HisTag 表达蛋白纯化原理方法和问题分析.docx

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HisTag表达蛋白纯化原理方法和问题分析

之阿布丰王创作

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二O二一年七月二十九日

组氨酸标签卵白的纯化His-Tag融合卵白是目前最罕见的表达方式,而且很成熟,它的优点是表达方便而且基本不影响卵白的活性,无论是表达的卵白是可溶性的或者包容体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化.2．1IMAC（ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography）是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子,可以吸附纯化概况带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的卵白,1987年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强,此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原.同年1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽,1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽,无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都获得很好效果,尔后表达带六个组氨酸标签的卵白配合IMAC变得非常普遍,相对而言,不带标签的卵白纯化就非常困难,所以表达带六个组氨酸标签的卵白配合IMAC纯化酿成最经常使用而且最有效的研究卵白结构和功能的有力手段.1986年Porathetal.还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化卵白的纯化,而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果,这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化,同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽,应用非常广泛.市面罕见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签卵白的配基有以下几种：

2.2影响IMAC纯化结果的因素：

2.2.1填料的种类：

分歧填料厂家的填料有分歧,所以使用过程最好能获得厂家的技术支持,因为分歧的厂家填料分歧,另外卵白纯化个性很强,没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签卵白的纯化,载量高和特异性好自己就是矛盾.2.2.2填料的配基种类、密度、金属离子种类填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子,哪家产物的颜色越深就意味着和卵白的作用力越强,适用范围越广,载量也越高,纯化的好坏关键看纯化的条件,仅有填料的特异性是不够的,同样配基密度下IDA填料的亲和力要比NTA的强,所以NTA上不能吸附的样品可以选择IDA为配基的填料.螯合金属离子和卵白作用强弱为铜和镍离子的强,而锌和钴离子的弱.因此如果一个卵白作用力强,想获得好的特异性可以选择螯合钴离子,它还有一个优点是不怕还原剂,特别时候有高浓度的还原剂.相同金属离子,IDA的强于NTA.螯合金属离子的价位越低和卵白的作用力越强.同时镍离子是最经常使用的,如果有条件可以换分歧金属离子以获得更好的效果,因为分歧的金属离子有分歧的选择性.因此要希望填料应用范围广就选择镍琼脂糖凝胶,如果是希望特异性好而且稳定就选择镍NTA琼脂糖凝胶.

2.2.2卵白自己的结构和样品来源IMAC原理已经说明只要是带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的卵白都可以被吸附,所以要想获得好的纯化效果,必需选择好纯化的条件,通常带组氨酸卵白都可以在天然情况下被镍琼脂糖凝胶或镍NTA琼脂糖凝胶吸附,可是如果标签折叠在卵白内部不容易流露,这样就难纯化,如果镍琼脂糖凝胶都不能吸附,可以在样品和平衡缓冲液中加1-2M脲,这样卵白结构相对松散,也许能吸附而卵白不会变性,对自己就是变性的卵白如果8M脲不能吸附,改用6M盐酸胍溶解样品就可以被吸附,因为盐酸胍可以翻开脲打不开的结构使得标签能流露.固然如果有二硫键最好加1-2mMDTT也可以更好解决吸附的问题.另外也可以把标签换到另外一端.2.2.3缓冲体系,pH及盐浓度对一些作用力弱的卵白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系,如Tris-HCl等,适当提高缓冲液pH可以增加吸附效果,同样原理可以降低pH洗脱一些咪唑洗不去的杂带.为防止由于电荷作用的干扰,平衡缓冲液中需要加0.1-1M氯化钠,而在平衡缓冲液添加00.1-0.5%吐温或者triton可以降低由于疏水相互作用招致的非特异吸附.2.2.4概况活性剂及其他添加剂添加一些概况活性剂可以增加卵白的溶解度,降低疏水相互作用,这样使纯化的结果更好,在实验标明在平衡缓冲液中加0.5-1%的吐温可以使电泳的布景更清晰,杂带减少.对一些难溶解的样品也可以加乙醇或者甘油.在变性条件下有时会在样品中添加还原剂如巯基乙醇或者二巯基苏木糖醇,它们如果浓渡过高或者上样量过年夜,会招致镍离子还原甚至脱落,使填料失效,如果要在这样的环境下,那最好选择螯合价位高的填料如镍NTA琼脂糖凝胶或降低还原剂的浓度,通常1-2mM是没问题的.如果一定要选择高浓度的还原剂,也可以把镍离子还成钴离子,它不怕还原,把普通的镍琼脂糖凝胶还成钴离子即可.以下是破碎及提取、纯化把持和罕见问题解决方法：

