高效液相色谱仪校验规程.docx
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高效液相色谱仪校验规程
标准文件
Standarddocument
文件编号
DocumentNo.
SOP-LOP-790-8/00
高效液相色谱仪校验规程
CalibrationSOPforHPLC
页码
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状态
Status
正式
Formal
备份号
ControlNo.
起草人
Writtenby
起草日期
Writtendate
年月日
颁发部门
Issueddepartment
质量管理部
Qualitydepartment
审核人
Reviewedby
审核日期
Revieweddate
年月日
批准人
Approvedby
批准日期
Approveddate
年月日
生效日期
Effectivedate
年月日
分发部门Distributeddepartment：
质量负责人质量管理部QAQC
1、目的Objective：
建立高效液相色谱仪内部校验规程，确保校验工作规范、顺利进行。
2、范围Scope：
本规程适用于本公司使用的高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器/二极管阵列检测器）的校验。
3、职责Responsibilities：
3.1培训职责：
本文件起草人或审核人或批准人负责对质量管理部全体人员培训。
3.2QC：
负责制定本规程，并对本规程的实施负责。
3.3QA：
负责监督和检查本规程的实施。
4、定义Definition：
无。
5、程序Procedures：
5.1依据
国家计量校验规程JJG705-2002液相色谱仪，安捷伦液相说明书，岛津液相说明书。
5.2备件及材料
5.2.1水：
HPLC级水。
5.2.2化学试剂：
乙腈（HPLC）、丙酮（分析纯）。
5.2.3咖啡因标准品。
5.2.4咖啡因标样。
0.005mg/ml,0.010mg/ml,0.025mg/ml,0.050mg/ml,0.125mg/ml和0.250mg/ml咖啡因水溶液。
5.2.5色谱柱：
4.6mm×250mm，C18，5µm。
5.2.6容量瓶：
10ml。
5.2.7玻璃注射器。
5.2.8限流阻尼管。
5.2.9分析天平。
5.2.10秒表。
5.2.11热电偶
5.3校验项目及技术指标
5.3.1泵性能的测试
表1
校验项目
指标
流量设定值（ml/min）
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
流量设定值误差，|SS|＜
5%
2%
2%
2%
2%
流量稳定性误差，SR＜
3%
2%
2%
2%
2%
5.3.2柱温箱温度稳定性测试*
表2
校验项目
指标
温度设定值（℃）
20
25
30
35
40
温度设定值误差
|△T|＜2℃
控温稳定性误差
TC≤1℃
备注：
如药典专论规定的特定柱温，不在以上温度范围之内，则对分析该品种的仪器增加该温度点校验，校验项目和可接受指标相同。
5.3.3检测器性能测试
表3
校验项目
指标
基线噪声：
≤5×10-4AU
基线漂移：
≤5×10-3AU/h
波长准确度：
|△λ|≤2nm
线性测试：
相关系数R
响应因子f的RSD
≥0.999
≤5.0%
5.3.4进样器性能测试
表4
校验项目
指标
进样器精密度测试：
定性重复性（Rt）RSD定性
≤1.0%
定量重复性（峰面积）RSD定量
≤2.0%
自动进样器线性测试*：
相关系数R
响应因子f的RSD
≥0.999
≤5.0%
5.3.5梯度组成的测试*
表5
校验项目
指标
梯度准确度
|TSH-MSH|≤2%
梯度准确度的精密度
≤0.5%
注：
*表示该项目的内部校验取决于仪器的配置，有该配置则为必检项目。
5.4校验方法
5.4.1校验通则
5.4.1.1HPLC的内部校验由仪器所属部门经培训的使用者按本规程进行校验，其校验项目依仪器配置和使用范围而定。
5.4.1.2政府部门每一年对HPLC进行校验，每六个月内部对HPLC进行一次校验；仪器配置的关键部件大修或更换后，可参考本规程对该部件相关的项目进行校验，以对仪器的性能进行确认。
