临床化学之诊断酶学.docx
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临床化学之诊断酶学
诊断酶学
一、血清酶
（一）血清酶的分类
1.血浆特异酶：
在血浆中发挥特定催化作用的酶。
如胆碱酯酶、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
大多数在肝内合成。
血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。
2.非血浆特异酶：
在血浆中浓度很低，且无功能。
（1）分泌酶：
来源于外分泌腺的酶。
如胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和前列腺酸性磷酸酶等。
血液中分泌酶以失活状态存在，不发生催化作用。
在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有关，例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。
（2）代谢酶（细胞酶）：
在细胞内发挥催化功能的酶。
正常时这些酶存在于组织细胞中，血浆中酶活性很低。
细胞内、外浓度差异悬殊。
当酶来源的组织细胞发生病变，细胞膜通透性增加或细胞坏死时，细胞内酶大量进入血浆，导致血浆酶活性显著增高。
其下降的临床意义很少。
这一类酶较多，如转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏病时都可能出现变化。
（二）血清酶生理变异及其病理生理机制
1.血清酶生理变异
（1）性别：
CK和GGT都是男性高于女性。
（2）年龄：
碱性磷酸酶（与骨生长发育相关）。
（3）进食：
酗酒可引起γ-GGT明显升高。
（4）运动：
剧烈运动可引起血清中多种酶升高，如CK、LD、AST等。
（5）妊娠与分娩：
妊娠时ALP升高，分娩时可能有CK、CK-BB、LD升高。
2.血清酶病理改变机制：
（1）酶合成异常：
血浆特异酶大多数是在肝合成，当肝功能障碍时酶浓度常下降。
如血清胆碱酯酶活性在有肝功能障碍时可能下降。
由于酶基因变异也可引起特定酶减少或消失，如肝-豆状核综合征患者血中铜氧化酶活性可明显下降。
如有骨细胞增生时，血中ALP可上升。
（2）细胞酶的释放：
是疾病时大多数血清酶增高的主要机制，影响细胞酶释放的主要原因有：
1）细胞内、外酶浓度的差异；
2）酶在细胞内的定位和存在的形式；
3）酶蛋白分子量的大小：
酶释放的速度和分子量成反比。
例如LD分子量大于CK，而当有心肌梗死时，LD在血液中升高的时间就晚于CK。
（3）酶在细胞外间隙的分布和运送：
细胞中酶有三种途径进入血液
1）血管内皮细胞和血细胞的酶直接进入血液；
2）酶可同时进入血液和组织间隙，后者再入血；
3）酶大部分进入组织间隙后再入血。
（4）血液中酶的清除：
不同疾病和不同的酶从血液中清除的时间和机制不同，同一疾病不同酶恢复正常的时间也不一样，这和酶的半寿期等因素有关。
（三）酶活性和质量测定方法及其评价
1.酶活性测定方法
（1）按反应时间分类法：
1）定时法（两点法）：
通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。
其中t1往往取反应开始的时间。
在酶反应一定时间后，通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等使反应完全停止，也叫中止反应法。
2）连续监测法：
又称动力学法或速率法、连续反应法。
在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。
3）平衡法：
通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。
