酶活性测定.docx

酶活性测定.docx

《酶活性测定.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶活性测定.docx（10页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

酶活性测定

酶活性测定

实验一植物抗氧化酶活性的测定

植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。

它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。

所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。

一、超氧化物岐化酶活性测定

超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（

）的酶，它催化下列反应：

2

反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。

已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。

【原理】

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生

，

可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲

。

后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除

从而抑制了甲

的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。

【仪器与用具】

高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。

【试剂】

1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

2．提取介质50mmol/LpH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。

3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：

称取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。

4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：

称取61.33mgNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。

5．100μmol/LEDTA-Na2溶液：

取37.21mgEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。

6．20μmol/L核黄素溶液：

取7.53mg核黄素定容至1000ml避光保存。

【材料与方法】

1．酶液提取：

取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，倒入5ml离心管中，用提取介质冲洗研钵2～3次，最后加缓冲液使终体积为5ml。

于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

2．显色反应：

取试管（要求透明度好）7支，3支为样品测定管，3支为对照管，另外1支作为空白，按表1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其他各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长；温度范围30-37度）。

【结果处理】

SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其他各管560nm波长下的吸光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。

按下式计算SOD活性：

SOD总活性（U·g-1FW）=

式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；

A0—照光对照管的吸光度值；

AS—样品管的吸光度值；

VT—样液总体积（ml）；

V1—测定时样品用量（ml）；

FW—样重（g）；

表1-1各溶液加入量

试剂（酶）

测定管用量（ml）

空白和对照管用量（ml）

0.05mol/L磷酸缓冲液

130mmol/LMet溶液

750μmol/LNBT溶液

100μmol/LEDTA-Na2液

20μmol/L核黄素

酶液

蒸馏水

总体积

1.5

0.3

0.3

0.3

0.3

0.05

0.25

3.0

1.5

0.3

0.3

0.3

0.3

加缓冲液0.05

 0.25

 3.0

【注意事项】

1.显色反应过程中要随时观察光下对照管的颜色变化，当A0达到0.6-0.8时终止反应。

2.当光下对照管反应颜色达到要求的程度时，测定管（加酶液）未显色或颜色过淡，说明酶对NBT的光还原抑制作用过强，应对酶液进行适当稀释后再显色，以能抑制显色反应的50%为最佳。

3.植物组织中的酚类物质对测定干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时刻加入聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）消除之

【思考题】

1．在SOD测定中为什么设照光对照管和暗中空白管？

2．影响本实验准确性的主要因素是什么？

应如何克服？

二、过氧化氢酶活性的测定（采用滴定法）

【原理】

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。

根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与用具】

紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶；0.5ml刻度吸管；2ml刻度吸管；10ml试管；恒温水浴锅；

【试剂】

1.0.2mol／LpH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）；

2.0.lmol／LH2O2：

市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml。

（用0.1mol／L高锰酸钾标定）。

【材料与方法】

1．酶液提取：

称取剪碎的植物样品1.0g置研钵中，加入2~3ml4℃下预冷的pH7.8磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10ml刻度试管中，并用缓冲液冲洗研钵2～3次，合并冲洗液，并定容到刻度，摇匀。

取部分提取液在4000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。

2．测定：

取10ml试管4支，其中3支为样品测定管，1支为对照管，按表2顺序加入试剂。

表1-2各溶液加入量

管号

S1

S2

S3

S0对照

粗酶液（ml）

0.2

0.2

0.2

0.2（煮死酶液）

pH7.8磷酸（ml）

1.5

1.5

1.5

1.5

蒸馏水（ml）

1.0

1.0

1.0

1.0

25℃预热后，逐管加入0.3ml0.1mol／L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中（可在比色杯中直接加H2O2），240nm下测定吸光度（蒸馏水调零），每隔lmin读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

【结果处理】

以lmin内A240减少0.1为1个酶活单位（U）。

过氧化氢酶活性（U/gFW/min）=

式中Aso—加入煮死酶液的对照管吸光值；

Asl,As2,As3—样品管吸光度值；

Vt—粗酶提取液总体积（ml）；

V1—测定用粗酶液体积（ml）；

FW—样品鲜重（g）：

0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）：

t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

【注意事项】

1.所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。

2.凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

【思考题】

1．影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?

2．过氧化氢酶与哪些生化过程有关?