破碎方法样品的处置对纯化是很重要的,重要的原则是破碎要温和,不能使卵白断裂或者降解,否则一些片段同样也带有标签,这样增加了纯化的难度.需要注意的问题是超声破碎温度,强度,时间年夜肠杆菌的破碎方法：

1）收集培养发酵液,4度7000-8000g离心10分钟,收集沉淀的菌体（如果不是马上破碎可以放-70度冷冻,可是最好能保管成小块或者薄片,这样好用.）2）取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5MNaCl,0.5mg/ml溶菌酶,1mMPMSF,1mMMgCl2,1.7units/mlBenzonase,其中的菌酶,1mMPMSF,1.7units/mlBenzonase现加）在冰上混合45分钟,如果pH不在7-8,需要用0.5MNaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到10分钟.3）把混合菌体在冰水中用超声探头破碎20秒种,总共四次,中间间隔要坚持2分钟冷却破碎液,检测pH,如果不在7-8,还是用0.5MNaOH一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为1升,破碎三次,压力为800bar.4）破碎的液4度12000g离心10分钟,如果要让溶液更廓清,可以4度50000g离心30分钟,这时候可以把上清和沉淀分别留样,跑电泳,如果只沉淀中有目标卵白,那就用变性条件下去提取.5）破碎离心的上清加2M咪唑溶液0.12ml使终浓度为20mM,样品的总体积为10ml.过柱子的样品最好过0.45μm的滤膜,防止堵柱.2．可溶性卵白的纯化1）平衡缓冲液：

pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5MNaCl,含20mM咪唑.2）洗脱缓冲液：

pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5MNaCl,含500mM咪唑.3）取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱,用10ml平衡缓冲液平衡,然后取破碎上清10ml样品以0.5ml/min上样,然后2ml/管分管收集.4）用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品,流速1-2ml/min,2ml/管收集.5）用5ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品,流速1-2ml/min,2ml/管收集.6）再用5ml平衡缓冲液平衡柱子,灌满20%乙醇,封闭,以备下次使用.7）此方法是通用的方法,可是未必能获得适合自己卵白的满意效果,所以优化的法子是洗脱可以用50mM,100mM,300mM,500mM分阶段洗脱,各洗脱5个柱体积,这样配合电泳检测,获得适合自己的卵白的条件.8）收集的部份可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定卵白的浓度,再取有卵白的部份电泳检测纯度.3．罕见问题及解决方法1）卵白不溶解或沉淀在柱子上：

要留意缓冲液体的pH,另外在样品中添加一些概况活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性卵白的溶解度,防止沉淀.2）卵白不吸附：

这是最罕见的,通常的原因有1是标签不流露,被折叠在卵白的结构内,可以在变性的条件下去纯化,2可以选择作用力更强,配基密度更高的填料,通常镍琼脂糖凝胶作用力最强,如果卵白分子量年夜可以选择手臂长的填料,如镍NTA琼脂糖凝胶,填料的好坏可以看填料的颜色,颜色越深那配基密度越高,作用力也相应要强.3样品的pH过低或者沉淀招致不能吸附,所以样品和缓冲液的pH要尽量一致,防止沉淀,通常再偏碱性条件下吸附更好.3）难洗脱：

如果穿透中目标卵白明显减少,而洗脱又没有,取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标卵白,可以用更强的洗脱条件如500mM咪唑,如果还不能洗脱,可以直接用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱.4）电泳杂带多：

因为这种亲和究竟特异性要差点,原因在卵白中带组氨酸,色氨酸,半胱氨酸等很罕见,特别是卵白折叠会招致几个这样的氨基酸残基临近,这样也会使它们和镍柱的作用力增加,因此可以用分歧浓度的咪唑阶段洗脱,另外在咪唑洗脱前增加一步0.5MpH5的醋酸缓冲液洗脱,在平衡缓冲液中添加0.5%吐温或Triton可以防止因为疏水相互作用招致非特异吸附,这样可以电泳的杂带明显减少,可是如果用这样的方法还是杂带多,那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制欠好招致卵白短裂或者分解招致一些卵白片段带标签,或者因为样品长时间保管招致水解等,总之纯化的好坏决定于每一个步伐,不单仅是纯化的问题.还有一个不容忽略的问题是有时候因为卵白相互作用或者因为形成聚合体招致杂带增加,而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加概况活性剂或者增加离子强度获得改善,对因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加1-2mM巯基乙醇防止,如果这样的情况下最好是选择镍NTA琼脂糖凝胶,因为它在还原剂下更稳定.包容体卵白的纯化及复性包容体破碎1、年夜肠杆菌的破碎方法：