（2）按监测方法分类法：
1）分光光度法
2）旋光法
3）荧光法
4）电化学方法
5）化学反应法
6）核素测定法
7）量热法
2.酶质量测定法：
利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位ng/ml、μg/L来表示酶含量的高低。
与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响。
当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研究。
如肌酸激酶同工酶MB（CKMB）质量测定较活性测定对疾病的诊断价值高。
（四）酶活力测定的影响因素
1.反应速度：
大多数酶促反应是可逆反应，其速度既受底物浓度的影响，也受产物生成量的影响。
酶反应动力学中所指速度就是反应的初速度。
2.底物浓度：
米氏方程是反映酶促反应速度与底物浓度关系的方程式，其中Km称米氏常数（只与酶的性质有关，而与酶浓度无关）。
Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。
测定酶活力时，必须注意以下几点：
（1）酶促反应过程中，只有最初一段时间内反应速度与酶浓度成正比，随着反应时间的延长，反应速度即逐渐降低。
（2）要规定一定的反应条件，如时间、温度、pH等，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定，如温度不得超过规定温度的±1℃，pH应恒定。
（3）配制的底物浓度应准确且足够大，底物液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止底物被分解。
（4）标本要新鲜，由于绝大多数酶可因久置而活力降低，标本如无法及时测定，应保存于冰箱中。
用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。
在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。
（5）在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱及蛋白沉淀剂等。
（五）工具酶
1.NAD（P）＋或NAD（P）H偶联的脱氢酶及其指示反应：
NADH和NADPH在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度计检测，还可通过荧光法
2.偶联H2O2的工具酶及其指示反应：
有些酶作用于底物时，可使其氧化产生H2O2，后者在POD的作用下使色素原氧化显色进行测定。
葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、甘油氧化酶、胆固醇氧化酶等工具酶分别用于葡萄糖、尿酸、甘油、胆固醇的测定，可使相应底物被氧化，生成H2O2，H2O2可通过下列指示反应来检测。
（1）使单一的色素原显色：
色素原是一种无色的色素前身，在过氧化物酶（POD）存在下被H2O2氧化后可生成有色的色素。
如邻联茴香胺（ODA）。
（2）使成对的色素原显色：
必须有两个色素原共同存在，再在过氧化物酶（POD）的催化下生成色素。
如酚和4-氨基安替比林作用，生成红色色素。
（3）发光反应：
H2O2也可用化学发光反应来监测。
（六）标本采集要点及酶活性表示法
1.标本采集要点：
（1）不能溶血：
因大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多。
如LDH高150倍，ALT高7倍。
（2）及时分离血清：
防止血细胞内酶进入血清。
（3）尽量用血清标本：
防止某些抗凝剂对酶的抑制作用（除外测定与凝血或纤溶有关的酶）。
（4）及时测定：
