造血干细胞的提取.docx

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造血干细胞的提取

造血细胞分离、集落培养及表型分析

所谓造血干细胞（hematopoieticstemcells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。

它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞,同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。

图1造血系统和造血干细胞分化图

Fig。

1hematopoieticsystemandhematopoieticstemcelldifferentiation.

造血干细胞主要存在于骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和动员的外周血相比，脐血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，是优良的造血干细胞来源。

造血干/祖细胞鉴别的传统方法还是应用集落分析方法，它可检测粒-巨嗜细胞集落形成单位（colony-formingunit-granulocyte/macrophage，CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（burst-formingunit-erythroid，BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（colony-formingunit-megakaryocyte，CFU-MK）、红系-粒系-巨嗜系-单核系集落形成单位（multipotentcolony-formingunits，CFU-GEMM或mixedcolony-formingunit，CFU-Mix），等等，它是在半固体培养基上培养14天，然后在显微镜下计数集落。

造血干细胞的表面标志随着个体发育的不同时期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已经普遍被认为是造血干细胞的标志。

此外，1997年发现一个新的造血干细胞标志是AC133，但具CD34抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共同标志。

一、实验原理

1、用流式细胞仪分析细胞表型

   待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。

这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态。

鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交。

该区称为测量区。

利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。

细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器、通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。

2、单个核细胞的分离

采用密度梯度原理，利用血液中各类细胞的密度不同进行分离。

3、CD34+细胞分选

利用抗原抗体反应的原理，样品中的CD34+细胞可与偶联有CD34抗原的磁珠反应，将MiniMACS免疫磁性吸附柱置于磁场中，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34＋细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后用MACS缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34＋细胞。

4、集落检测

利用造血干细胞的特性，在特定的条件下，造血干细胞可向某一系的细胞分化，从而在半固体培养基上形成一个个的克隆，即集落，一个集落代表一个造血干/祖细胞。

二、实验材料

脐血

脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。

供者要求身体健康，发育良好的非高龄产妇。

无遗传病史，无病毒病史，无血液系统疾病，无寄生虫病及地方病。

HIV、肝炎、梅毒等检测均为阴性。

健康产妇分娩以后，立即用血袋无菌采取新生儿脐带血，血袋内装有无菌ACD－B25mL抗凝剂（每100mLACD－B含有：

一水合枸橼酸0.48g，二水合枸橼酸钠1.32g，一水合葡萄糖1.47g），相当于100mL的血液抗凝剂，每次实际采集脐带血50-100mL。

采集后脐带血置于4℃冰箱内保存，一般在6小时内取回分离。

培养基与细胞因子

培养基为IMDM培养基，添加20%的胎牛血清。

细胞因子均为人重组蛋白，干细胞因子（SCF）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-3（IL-3）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、红细胞生成素（EPO）、

三、实验方法

单个核细胞的Ficoll密度梯度离心分离

将脐血用IMDM培养基以1：

2稀释，在50mL离心管中加入15mLFicoll，之后小心加入30mL稀释的脐血平铺在Ficoll上，之后置于吊篮式离心机中在400g下密度梯度离心30min，吸取中间的白层，用IMDM培养基洗涤细胞，除去淋巴细胞分离液和血小板。

集落分析方法

CFU－GM的检测体系为IMDM培养基，添加20％胎牛血清，4mmol/mL谷氨酰胺，含0.9％甲基纤维素，以及人重组造血生长因子SCF、IL-3、IL-6，GM－CSF、G－CSF,其浓度分别为50ng/mL、20ng/mL、20ng/mL、20ng/mL和20ng/mL。

半固体培养在24孔板中进行，每孔加半固体培养基500μL，加入2.5×104个单个核细胞。

在37℃、5％CO2、湿度饱和的二氧化碳培养箱中培养14天后在显微镜下进行集落计数，超过50个细胞的细胞簇为一个集落。

流式细胞分析

取1.0×106细胞用PBS洗两遍，重悬后分配到1.5mL管中离心，加PE偶联的小鼠抗人CD34单抗和FITC偶联的小鼠抗人CD45单抗各10μL，4℃孵育30分钟。

PBS洗两遍，离心后，每管加1mLFACS保存液。

同型对照以PE偶联的小鼠抗真菌毒素标记。

标记细胞用流式细胞仪（BD公司）分析，结果用LysisII软件处理，以CD45设门进行分析。

脐血CD34＋细胞的分离纯化

将1.0×108细胞悬浮于0.3mlMACS缓冲液中，加50μl偶联于磁珠的小鼠抗人CD34+抗体，4℃孵育30分钟，采用MiniMACS免疫磁性吸附柱分离装置洗涤吸附柱中进行分离，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34＋细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后用MACS缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34＋细胞。