１）收集培养发酵液,4度7000-8000g离心10分钟,收集沉淀的菌体（如果不是马上破碎可以放-70度冷冻,可是最好能保管成小块或者薄片,这样好用.２）取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（pH8.550mMTris-HCl,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,1mg/ml溶菌酶.）在冰上混合45分钟.３）把混合菌体在冰水中用超声探头破碎20秒种,总共四次,中间间隔要坚持2分钟冷却破碎液,检测pH,如果不在8.5,还是用1MTris溶液一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为1升,破碎三次,压力为800bar.４）破碎的液4度12000g离心10分钟,如果要让溶液更廓清,可以4度50000g离心30分钟,这时候可以把上清和沉淀分别留样,跑电泳,如果只沉淀中有目标卵白,那就用变性条件下去提取.５）破碎离心的沉淀用4M清洗包容体,再离心得沉淀加（pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5MNaCl,8M脲,20mM咪唑）.过柱子的样品最好过0.45μm的滤膜,防止堵柱.4．包容体卵白的纯化1）平衡缓冲液：

pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5MNaCl,8M脲,20mM咪唑.2）洗脱缓冲液：

pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5MNaCl,8M脲,含500mM咪唑.3）取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱,用10ml平衡缓冲液平衡,然后取破碎上清10ml样品以0.5ml/min上样,然后2ml/管分管收集.4）用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品,流速1-2ml/min,2ml/管收集.5）用5ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品,流速1-2ml/min,2ml/管收集.6）再用5ml平衡缓冲液平衡柱子,灌满20%乙醇,封闭,以备下次使用.7）此方法是通用的方法,可是未必能获得适合自己卵白的满意效果,所以优化的法子是洗脱可以用50mM,100mM,300mM,500mM分阶段洗脱,各洗脱5个柱体积,这样配合电泳检测,获得适合自己的卵白的条件.8）收集的部份可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定卵白的浓度,再取有卵白的部份电泳检测纯度.9）其问题和解决方法可以参考可溶性卵白的纯化的相关内容.复性十分复杂,所以建议参考文献和一些专门的论述.罕见问题及解决方法1）不溶解或沉淀在柱子上：

要留意缓冲液体的pH,另外在样品中添加一些概况活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性卵白的溶解度,对带半胱氨酸多的卵白很容易氧化聚集沉淀,所以需要加2-5mM巯基乙醇防止沉淀.2）白不吸附：

这是最罕见的,通常的原因有1是标签不流露,被折叠在卵白的结构内,可以在变性的条件下去纯化,如果用脲变性吸附欠好,可以改用盐酸胍,个人经验是这样通常可以使吸附不上的卵白获得改善,顺利纯化.2可以选择作用力更强,配基密度更高的填料,通常镍琼脂糖凝胶作用力最强,如果卵白分子量年夜可以选择手臂长的填料,如镍NTA琼脂糖凝胶,填料的好坏可以看填料的颜色,颜色越深那配基密度越高,作用力也相应要强.3样品的pH过低或者沉淀招致不能吸附,所以样品和缓冲液的pH要尽量一致,防止沉淀,通常再偏碱性条件下吸附更好.3）难洗脱：

如果穿透中目标卵白明显减少,而洗脱又没有,取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标卵白,可以用更强的洗脱条件如500mM咪唑,如果还不能洗脱,可以直接用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱.4）电泳杂带多：

因为这种亲和究竟特异性要差点,原因在卵白中带组氨酸,色氨酸,半胱氨酸等很罕见,特别是卵白折叠会招致几个这样的氨基酸残基临近,这样也会使它们和镍柱的作用力增加,因此可以用分歧浓度的咪唑阶段洗脱,另外在咪唑洗脱前增加一步0.5MpH5的醋酸缓冲液洗脱,在平衡缓冲液中添加0.5%吐温或Triton可以防止因为疏水相互作用招致非特异吸附,这样可以电泳的杂带明显减少,可是如果用这样的方法还是杂带多,那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制欠好招致卵白短裂或者分解招致一些卵白片段带标签,或者因为样品长时间保管招致水解等,总之纯化的好坏决定于每一个步伐,不单仅是纯化的问题.还有一个不容忽略的问题是有时候因为卵白相互作用或者因为形成聚合体招致杂带增加,而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加概况活性剂或者增加离子强度获得改善,对因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加1-2mM巯基乙醇防止,如果这样的情况下最好是选择镍NTA琼脂糖凝胶,因为它在还原剂下更稳定.

时间：

二O二一年七月二十九日