防止酶蛋白变性。
（5）大部分酶在低温中比较稳定。
常用酶如ALT、AST、ALP、CK、GGT、和AMY，冷冻保存在10个月活性变化不大。
但有些酶如LD在融冻时被破坏，LD在低温反而不如室温稳定，即所谓的“冷变性”。
2.酶活性表示法：
通常以酶单位数表示。
国际单位的含义是：
在实验规定的条件下（温度、最适pH、最适底物浓度时），在1分钟内催化1μmol底物发生反应所需的酶量作为1个酶活力国际单位（U）。
（七）同工酶和亚型测定的临床意义
同工酶是指其分子组成及理化性质不同但具有相同催化功能的一组酶。
同工酶对疾病的诊断和鉴别诊断很有帮助，可以根据同工酶的差异用各种物理、化学方法将其分离测定。
现在可用免疫学原理测定同工酶。
1.构成：
一般由多亚基构成，亚基不同组合方式构成不同形式。
例如：
乳酸脱氢酶（LDH1～LDH5）由H亚基和M亚基构成的四聚体。
2.分布特点：
明显的组织器官特异性、细胞内定位不同、有些同工酶在不同发育阶段类型不同。
3.临床应用
（1）可根据同工酶的变化为推测受损组织或器官。
如CK-MB活性增高对判断心肌梗死有意义。
心肌有损伤时虽然可有总LD活性上升，但诊断意义不大，如果LD1活性上升，且LD1＞LD2则说明有心肌疾病，如果在此基础上还出现LD5＞LD4则说明在心肌损伤的同时并伴有肝的损伤，例如右心衰引起肝淤血的状况。
（2）可判断某些疾病的程度和预后
如线粒体AST，此酶较难进入血清，但当肝病变严重、细胞坏死时，线粒体同工酶可进入血中使其升高，对判断疾病的程度和预后都有帮助。
有些同工酶在从组织进入体液后，可进一步分化为几个不同的类型，即所谓同工酶亚型。
CK-MB的亚型有MB1、MB2，CK-MM的亚型有MM1、MM2、MM3。
这些亚型对心肌梗死的诊断和溶栓效果的判断都优于CK-总酶和同工酶。
二、常用血清酶和同工酶测定的临床意义
（一）连续监测法测定血清肌酸激酶（CK）
CK作用后生成的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。
1.原理：
酶偶联反应测定CK活性浓度
在340nm监测NADPH的生成量，可计算出CK的活性浓度。
2.生理变异：
新生儿CK常为正常成年人的2～3倍；男性参考值高于女性；白种男性CK均值为黑种人的66%。
3.参考值：
男性38～174U/L（37℃）。
女性26～140U/L（37℃）。
4.临床意义：
（1）CK主要用于心肌梗死的诊断：
心肌梗死发生后2～4h此酶即开始升高，12～48h达最高峰值，可高达正常上限的10～12倍，在2～4d降至正常水平。
此酶对诊断心肌梗死较AST、LD的阳性率高，特异性强，是用于心肌梗死早期诊断的一项较好指标，同时对估计病情和判断预后也有参考价值。
（2）病毒性心肌炎时CK也有升高。
（3）肌营养不良症、皮肌炎、骨骼肌损伤等也可致CK升高。
（4）脑血管意外、脑膜炎、甲状腺功能低下等疾病及一些非疾病因素如剧烈运动、各种插管及手术、肌肉注射氯丙嗪（冬眠灵）和抗生素等也可能引起CK活性增高。
（5）甲状腺功能亢进，长久卧床者总CK（主要为CK-MM）可下降。
（二）连续监测法测定乳酸脱氢酶（LD）总活性
LD是由两种不同的亚基（M、H）构成的四聚体，形成5种同工酶。
即LD1（H4）、LD2（H3M）、LD3（H2M2）、LD4（HM3）、LD5（M4）。
这5种同工酶大致可分成三类：
①以LD1为主，主要在心肌，可占总酶的50%，也存在于红细胞内；②以LD5为主，存在于横纹肌，肝中也有；③LD3为主，存在于肺、脾。
1.原理：
340nm处吸光度增加速率与样品中LD活性成正比。
2.生理变异：
婴儿酶活性可达成年人两倍，儿童和少年活性比成年人高10%～15%。
血清LD同工酶在成年人中：
LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5。
