血清脂类测定.docx
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血清脂类测定
血清脂类测定
血浆中的脂类包括胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。
目前,对有关脂类代谢疾患的诊断和治疗过程,均必须检测血浆(清)中的脂类,通过其含量的变化,对临床疾患提供协助诊断的依据。
有关医学科研工作,脂类的定量检测也是一项必备的研究项目。
1.胆固醇测定
血浆中胆固醇及其酯的含量检测,从方法学上可分为两大类:
一类是化学法包括抽提法和直接测定法,这类方法目前仍在沿用;另一类是酶法测定,方法敏感特异快速,并能自动化分析,已常规应用。
化学测定法种类多,由于显色反应的特异性不同,其结果有一定的差异。
目前公认的参考方法是Abell-Kendall(L-B反应)法。
另外,三氯化铁-硫酸反应法(Zak法)具有显色稳定法、操作简便、灵敏度约5倍于L-B反应法,胆固醇酯与游离胆固醇显色程度比较接近等优点,缺点是特异性差,干扰因素比L-B法多,如冰醋酸中含有的乙醛酸,血清样品中的血红蛋白,胆红素以及硫酸的质量等因素均可影响Zak方法的准确性,Zak法更适合于科研使用。
酶法测定血清胆固醇的方法已被广泛采用,国产试剂已能满足临床的需要。
胆固醇测定用的标准品,按美国国家标准局(NBS)出品纯度达99.8%,是国际公认的参考物,国内李健斋等已纯化制成符合这一要求的胆固醇纯品,已供临床检测血清胆固醇使用。
2.甘油三酯测定
血浆甘油三酯的测定,目前多以化学法和酶法定量。
化学法测定甘油三酯是以脂蛋白变性,水解成甘油,并以甘油为计算依据。
酶法是以特异酶水解甘油三酯,除去脂肪酸,再测定甘油,方法特异,准确而快速,临床广为应用。
目前甘油三酯测定的方法主要以定量甘油为依据,然而血清样品中存在有游离甘油,如何从反应过程中的总甘油中减去游离甘油,多年来一直在研究讨论这一问题。
若不减去,其测定值将会高于血清样品中的真值,如果要减去,就必须先测出血清样品中的游离甘油,甘油三酯的测定方法将增加一个繁杂的步骤,实际工作中难以做到。
有报道血清样品中的游离甘油实际量是0.07~0.13mmol/L,相当于甘油三酯的0.5~6.0mmol/L,为此建议,实测的甘油三酯量减去一个校正系数即:
甘油三酯(mmol/L)=[0.98×总甘油(mmol/L)]-0.07(mmol/L)。
这一校正系数也仅适用于健康人,对临床病人并不一定适用。
据报道,血清样品的游离甘油一直是个未知数,无法测准。
为此,目前临床测定血清甘油三酯时,基本上未考虑游离甘油,因为其含量很少,暂且忽略不记。
甘油三酯测定的参考物,推荐三油酸甘油酯和三软脂酸甘油酯混合物(2:
1,W/W),此参考物适用于化学法。
在酶法测定中,仍以高纯度的三油酸甘油酯为参考物。
3.磷脂测定
血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神经磷脂、脑磷脂和其他少量磷脂。
如需要分别检测各种磷脂,可以通过薄层层析法、柱层析法和高压液相色谱法。
目前,临床仅测定血清磷脂总量。
血清磷脂总量的测定方法有化学方法和酶法两大类。
化学法是以磷脂中的磷为定量依据,因为每磷脂分子中都含有一个磷酸根,故将磷脂的磷称为脂性磷。
由于血清中磷脂大部分为卵磷脂,其分子量中磷约占4%,故将脂性磷换算成磷脂的系数,一般为25。
由于化学法均需要抽提,再测抽提液中的磷脂的磷,血清中的磷酸盐不可能混入抽提液中,因此血清中的磷酸盐对磷脂测定的干扰很少。
酶法是利用磷脂酶进行定量测定。
生物体中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四种。
磷脂酶D特异性差,均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神经磷脂,三者约占血清总磷脂的95%,临床多用含磷脂酶d的试剂进行磷脂的定量测定。
4.游离脂肪酸测定
游离脂肪酸属于未酯化的一类脂肪酸,故又称为非酯化脂肪酸,其量很少,采用方法必须是灵敏的方法,还需要避免脂肪水解产生脂肪酸的干扰。
测定方法有:
①滴定法需要微量滴定装置,因为要通过肉眼观察颜色,难免会有主观因素的影响,所以难以测定准确,很难用于常规;②光度法,以铜皂法常用;③酶法,主要采用特异性不强的脂肪酶D进行检测,方法特异,快速准确,已常规应用于临床。
第一节 胆固醇测定
血清中胆固醇包括CE和FC,酯型的CE占70%,FC占30%。