四、实验结果

1、单个核细胞的分离

脐血的体积

脐血中单个核细胞液体积

分离出的单个核细胞液的密度

分离出的单个核细胞液的体积

收率

样品1

2.5

40ml

样品2

1.25

40ml

2、造血干/祖细胞集落计数

孔内接种的单个核细胞数目

孔内的集落数

每10000个细胞中集落的数目

一袋脐血中总集落数

样品1

2.5

43

样品2

2.5

31

3、脐血中CD34+细胞的数量

CD34+细胞的比例

一袋脐血中CD34+细胞的总数

样品1

样品2

4、脐血中分离得到的CD34+细胞的数量

CD34+细胞的数目

样品1

样品2

五、讨论

1、从一袋血获得的CD34+细胞数与集落形成数之间有和关联？

2、用MiniMACS免疫磁性吸附柱分离法获得的CD34+细胞数，与流式细胞分析的结果是否一致？

若不一致，原因何在？

动物细胞培养、计数、冷冻和复苏

.动物细胞的培养和计数

一、实验目的

由动物细胞表达和合成的蛋白质除了具有正确的氨基酸序列之外，在加工过程中还能以正确的方式进行折叠和修饰，且大多能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了所生产的蛋白质具有与天然产物一致的生物活性、免疫原性和体内寿命，这些特点使得动物细胞成为工业化生产诊断和治疗用生物产品的理想宿主，如各类重组蛋白质和单克隆抗体等。

另外，目前方兴未艾的组织工程、干细胞工程等也是和细胞培养技术密切相关的，因此，可以说细胞培养技术是细胞工程、组织工程等研究领域的基础。

本实验的目的是让学生学习和了解动物细胞培养的基本操作，以及相关的细胞培养前准备工作、细胞培养的环境条件和其他有关注意事项；用血球计数板对培养瓶中的细胞进行计数以及用台盼蓝计细胞的存活率。

二、基本原理

动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体的细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。

体外培养可分为原代培养和传代培养，原代培养是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，原代细胞通常只能培养10－50代左右即退化死亡；由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无限次代培养能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。

体外培养的细胞根据其生长方式，主要可分为贴附型细胞和非贴附型细胞两类，贴附型细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长，非贴附型细胞可在培养液中悬浮生长，因而也叫悬浮型细胞。

动物细胞培养与微生物培养有很大不同，这主要是因为动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体表面才能生长。

虽然动物细胞培养的基本原理和微生物类似，但动物细胞对于营养的要求更加苛刻，除氨基酸、维生素盐类、葡萄糖外，通常还需要血清；对于培养环境的适应性也比微生物差，其对环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，培养过程中一般需严格监控；动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长，它们对环境的影响又比微生物大，因此常用空气、氧气、二氧化碳和氮气的混合气体进行供氧和调节pH。

动物细胞培养还需要防治污染问题，细菌、真菌、病毒或细胞均可导致动物细胞培养的污染，而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境都有可能含有污染物。