3.参考值：
血清LD：
109～245U/L（成人）
4.临床意义：
疾病
LD总酶
LD同工酶
心肌梗死
升高最慢（8～10d）
升高时间长（5～10d）
可高于正常上限10倍
LD1＞LD2，
可持续两周
充血性心衰，心肌炎
可高于正常上限5倍
LD1＞LD2
病毒性肝炎
部分患者可高于正常上限5倍
LD5＞LD4
肝硬化
轻度升高
LD明显升高，
LD5＞LD4
原发性肝癌
部分病例升高
同上
梗阻性黄疸
不定
常LD4＞LD5
肌肉损伤
视损伤程度而异
以LD5升高为主
恶性肿瘤
可增高
以LD3为主，LD3＞LD1
（三）连续监测法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）
氨基转移酶主要包括ALT和AST。
ALT和AST在于体内多种器官和组织中，以含量从多到少为序，AST存在于心脏、肝、骨骼肌和肾等；ALT存在于肝、肾、心、骨骼肌等。
AST有两种同工酶，分别存在于细胞质（c-AST）和线粒体（m-AST），ALT绝大多数在细胞质内，可能有极少量在线粒体中。
1.原理：
在340nm处连续监测吸光度下降速率，计算出ALT活性浓度。
2.生理变异：
较小
3.参考值：
成人＜40U/L
4.临床意义：
ALT常作为判断肝细胞损伤的灵敏指标。
（1）急性病毒性肝炎：
ALT阳性率为80%～100%，急性黄疸型肝炎患者出现黄疸前2～3周即有转氨酶的明显升高，最高可达500U以上，多为ALT＞AST。
肝炎恢复期，ALT转入正常；重症肝炎或亚急性重型肝坏死时，一度上升的ALT在症状恶化的同时，酶活性反而降低，而胆红素却进行性升高，出现“酶胆分离”，常是肝坏死征兆。
（2）慢性活动性肝炎或脂肪肝：
ALT轻度增高（100～200U），或属正常范围，且AST＞ALT。
（3）肝硬化、肝癌时，ALT有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后严重。
（4）其他原因引起的肝脏损害，如心功能不全时，肝淤血可使ALT、AST明显升高：
某些药物如异烟肼、氯丙嗪等可不同程度的损害肝细胞，引起ALT的升高。
（5）骨骼肌损伤、多发性肌炎等亦可引起转氨酶升高。
（四）连续监测法测定血清门冬氨酸氨基转移酶（AST）
1.原理：
在340nm处监测吸光度的下降速率，从而计算AST活性。
2.生理变异：
较小
3.参考值：
成人＜45U/L
4.临床意义：
（1）主要用于诊断AMI；
（2）AST也是肝炎患者的观察指标，且AST/ALT比值对判断肝炎的转归特别有价值。
常见急性ALT和AST及其同工酶的变化
疾病
ALT
AST
AST/ALT
病毒性肝炎
明显升高，随病情而异可达正常上限10～100倍
同ALT，较ALT轻且恢复早
＜1.0
重症肝炎
升高正常上限20倍内，有酶胆分离现象
升高超过ALT
＞1.0
肝硬化
常轻度增高
升高超过ALT
＞1.0
梗阻性黄疸
轻度升高
同ALT
常＜1.0
溶血性黄疸
无变化
无变化
心肌梗死
轻度升高
明显升高，与CK和LD比较，无优点
＞1.0
肌肉损伤
正常或轻度升高
急性期可轻度升高
＞1.0
（五）连续监测法测定血清碱性磷酸酶（ALP）
人体各组织ALP同工酶可分为3类，即胎盘ALP、肠ALP、肝/骨/肾ALP。
目前ALP主要用于骨骼和肝胆系统疾病的诊断和鉴别诊断，尤其是黄疸的鉴别诊断。
1.原理：
以磷酸对硝基酚为底物，二乙醇胺为磷酸酰基的受体。
在碱性环境下，ALP催化4-NPP水解产生游离的对硝基酚，对硝基酚在碱性溶液中转变成黄色。
根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。
2.生理变异：
ALP变化与年龄密切相关，新生儿ALP略高于成年人，以后逐渐增高，在1～5岁有一次高峰，可达成年人上限2.5～5倍，以后下降。