5.4.1.3校验时，同时检查、确认仪器的安装，使用环境符合要求，仪器处于正常的状态下，并检查、确认仪器的接线牢固，接地良好。
5.4.1.4不同配置的仪器，须按照规定的校验项目及指标进行内部校验，以保证该仪器的所有使用功能均进行了校验。
5.4.2泵性能的测试－SS和SR的测定
5.4.2.1测试条件：
流动相：
水；
色谱柱：
限流阻尼管。
5.4.2.2测试：
分别设定流速为0.5ml/min，1.0ml/min，1.5ml/min，2.0ml/min，2.5ml/min等值进行校验，这些流速覆盖了实验室使用的流速范围。
待流速稳定后，在流动相流出口处用容量瓶准确地收集流动相10.0ml，同时用秒表计时，各测量3次，按公式
（1）、
（2）计算S
S和SR，并以下表所列内容记录测试数据和结果。
表6泵性能的测试
泵流量设定值：
流动相体积：
次数
项目
1
2
3
收集时间t（秒）
流量实测值Fm（ml/min）
泵流量设定值误差SS
泵流量稳定性误差SR
5.4.3柱温箱温度稳定性测试—△T和Tc的校验
5.4.3.1测试
将测温仪之热电偶固定在柱温箱中央，关好柱箱门。
以限流阻尼管替代色谱柱，分别设定柱温箱温度为20℃，25℃，30℃，35℃，40℃等值进行校验，这些温度覆盖了实验室使用的柱温范围。
待测温仪指示温度稳定后，记录温度显示值，每隔5分钟测一次，每个温控点测定1小时，求出平均值，并以下表所列内容记录测试数据和结果。
设定值与平均值之差为设定值误差△T，13次测量值中最大值与最小值之差为控温稳定性误差Tc。
表7柱温箱温度稳定性测试
温度设定值：
次数
项目
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
平均值
温度实测值℃
设定值误差△T
稳定性误差Tc
5.4.4检测器性能测试
5.4.4.1基线漂移和基线噪声的测试
5.4.4.1.1测试条件
检测波长：
254nm；
流动相：
水；
流速：
1.0ml/min；
色谱柱：
4.6mm×250mm，C18，5µm。
5.4.4.1.2测试
按不同的仪器配置，设定检测器的灵敏度为较灵敏值。
待系统平衡后，调整基线在图谱的中部位置，记录基线30分钟。
以图谱显示的刻度值或灵敏度与积分仪的匹配关系，计算基线噪声和漂移值。
基线噪声为峰－峰噪声，选择最大的噪声作为基线噪声。
计算方法：
基线噪声＝图谱单位距离对应的吸光度AU×噪声峰－峰间的垂直距离。
漂移值为30分钟内噪声的最高值和最低值之间垂直距离L对应的吸光度AU。
计算方法：
漂移值＝图谱单位距离对应的吸光度AU×L/0.5h。
5.4.4.2波长准确度的测试
5.4.4.2.1DAD/PDA的测试
取咖啡因标样2）进样，记录色谱图和200nm～400nm范围内的紫外吸收图谱，其205nm处的最大吸收处波长与205nm比较，其273nm处的最大吸收处波长与273nm比较，最小吸收处的波长与245nm比较，三波长处的差值|△λ|均应≤2nm。
5.4.4.2.2UV检测器的测试
a.具备紫外图谱扫描功能的检测器：
以水流过流通池时作一空白扫描，然后，以手动方式将咖啡因标样2）注入流通池，扫描200nm～300nm范围内的紫外吸收图谱。
记录咖啡因最大吸收和最小吸收处的波长，其205nm处的最大吸收波长与205nm比较，其273nm处的最大吸收波长与273nm比较，最小吸收波长与245nm比较，三波长处的差值|△λ|均应≤2nm。
b.不具备紫外图谱扫描功能的检测器：
以水注入流通池调零，然后，将咖啡因标样2）注入流通池，通过设定不同波长，记录205nm、245nm、273nm三个波长上下各5个nm范围内的吸收度A或流通池参比能量R与样品能量S的比值，205nm、273nm波长处各取该波长范围内最大的吸收值或比值对应的波长为测定波长；245nm波长处取该波长范围内最小的吸收值或比值对应的波长为测定波长。
测定波长分别与对应的波长205nm、245nm、273nm比较，三波长处的差值|△λ|均应≤2nm。
5.4.4.2.3线性测试
a．测试条件
流速：
1.5ml/min；流动相：
水-乙腈=85：
15；检测波长：
273nm；
色谱柱：
4.6mm×250mm，C18，5µm。
b．测试
待系统平衡后，分别取咖啡因标样1）、2）、3）、4）、5）、6），手动进样器依仪器配置之定量环的体积进样，记录色谱图。
