WB实验步骤详细总结.docx
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WB实验步骤详细总结
蛋白提取（所有操作在冰上进行）
1.裂解
1）配裂解液：
PMSF=100：
1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻）
取2ml裂解液，加20μlPMSF混匀
2）称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液体与组织比例为20：
1），冰上静置10min
2.匀浆
先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）
在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min
3.离心（在基础4楼416室）
1）自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（
，
两个标记，
加少量超纯水，
号是为了离心平衡，对称放置）
2）将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min
3）用移液枪将上层清液取出放入
号管中
4.变性（上样缓冲液：
样品=4：
1）
将样品转移至2~3个0.5mlAP管中
加上样缓冲液，100℃变性10min
仪器屏幕：
S5
00：
10
S5
100．0
00：
10
5.保存
变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用
WB实验步骤
1.清洗玻璃板：
清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
2.配制分离胶
1）准备：
1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）
2）10%分离胶的配置：
（用50ml烧杯。
1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）
5.91ml
超纯水
4.95ml
丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效
3.75ml
Ph8.8Tris▪HCL
150μl
10%SDS
150μl
AP（催化剂促凝作用）
9μl
TEMED
混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）
3.灌胶
沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止
4.水封
立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min
5.浓缩胶的配制（5%）
4.13ml
超纯水
1ml
丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效
750μl
Ph6.8Tris▪HCL
60μl
10%SDS
60μl
AP（催化剂促凝作用）
6μl
TEMED
搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝胶30min或20min
6.电泳（电泳液最多使用两次）
1）安装电泳装置
低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）
2）点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）
Mark
4μl
（Proternladder）推荐9μ，实际4μ已经足够
样品
8μl
7-10μl均可内参挑齐即可
组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪
3）连接电泳仪
电泳池与电泳盖连接：
黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳
先调电压至70mV，跑约20min。
（Mark跑开，分出彩带即可）
再调电压至120mV，跑约60min。
（不能跑过下面的玻璃板）
注：
Mark的条带从红色条带往下依次为：
70→55→40→35→20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。
用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。
放入装有转移液的皿中浸泡
7.转膜（转移液可用3-4次）
1）剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。
然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润）
2）剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上
3）“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸→胶→膜→两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）
4）安装转膜装置：
黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。
加入转膜液至满（否则仪器无法启动）
5）打开开关，调节电流至100mA，转膜2h（恒流）盆中加满冰
转膜成功标志：
胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色
8.封闭
1）
配制5%脱脂奶粉：
2.5g脱脂奶粉
50mlTBST
2）将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min（转移液回收其余清理掉，转移液可以重复利用2次）
9.一抗
1）用TBST配，每一格加5mlTBST，再分别加入抗体
抗体的量：
2l（Psmad2l）免抗
1:
1000
5μl：
5ml
58（分子量）
2l（Psmad2l）免抗
1:
500
10μl：
5ml
58
Jnk免抗
1:
1000
5μl：
5ml
双带
内参（小鼠抗GAPH）单抗，中杉金桥
1:
5000
1μl：
5ml
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2）膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）
3）4℃冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室）
10.洗脱
用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。
11.二抗
1）用3%的脱脂奶粉
1.5g的脱脂奶粉
50mlTBST
2）每格吸入5ml3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:
5000，即加入1μl
注意：
吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗
3）膜分别加入小格，慢摇1-2h（常温）
12.洗脱
用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。
13.显影：
U盘
A液，B液（显影液。
4℃保存）
200μl枪+枪头（黄）
膜（置于皿中）
1）开机后自动预冷，温度降到1-20℃才可
2）显影液现配现用（A液：
B液=1：
1）
3）膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀涂在膜上
4）先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一般显影15s（影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋白结果好坏就取决于抗体的专一性。
5）每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U盘
试剂配方：
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