermia）：

精液中的白细胞数超出临界值。

（商学军，史轶超）

主要参考文献

1.谷翊群，陈振文，卢文红等译.2011.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册.北京:

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