CE中的C3的-OH在LCAT作用下,可分别结合亚油酸(43%)、油酸(24%)、软脂酸(10%)、亚麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸结合而成。
血清中胆固醇在LDL中最多,其次是HDL和VLDL、CM最少。
血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。
1.化学法
化学法一般包括:
①抽提;②皂化;③毛地黄皂苷沉淀纯化;④显色比色四个阶段。
代表性的方法有Sperry-Webb法,通过①~④步骤操作过程。
常规操作中多采用省去了②、③。
或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法,现将此法作为标准参考方法予以引用。
2.酵法测定
CE在胆固醇酯酶(cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA,TC再经胆固醇氧化酶(cholesteroloxidase,COD)氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。
再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量,或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。
该法是目前常规的应用方法,快速准确,标本用量少,便于自动生化分析仪作批量测定。
一、Abell-Kendall改良法
1.原理
血清加入醇溶性氢氧化钾,使胆固醇从脂蛋白中分离出来,同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇,加石油醚振摇、抽提,使胆固醇移入石油醚层,分离并取一定量的石油醚层,蒸发至干,再进行Liebermann-Burchard显色反应,620nm比色定量。
该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。
2.试剂组成
代号
种类
浓度
组 成
贮存2~8℃
有效时间
R1
乙醇
优质纯
R2
石油醚
沸点68℃,特级纯
R3
水醋酸
分析纯
R4
无水醋酸
胆固醇分析用,不含HCI
R5
浓硫酸
分析纯
R6
KOH液
33%(W/W)
KOH10g+H2O20ml
R7
乙醇性KOH液
R194ml+R66ml
临用前配制
R8
Liebermann
配制后
Burchard
R420体积+R51体积+R310体积
1h
试剂*
内用完
R9
胆固醇标准液
5.17mmol/L
胆固醇标准品200mg+R1→100ml
0
*:
在三角烧瓶内,加入无水醋酸,于冰水中冷至10℃以下,再慢慢加入浓硫酸,混合,静置10min,又加冰醋酸混匀,备用。
3.操作
图15-1血清胆固醇(Abell法)测定操作图
按图15-1操作。
4.计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
二、酶法(CEH、COD-POD法)
首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸,胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下,生成△4-胆甾烯酮和H2O2,再H2O2经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)参与下,生成红色醌亚胺色素。
H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素
(一)手工测定法
1.试剂组成
代号
种类
浓度
组成
贮2~8℃
有效时间
Na2HPO4
50mmol/L
Na2H2PO4
50mmol/L
胆酸钠
3mmol/L
4-氨基安替比林
0.82mmol/L
R1*
ESPAS
14mmol/L
24h
Carbowax-6000
0.17mmol/L
CEH
33U/L
COD
117U/L
POD
6700U/L
R2
标准液
5.17mmol/L
用异丙醇溶解胆固醇
*混匀,调pH至6.70±0.10(25℃),或购买试剂盒。
酶以活性单位表示。
2.操作
按图15-2操作。
3.计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
(二)自动化分析仪测定
以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。
1.试剂组成
A液:
CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。
B液:
COD、4-氨基安替比林等。
图15-2血清胆固醇测定(酶法)操作图
2.上机参数
项 目
参 数
方 法
终点法
波 长
双波长(540nm,700nm)
反应温度
37℃
试剂A反应时间
2~3min
试剂B反应时间
5~6min
样本用量
3μl
试剂A用量
250μl
试剂B用量
120μl
单位
mmol/L
3.操作过程
4.计算
以△A=A2-A1,根据同样处理之标准或质控物计算,打印结果。
5.注意事项
(1)试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。
(2)试剂在有效内2~8℃避光食保存。
(3)胆固醇含量超过200mmol/L,需用生理盐水稀释再测。
第二节 甘油三酯测定
甘油三酯又称中性脂肪,由于其甘油骨架上分别结合了3分子脂肪酸、2分子脂肪酸或1分子脂肪酸,相应称为甘油三酯(TG)、甘油二酯(DG)和甘油一酯(MG)。
血清中90%~95%是TG,TG中结合的脂肪酸分别为油酸(44%)、软脂酸(26%)、亚油酸(16%)和棕榈油酸(7%)。
血清TG测定方法一般分为物理化学法、化学法及酶法三大类。
血清中TG的化学组成并不单一,准确求其分子较为困难。
因标准不同,测定结果存在差异。
化学法多采用三棕榈精(软脂精)(分子量807.3)、三油精(分子量895.4)为标准,按摩尔浓度计算。
酶法测定以三油精为标准物进行换算。
1.化学法
化学测定法包括:
①TG的抽提分离;②皂化;③甘油糖的氧化;④氧化生成甲掌显色定量等四个阶段。
操作较为繁杂,影响测定因素太多,本法准确性差,一般很少用。
2.酶法测定
酶法测定包括:
①TG的抽提与皂化;②加水分解生成甘油糖定量等二个阶段。
目前常规检测应用的方法有甘油激酶(glycerolkinase,GK)法和甘油氧化酶(glycerolOxidase,GOD)法。
操作简便,快速准确,并能在自动化生化分析仪上进行批量测定。
一、乙酰丙酮法
1.原理
血清中加入异丙醇抽提取甘油三酯,经KOH皂化使甘油三酯水解生成甘油及脂肪酸,甘油在过碘酸作用下氧化成甲醛,在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色的3,5二乙酰,1,4二氢甲基吡啶,其颜色的深浅与甘油三酯的含量成正比,420nm测定定量。
该法可用于基本功训练及组织细胞TG的提取测定。
2.试剂组成
代号
种类
浓度
组成
贮2-8℃
有效时间
R1
抽提液
(CH3)CHOH(A.R)重蒸馏
R2
吸附剂
氧化铝,水洗除去微细颗粒,
110℃烤干3h以上
闭封
一周
R3
皂化剂
5%
KOH5g+H2O→100ml
R4
醋酸溶液
2mol/L
CH3COOH11.5ml+H2O→100ml
R5
过碘酸钠
0.05mol/L
NaIO41.07g+H2O→100ml
R6
氧化剂
R41体积+R51体积
一周
R7
醋酸铵液
CH3COONH215.4g+H2O→100ml
R8
显色剂
CH3COCH2COCH30.75ml+R-1
40ml+R-7100ml+R-480ml
R9
参考液
2mg/dl
三油酸甘油酯
2mg+R-1→100ml(TG100mg/dl)
3.操作
按图15-3操作。
图15-3血清甘油三酯(乙酯丙酮法)测定操作图
4.计算
血清TG浓度=ESA/EST×1.13(mmol/L)
二、酶法(GK-GPO-POD比色法)
血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸,甘油在甘油激酶(GK)及ATP存在下,生成3-磷酸甘油,尔后,在磷酸甘油氧化酶(GPO)作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成H2O2,H2O2与底物4-氨基安替比林和ESPAS在过氧化物酶(POD)作用下,生成红色亚醌化合物(quinoneimine),比色(500nm),其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。
(一)手工测定法
1.试剂组成
代号
种类
浓度
贮存2~8℃
R1
磷酸甘油氧化酶
≥3.0KU/L
冷藏
(A液)
抗坏血酸氧化酶
≥1.0KU/L
甘油激酶
≥0.7KU/L
4-氨基安替比林
80mg/L
R2
脂蛋白脂酶
≥2.0KU/L
冷藏
过氧化物酶
≥10KU/L
ESPAS
300mg/L
R3(参考液)
甘油酸三脂
200mg/dl(2.26mmol/L)
冷藏