因为动物细胞的培养周期通常为数天到数周，培养时间较长，因此防治污染问题则更加显得重要。

细胞培养过程中需要对细胞生长状态进行监测，这就必须在培养过程中随时取样进行细胞计数。

最简单、直接和最经济的方法是用血球计数板计数。

计数时取血球计数板四角的四个大方格，每个方格面积为1.0mm2，点样后其厚度为0.1mm，这样每个方格的体积即为1.0×10-4ml，细胞数的计算公式为：

四个大方格总细胞数×稀释倍数×104÷4，单位是细胞数/mL。

细胞存活率或称细胞活性的检测是用台盼蓝染色方法，其原理是活细胞的细胞膜完整，染色剂不能渗入，因而不能被染色，而死细胞的细胞膜不完整，细胞被染上蓝色，存活率为：

活细胞数÷总细胞数×100％。

三、仪器、材料和试剂

1.超净工作台

2.倒置显微镜

3.二氧化碳培养箱：

设定二氧化碳浓度为5％。

4.培养基：

DMEM培养基，除菌过滤；自制无血清培养基，0.22μm滤膜除菌过滤。

5.血清：

Hyclone新生小牛血清。

6.PBS缓冲液，0.22μm滤膜除菌过滤。

7.胰酶：

溶于PBS缓冲液，浓度0.25％，0.22μm滤膜除菌过滤。

8.玻璃方瓶、5ml和10ml移液管，121℃湿热灭菌，30分钟。

9.血球计数板

10.移液枪

11.台盼蓝染色液：

0.4克台盼蓝溶于100mlPBS缓冲液，过滤待用。

四、实验步骤

1.贴附型细胞传代培养

（1）倒掉将要传代的细胞培养瓶中的培养基；

（2）用10ml无菌PBS洗涤，倒掉；

（3）加入2ml胰酶溶液（0.25％），进行消化；

（4）显微镜下观察，直至所有细胞由铺展状态收缩为圆球形；

（5）倒掉胰酶；

（6）按稀释要求加入新鲜培养基，吹打分散，分装入玻璃方瓶，置于二氧化碳培养箱。

2.悬浮细胞传代培养

按贴附型细胞传代培养步骤（6）操作即可。

3.细胞计数

（1）将干净的盖玻片覆盖在血球计数板正中央，压紧使它们之间不留空隙；

（2）待计数样品如果需要，用PBS进行稀释；

（3）取0.5ml稀释后的样品，加入0.5ml台盼蓝染色液（0.4％），用滴管轻轻吹打混合；

（4）用滴管将细胞悬浮液沿盖玻片两侧缓缓滴入血球计数板的两个平台上，直至平台上完全充满细胞悬浮液，

（5）显微镜下计数，并按上述公式计算细胞密度；

五、注意事项

1.胰酶消化的程度必须掌握好，消化不足则细胞结团，无法分散，这将严重影响传代后细胞的生长，消化过量则会使细胞严重受损；

2.在将细胞悬浮液滴加到血球计数板上时注意不能过量以至于细胞悬浮液溢出平台，同时不能出现气泡；

3.对于稀释比例，应掌握在每个大方格内含25－50个细胞为合适；

4.对于每个大方格中刚好压在边线上的细胞，应当只计入两条边线上的细胞而忽略另两条边线上的细胞，例如将上侧和左侧边线上的细胞计入，那么下边和右边边线上的细胞则不能计入，不论细胞是大半在方格内还是小半在方格内。

六、实验记录

记录四个大方格内各自的活细胞数和死细胞数，并最终计算样品的细胞密度。

七、思考题

1.传代培养过程中导致污染的原因有哪些？

2.引起细胞计数误差的原因有哪些？

.细胞的冷冻和复苏

一、实验目的

细胞在体外长期传代中并不是稳定不变的，它们常常会发生各种变异，表现在形态、生长特性、细胞的结构甚至细胞核型也会发生变异，这些变异往往会导致目标产物的丢失，细胞功能的丧失以及生物安全性方面的问题。

因此，在构建好细胞株后需要建立一个细胞库，用低温冷冻的方法将细胞保存起来，以便随时有新鲜的细胞可供使用，确保研究或生产所用的细胞在一定的时间内具有结构和功能的稳定性和一致性。

本实验的目的是让学生学习和了解细胞冻存、复苏的目的和基本操作方法。

二、基本原理

在动物细胞的组成成分中90％以上是水，而水在冷冻过程中会形成冰晶，由于动物细胞没有细胞壁，冰晶会使细胞膜发生破裂而导致细胞死亡，因此要维持冷冻和复苏过程中细胞的存活率，必须在冷冻液中加入冷冻保护剂。

常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，其中二甲基亚砜因为其对细胞具有良好的保护性和较低的毒副作用二成为首选。

在冷冻和复苏过程中影响细胞存活率的因素主要是保护剂浓度和温度下降速率，实际操作中二甲基亚砜的浓度通常为5－10％，一般来说，冷冻过程中温度必须缓慢下降，尽可能减少细胞内冰晶的形成；在复苏过程中对细胞产生伤害的原因主要是解冻过程所形成的局部渗透压波动，通常采用的方法是快速解冻。

三、仪器、材料和试剂

1.程序降温仪

2.超净工作台

3.离心机

4.液氮罐

5.冻存液：

10％DMSO＋10％小牛血清＋80％培养液

6.冻存管（无菌）

7.离心管

8.细胞培养操作用具包括方瓶、移液管、培养基等，无菌。

四、实验步骤

1.冷冻过程

（1）准备好分散良好的细胞悬浮液并用台盼蓝染色计数；

（2）离心并将细胞重新悬浮在冻存液中，使细胞密度达到6×106活细胞/ml；

（3）将细胞分装在冻存管中，每支1ml，旋紧冻存管盖子；

（4）静置30分钟，使冻存液和细胞内的DMSO浓度达到平衡；

（5）将冻存管置于程序降温仪内，设置降温速率1℃/min，－40℃后5℃/min，降温至－100℃停止；

（6）将冻存管置于液氮罐（－196℃），长期保存。

2.复苏过程

（1）准备好玻璃方瓶、移液管、离心管等（无菌），新鲜培养基；

（2）将冻存管从液氮罐中取出，立即置于40℃水浴中，直至冻存管内细胞悬浮液完全融解，此过程约1－2分钟；

（3）在超净工作台内将冻存管内细胞悬浮液移至离心管，加入10ml新鲜培养基，离心（5min，1500rpm）；

（4）倒掉上清液，将细胞重新悬浮于10ml新鲜培养基中，移至玻璃方瓶，置于二氧化碳培养箱。

五、注意事项

1.涉及和液氮相关的操作，应戴好防护手套以防冻伤；

2.冻存管盖子必须旋紧，否则液氮容易渗入冻存管内，这样不仅可能导致污染，而且将严重损伤细胞。

六、思考题

1.有哪些因素影响细胞冻存和复苏后细胞的存活率？