第二高峰在10～15岁之间，可达成人上限4～5倍。
20岁后降至成年人值，到老年期又轻度升高，可能与生理性的激素变化有关。
孕妇血清ALP在妊娠3个月即开始升高，9个月可达峰值，约为正常值的2倍，可维持到分娩后1个月，升高的ALP来自胎盘，和胚泡壁的细胞滋养层的发育程度直接相关。
高脂餐后，血清ALP活性升高（多为小肠ALP）。
无黄疸肝脏疾病患者血中发现有ALP升高应警惕有无肝癌可能。
3.参考值：
女性，1～12岁＜500U/L；＞15岁，40～150U/L；
男性，1～12岁＜500U/L；12～15岁，＜750U/L；＞15岁，40～150U/L。
4.临床意义：
（1）血清ALP活性升高：
见于骨Paget病、胆道梗阻、恶性肿瘤骨转移或肝转移、佝偻病、骨软化、成骨细胞瘤、甲状旁腺功能亢进及骨折愈合期。
（2）血清ALP活性降低：
比较少见，主要见于呆小病，磷酸酶过少症，维生素C缺乏症。
甲状腺功能低下、恶性贫血等也可见血清ALP下降。
（六）连续监测法测定血清γ-谷氨酰基转移酶（GGT）
1.原理
2-硝基-5-氨基苯甲酸，可使410nm处吸光度增高。
吸光度增高速率与GGT活性呈正比例关系。
2.生理变异：
男性血中GGT含量明显高于女性，可能与前列腺有丰富的GGT有关。
酗酒会引起GGT明显升高。
2.参考值：
男性：
11～50U/L（37℃）
女性：
7～30U/L（37℃）
3.临床意义：
（1）尿中GGT活性有助于诊断肾小管疾患。
（2）GGT主要用于诊断肝胆疾病。
原发性肝癌、胰腺癌和乏特氏壶腹癌时，血清GGT活性显著升高，特别在诊断恶性肿瘤患者有无肝转移和肝癌术后有无复发时，阳性率可达90%。
GGT同工酶Ⅱ与AFP联合检测可使原发性肝癌AFP检测的阳性率明显提高；
GGT在反应慢性肝细胞损伤及其病变活动时比转氨酶敏感，在急性恢复期若ALT已经正常，而GGT活性持续升高提示肝炎慢性化。
（3）嗜酒或长期接受某些药物如苯巴比妥、苯妥英钠、安替比林时，血清GGT活性常升高。
口服避孕药会使GGT值增高20%。
（七）淀粉酶（AMY）测定
1.方法：
（1）碘-淀粉比色法测定
（2）对-硝基苯麦芽七糖苷法
PNP（对-硝基苯酚）的生成引起405nm处吸光度的上升，上升速率与AMY的活力成正比。
（3）2-氯-4-硝基苯麦芽三糖苷法：
CNP（2-氯-4-硝基苯酚）的生成引起405nm处吸光度的上升，上升速率与AMY的活力成正比。
2.生理变异：
成年人血中AMY与性别、年龄、进食关系不大，新生儿AMY缺乏，满月后才出现此酶，逐步升高，约在5岁时达到成人水平，老年人AMY开始下降，约低25%。
3.参考值：
碘-淀粉比色法：
血清80～180U/L；尿液100～1200U/L
对-硝基苯麦芽七糖苷法：
血清淀粉酶：
220U/L（37℃）
尿淀粉酶：
1200U/L（37℃）
4.临床意义：
1）升高：
1）急性胰腺炎时，血和尿中的AMY显著增高。
发病后8～12h血清AMY开始增高，12～24h达高峰，2～5d下降至正常。
尿AMY约于发病后12～24h开始升高，下降比血清AMY慢，因此，在急性胰腺炎后期测定尿AMY更有价值。
碘-淀粉比色法结果如超过500U有意义，达350U时应怀疑此病。
2）流行性腮腺炎
3）急性阑尾炎、肠梗阻、胰腺癌、胆石症、溃疡病穿孔及吗啡注射后等均可见血清AMY增高，但常低于500U。
（2）降低：
正常人血清中AMY主要由肝脏产生，故血清与尿中AMY同时减低主要见于肝炎、肝硬化、肝癌及急性和慢性胆囊炎等。
（八）比色法测定酸性磷酸酶（ACP）
1.方法：
（1）麝香草酚酞比色法：
现少用。
（2）连续监测法：
测定在405nm吸光度的变化速率来计算ACP的活性。
前列腺酸性磷酸酶可被酒石酸抑制。
2.生理变异：
男、女性血中ACP含量无差异，新生儿ACP活性与成人相似，出生后1个月中血清酶活性甚高，然后随年龄的增长而逐渐下降，青春期又可出现一活性峰值，至20岁降至成人水平。