*:
一般采用商品试剂盒
图15-4血清甘油三酯测定法(酶法)操作图
2.操作
按图15-4操作。
3.计算
血清TG浓度=ESA/EST×2.26(mmol/L)
(二)生化分析仪检测
全自动生化分析仪测定操作(以CL-7200型为例)。
1.试剂
A液:
GK,GPO,4-AA-P、抗坏血酸氧化酶等。
B液:
POD,Lipase,ESPAS等。
标准液:
甘油三油酸酯200mg/dl(2.26mmol/L)。
2.上机参数
名称
参数
方法
终点法
波长
双波长(540nm700nm)
试剂A反应时间
2~3min
试剂B反应时间
5~6min
反应温度
37℃
样本用量
4μl
试剂A用量
200μl
试剂B用量
100μl
单位
mmol/L
3.操作过程
4.计算
以△A=A2-A1并根据同样之标准或质控物计算,自动打印结果。
5.注意事项
①试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。
②试剂在有效期内2~8℃避光保存。
③样本中甘油三酯含量超过11mmol/L需用生理盐水稀释后再测。
第三节 磷脂测定
磷脂(PL)并非单一的化合物,其分子内含有磷酸基的多种脂质,磷脂是这一类物质的总称。
血中PL包括:
①卵磷脂占60%和溶血卵磷脂占2%~10%;②磷脂酰乙醇胺等,占2%;③鞘磷脂,占20%。
血清PL定量方法包括测定无机磷的化学法和酶法两大类。
1.化学测定法过程包括:
①抽提分离;②灰化;③显色、比色的三个阶段。
2.酶测定法
可分别利用磷脂酶A、B、C、D等4种酶作用,加水分解,测定其产物,对PL进行定量。
一般多采用磷脂酶D(PL-D)进行定量。
PL-D可作用于含有卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂以及含胆碱的磷脂,这三种磷脂约占血清总磷脂的95%。
本法快速准确,便于自动生化分析仪器进行批量检测。
一、化学法(消化法)
1.原理
以有机混合试剂(无水乙醇、乙醇)抽提血清中磷脂,再用浓硫酸和过氯酸消化抽提液中的脂类和其他有机化合物,用硝酸盐与磷反应生成有色化合物,比色定量。
本法可用组织细胞磷脂的抽提定量。
2.试剂组成
代号
种类
浓度
组成
贮2~8℃
有效时间
R-1
抽提液
无水乙醇:
乙醇=3:
1
R-2
消化液
用1L密器,加水约500ml,置冷水中缓缓加浓硫酸280ml到水中,冷却后加过氯酸(70%,AR)65ml,混匀,加蒸馏水至1000ml
R-3
显色剂
钼酸铵(A.R)2.5g+无水醋酸钠8.2g,加蒸馏水溶解并稀释至1L,监用时取此液体9份加新配的VitC液(10%)1份,混合即可
R-4
参考液(贮存液)1mg/L
称干燥KH2PO(A.R)0.4393g,溶于蒸馏水中,转移至100ml的容量中,用蒸馏水加至刻度。
冷藏
R-5
参考应用液
0.04mg/ml
取贮存液2ml加至50ml容量中,加水至刻度
冷藏
3.操作
按图15-5操作。
4.计算
血清脂性磷浓度=ESA/EST×10(mg/dl)
血清磷脂(以卵磷脂计)=ESA/EST×10×0.3229(mmol/L)
图15-5血清磷脂测定(消化法)操作图*采用带塞玻璃试管
二、酶法
1.原理
磷脂酶D因特异性不高,能水解血清中卵磷脂,溶血卵磷脂和神经磷脂(三者占血清总磷脂的95%),释放出胆碱,胆碱在胆碱氧化酶作用下生成甜菜碱和H2O2,在过氧化物酶作用下,H2O2,4-氨基安替比林、酚发生反应生成红色醌亚胺化合物,其颜色深浅与这三种磷脂的含量成正比,在500nm波长下比色计算结果为:
2.试剂
(1)酶应用液(参考配方):
每100mlTris-His缓冲液(50mmol/L,pH7.8)中含:
磷脂酶D
45U
胆碱氧化酶
100U
过氧化物酶
220U
4-氨基安替比林
12mg
酚
20mg
CaCl2·2H2O
8mg
TritonX-100
0.2g
(2)标准液:
纯卵磷脂,临用前配制,5mg/2.5ml蒸馏水(含TritonX-1000.5%)
3.操作
(1)标本采集:
空腹12h抽静脉血,不抗凝,分离血清或抗凝血分离血浆。
(2)在3.0ml酶应用液中加入血清(浆)20μl,标准管加标准液20μl,空白管加水20μl,放置37℃水浴10min后,波长500nm,比色,空白管液调零。
4.计算
血清磷脂(mg/dl)=TA/SA×200
血清磷脂(mmol/L)=血清磷脂(mg/dl)×0.01292
第四节 非酯化脂肪酸测定
临床上将C10以上的脂肪酸称为游离脂肪酸(freefattyacid,FFA)或非酯化脂肪酸(nonesterifiedfattyacid,NFFA),正常血清中含有油酸(18:
1,W9)占54%,软脂酸(16:
0)占34%,硬脂酸(18:
0)占6%,是其主要的NFFA。
另外还有月桂酸(12:
0)、肉豆蔻酸(14:
0)和花生四烯酸(20:
4,W6,9,12,15)等含量很少的脂肪酸。
与其他脂质比较,NFFA在血中浓度很低,其含量水平极易受脂代谢,糖代谢和内分泌机能等因素影响,血中NFFA半寿期为1~2min,极短。
血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输,属于一种极简单的脂蛋白。
测定血清NFFA法有滴定法。
比色法,原子分光光度法,高压液相层析法和酶法等。
一般多以酶法测定。
作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。
因为血中有各种脂肪酶存在,极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA,使血中NFFA值上升。
贮存标本仅限于24h内,若保存三天,其值约升高30%,使结果不准确。
1.非酶法测定
非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。
前三种方法准确性差;高压液相层析法,仪器太昂贵,不便于批量操作。
2.酶测定法
主要用脂肪酶测定。
血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A(CoA)进行定量。
酶法测定结果准确可靠,快速,易于批量检测。
测定原理如图15-6所示。
图15-6血清主要FFA酶法测定图
□:
内物质作为生成量与变化量进行测定;ACS:
乙酰CoA合成酶;MK:
肌激酶; PK:
丙酮酸激酶;POD:
丙酮酸氧化酶;DTNB:
α-磺基苯甲酸;ACO:
乙酰CoA氧化酶;ACD:
乙酰CoA脱氢酶。
一、亮度法
1.原理
血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中,形成铜皂在上层溶剂中,再用二苯卡巴肼与铜显色,进行定量。
2.试剂组成
代号
种类
浓度
组成
贮存2~8℃
有效期
R-1
抽提剂
氯仿:
庚烷:
甲醇=5:
5:
1(V/V)
R-2
缓冲液
33mmol/L
KH2PO44.539g/L100ml+Na2HPO4·2H2O5.983g/l50ml调pH至6.4
R-3
铜贮液
500mmol/L
Cu(NO3)2·3H2o12.07g加H2O→100ml
R-4
三乙醇胺
1.0mol/L
三乙醇胺10ml,加水→100ml
R-5
NaOH液
1mol/L
R-6
铜试剂
R-310ml+R-410ml+R-66ml
+H2O→100ml调pH至8.1
R-7
二苯卡
巴肼液
二苯卡巴肼(乙醇)液(4g/L)10ml+R-40.1ml
临用前配制
R-8
软脂酸标准贮存液
2mmol/L
软脂酸51.2mg溶于100mlR-1液
冷藏
R-9
R-8的应用液
500μmol/L
用R-1液稀释
冷藏
3.操作
按图15-7操作。
4.计算
血清游离脂肪酸(μmol/L)=ESA/EST×500
二、酶法
1.原理
血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸(NEFA),经酶试剂作用生成紫色化合物,其颜色深浅与NEFA含量成正比。
2.试剂组成
代号
种类
组成
浓度贮存
贮存
R1
缓冲液
磷酸缓冲液
MgCl2液
去垢剂
0.04mmol/LpH6.9
3mol/L
R2
酶/辅酶
乙酰CoA合成酶
抗坏血酸氧化酶
CoA
ATP
4-AAP
溶于10mlR1液中
≥0.3U/ml
≥1.5U/ml
0.9mmol/L
5.0mmol/L
1.5mmol/L
冷藏5日
R3
酶稀释液
苯氧乙醇
去垢剂
0.3%(V/V)
R4
马来酰亚胺
该试剂与R3等体积混合
10.6mmol/L
R5
酶试剂
乙酰CoA氧化酶
过氧化物酶
TOOS
混合上述试剂,再等体积R4试剂混合
≥10U/ml
7.5U/ml
0.2mmol/L
冷藏5日
R6
标准液
1mmol/L
冷藏
*应用带玻塞离心管
3.操作
按图15-8操作。
4.计算
图15-7血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图
图15-8血清非脂化脂肪酸测定(酶法)操作图
(胡汉宁 储建中)
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