三、过氧化物酶活性的测定

过氧化物酶（POD）通过催化酚类物质与H2O2反应生成醌类来清除植物体内的H2O2。

过氧化物酶还与生长素、NADH、NADPH的氧化有关，在植物代谢中起着重要作用。

【原理】

愈创木酚（邻甲氧基苯酚）可作为过氧化物酶的底物，与H2O2反应生成茶褐色产物。

该物质在470nm处有最大吸收峰，故可利用分光光度计测定过氧化物酶的活性。

【仪器与用具】

紫外分光光度计；离心机；研钵；5ml量筒；25ml容量瓶；微量进样器；秒表。

【试剂】

1.100mmol／LPH6.0磷酸缓冲液。

2.反应混合液：

100mmol／LPH6.0磷酸缓冲液50ml于烧杯中，加入愈创木酚

28μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μL，混合均匀，保存于冰箱中。

【材料与方法】

1.酶液的提取称取剪碎的植物样品2.0g置研钵中，加适量的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，将匀浆全部转入离心管中，以4000g离心10min，上清液转入25ml容量瓶。

沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶，定容至25ml，低温下保存备用。

（酶浓度太高，样品数可少至1g）

2.过氧化物酶活性的测定

取两个光径1cm比色杯，于1个比色杯中加入反应混合液3ml和磷酸缓冲液1ml，作为较零对照；另一个比色杯中加入反应混合液3ml和粗酶液1ml（如酶活力过高可适当稀释），立即开启秒表记录时间，于470nm进行比色测定，每隔1min记录一次吸光度值，共记录5min，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位。

【结果处理】

以lmin内A470变化0.01为1个酶活单位（U）。

过氧化物酶活性（U/gFW/min）=△A470V/0.01WVtt

式中△A470反应时间内吸光度的变化；

V—为酶提取液总量（ml）；

Vt—为反应系统中加入的酶液量（ml）；

W—样品重（g）：

t—反应时间（min）。

四叶绿素含量的测定

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：

D=kCL

式中：

k为比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，k为该物质的比吸收系数。

各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。

测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的光密度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。

在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：

D663=82.04Ca+9.27Cb

（1）

D645=16.75Ca+45.60Cb

（2）

式

（1）、

（2）中的D663和D645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的光密度，Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度，以mg/L为单位。

解方程组

（1）、

（2），得：

Ca=12.72D663–2.59D645（3）

Cb=22.88D645–4.67D663（4）

将Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）：

CT=Ca+Cb=20.29D645+8.05D663（5）

另外，由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次光密度（D652）而求出叶绿素a、b总量：

CT=（D652×1000）/34.5（6）

在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。

Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80%丙酮提取液中三种色素含量的计算公式：

Ca=12.21D663–2.81D646（7）

Cb=20.13D646–5.03D663（8）

Cx·c=（1000D470–3.27Ca–104Cb）/229（9）

式中：

Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cx·C为类胡萝卜素的总浓度；D663、D646和D470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的光密度。

由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。

叶绿素a、b在96%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，可据此列出以下关系式：

Ca=13.95D665–6.88D649（10）

Cb=24.96D649–7.32D665（11）

Cx·c=（1000D470–2.05Ca–114.8Cb）/245（12）

【仪器与用具】

分光光度计；研钵2套；剪刀1把；玻棒；25ml棕色容量瓶3个；小漏斗3个；直径7cm定量滤纸；吸水纸；擦境纸；滴管；电子顶载天平（1/100g感量）。

【试剂】

95%乙醇（或80%丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。

【方法】

1．取新鲜植物叶片（或其他绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2．称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95%乙醇（或80%丙酮）研成匀浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置3～5min。

3．取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4．用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。

直至滤纸和残渣中无绿色为止。

最后用乙醇定容至25ml，摇匀。

5．把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。

以96%乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定光密度。

6．按公式（10）、（11）、（12）（如用80%丙酮，则按公式7、8、9）分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度（mg/L），（10）、（11）式相加即得叶绿素总浓度。

7．求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量（用mg/g鲜重或干重表示）：

叶绿体色素含量=

【注意事项】

1．为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。

2．叶绿体色素提取液不能浑浊。

可在710nm或750nm波长下测量光密度，其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时光密度值的5%，否则应重新过滤。

3．用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。

如果波长与原吸收峰波长相差1nm，则叶绿素a的测定误差为2%，叶绿素b为19%，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。

校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a和b来校正。

4．在使用低档型号分光光度计（如：

72型、125型、721型等）测定叶绿素a、b含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低（±5～7nm），与高中档仪器如岛津UV-120、UV-240等测定结果相比，叶绿素a的测定值偏低，叶绿素b值偏高，a/b比值严重偏小。

因此，使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校正。

五硫代巴比妥酸法（丙二醛含量测定）

一：

原理

丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3，5，5—三甲基恶唑-2，4。

二酮），其最大吸收波长在532nm。

但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。

植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的消光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。

二：

试剂

1：

质量分数为10％三氯乙酸（TCA）；

2：

质量分数0.6％硫代巴比妥酸：

先加少量的氢氧化钠（1mol·L-1）溶解，再用10％的三氯乙酸定容；

三：

方法

1：

MDA的提取称取剪碎的试材1g，加入2mll0％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA研磨，匀浆在4000r·min-1离心10min，上清液为样品提取液。

2：

显色反应和测定吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml0．6％TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。

取上清液测定532、600和450nm波长下的消光度。

四：

结果

C1＝11.71D450

C2＝{6.45（D532-D600）-0.56D450}NW-1

C1——可溶性糖的浓度（mmol·L-1）

C2——MDA的浓度（·umol·L-1）

D450、0532、D600分别代表450、532和600nm波长下的消光度值。

N:

提取液总体积（ml）

W:

植物组织鲜重