3.参考值：
成人总酶活性为0～9U/L
前列腺酸性磷酸酶为0～3U/L（连续监测法）
4.临床意义：
临床血清ACP测定主要用于前列腺癌的辅助诊断及疗效观察指标。
前列腺癌，特别是有转移时，血清ACP可明显升高，前列腺酸性磷酸酶更有意义。
溶血性疾病、变形性骨炎、急性尿潴留及近期作过直肠检查者，此酶亦可轻度增高。
（九）CK、LD同工酶检测原理及临床意义
1.琼脂糖电泳法测定LD同工酶
（1）原理：
当有LD活性的区带存在即显紫红色，颜色深浅与酶活性成正比。
（2）临床意义：
1）急性心肌梗死发作后早期，血清中的LD1和LD2活性均升高，而LD1升高更早，更明显，可致LD1/LD2比值增高。
2）活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎及某些溶血性疾病，如镰形细胞贫血，恶性贫血等，肾坏死、假性肥大性肌营养不良等，LD1及LD2的活性均升高。
3）当急性肺部病变、白血病、胶原病、心包炎、病毒感染等LD2及LD3增高。
而恶性病时，LD3也常增高。
4）肝炎、急性肝细胞损害及骨骼肌损伤时LD5常常增高。
而当心肌梗死并发充血性心力衰竭时，LD5也可升高。
2.琼脂糖凝胶电泳法测定血清肌酸激酶同工酶
CK同工酶：
CK-BB、CK-MB、CK-MM、CK-Mt。
（1）原理：
在电泳时，CK-BB迁移最快，CK-MB居中，CK-MM最慢，CK-Mt迁移率最低，位于CK-MM之后。
电泳后进行酶促反应显色，观察结果。
也可用四氮唑盐显色法，即利用酚嗪二甲酯硫酸盐（PMS）将NADPH的氢传递给氯化碘代硝基四唑（INT），生成不溶性有色化合物，显示CK同工酶区带，用可见光扫描检测。
（2）临床意义：
CK-BB：
脑、前列腺、肠、肺、膀胱、子宫、胎盘及甲状腺中。
CK-MM：
骨骼肌及心肌
CK-MB：
心肌
1）CK-MB是诊断急性心肌梗死最有价值的生化指标。
此同工酶对诊断心肌梗死的特异性可高达100%。
2）心肌梗死以外的心脏疾患有时也可有血清CK-MB的轻度升高。
诸如室上性心律不齐、心包炎、心肌炎、心绞痛和充血性心衰等，其升高机制可能和心肌细胞膜通透性增加有关。
3）肌营养不良：
肌肉创伤、皮肌炎患者CK-MM明显增高虽CK-MB也升高，但不超过总CK活性5%。
多次肌肉注射的患者也可有CK-MM升高。
临床各系统疾病的酶学诊断
一、肝脏疾病
诊断肝实质细胞受损的酶：
ALT、AST、LD（LD5）
反映肝细胞合成功能的酶：
ChE、LCAT、凝血酶原
诊断胆道梗阻的酶：
ALP、GGT
二、骨骼及骨骼肌疾病
诊断骨骼疾病：
ALP
诊断骨骼肌疾病：
CK（CK-MM）、AST、LD（LD5）
三、胰腺疾病：
AMY、LPS
四、前列腺疾病：
ACP
五、心肌酶谱：
CK-MB：
AMI诊断的金指标
ASTm：
判断预后
LD：
LD1＞LD2
例题
下列属于血浆特异酶的是
A.胆碱酯酶
B.胰蛋白酶
C.胃蛋白酶
D.乳酸脱氢酶
E.胰淀粉酶
[答疑编号700812050301]
正确答案：
A
不影响细胞酶释放的因素是
A.各种酶的测定波长及反应速率
B.细胞内外酶浓度的差异
C.酶的相对分子量
D.酶的组织分布
E.酶在细胞内的定位和存在形式
[答疑编号700812050302]
正确答案：
A
“酶胆分离”通常是哪种疾病的征兆
A.急性心肌梗死
B.重症肝炎
C.肌肉损伤
D.溶血性黄疸
E.病毒性肝炎
[答疑编号700812050303]
正确答案：
B
临床上常用于分析同工酶的方法是
A.蛋白酶水解法
B.沉淀法
C.电泳法
D.层析法
E.热失活分析法
[答疑编号700812050304]
正确答案：
C
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