以标样浓度Ci为横坐标，以咖啡因峰面积Ai为纵坐标作线性回归，得其线性方程及相关系数R。
对各标样浓度的响应因子fi进行数理统计，按公式（3）计算其RSD。
其中fi=Ci/Ai。
5.4.5进样器性能测试
5.4.5.1定性、定量重复性的测试
a.测试条件
流速：
1.5ml/min；
流动相：
水-乙腈=85：
15；
检测波长：
273nm；
色谱柱：
4.6mm×250mm，C18，5µm。
b.测试
取咖啡因标样5）（浓度为0.125mg/ml），自动进样器以5μl，10μl，20μl的体积各连续进样6次；手动进样器依仪器配置之定量环的体积连续进样6次，记录色谱图，以咖啡因峰的保留时间和峰面积，按公式（3）计算相对标准偏差RSD，并以下表所列内容记
录测试数据和结果。
表8定性、定量重复性的测试
进样体积
次数n
1
2
3
4
5
6
平均值
RSD
保留时间（min）
峰面积
5.4.5.2线性测试
a．测试条件
流速：
1.5ml/min；
流动相：
水-乙腈=85：
15；
检测波长：
273nm；
色谱柱：
4.6mm×250mm，C18，5µm。
b．测试
取咖啡因标样3）（浓度为0.025mg/ml），分别以5μl，10μl，15μl，20μl，25μl的体积进样，记录色谱图。
以进样体积Vi为横坐标，以咖啡因峰面积Ai为纵坐标作线性回归，得其线性方程及相关系数R。
对各进样体积对应的响应因子fi进行数理统计，按公式（3）计算其RSD。
其中fi=Vi/Ai。
5.4.6梯度组成测试
5.4.6.1测试条件
流速：
2.0ml/min；
流动相1：
水；
流动相2：
0.5%丙酮的水溶液；
检测波长：
265nm；
色谱柱：
限流阻尼管。
5.4.6.2测试
以限流阻尼管替代色谱柱，以流动相1平衡系统，通道A、B匹配（或通道C、D匹配），按下表之梯度程序，平行测试3次，记录色谱图。
将色谱图按0%到100%B（或D）重新标定刻度，以测定每个梯级的理论高度（TSH）与实测高度（MSH），见图1“梯度组成准确度示意图”，其差值（TSH-MSH）即为准确度，以%B（或D）单位表示。
取3次测定中50.0%B、6.0%B和5.0%B（或D）等值的准确度进行数理统计，计算其准确度的精密度SD。
表9梯度测试程序表
时间（分）
%通道A（或C）：
流动相1
%通道B（或D）：
流动相2
1.00
100
0.0
1.01
0.0
100
6.00
0.0
100
6.01
10.0
90.0
9.00
10.0
90.0
9.01
11.0
89.0
12.00
11.0
89.0
12.01
49.0
51.0
16.00
49.0
51.0
16.01
50.0
50.0
19.00
50.0
50.0
19.01
94.0
6.0
23.00
94.0
6.0
23.01
95.0
5.0
26.00
95.0
5.0
26.01
100.0
0.0
图1梯度组成准确度示意图
5.5计算公式
SS=（Fm-Fs）/Fs×100%
（1）
SR=（Fmax-Fmin）/F×100%
（2）
其中：
Fm=10.0×60/t为流量实测值（ml/min）t：
收集流动相的时间（秒）
Fs，Fmax，Fmin，F：
分别为同一组测量中流量设定值、流量最大值、最小值、平均值（ml/min）
RSD=
×
×100%（3）
SD=
（4）
5.6结果及结论
每台HPLC校验完毕，由QC主管对校验记录和结果进行复核，无误后，依据该HPLC的配置，发出校验报告，并交领导审核。
6、参考资料References：
无。
7、相关文件和记录DocumentsandRecords：
无。
8、变更/修订记录Changes/revisionrecords：
文件编号
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生效日期
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变更/修订的原因、依据及详细变更内容
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2012.02.07
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