RNAi技术及其实验操作.docx

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2010－1１－1414:

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RＮAi技术及其实验操作

目前对RNAi（RNA　interｆｅｒence）的定义有很多种,不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同,如果将ＲNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义:

①RNＡｉ是由dｓRＮＡ介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。

②RNAｉ是有dsRNA参与指导的,以外源和内源mＲNA为降解目标的转基因沉默现象。

具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒ＲNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。

　如果将其作为一门生物技术，则定义为:

①　RNAi　是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链ＲNA（有义RNA　和反义RNA）,从而诱导内源靶基因的mRＮA　降解,达到阻止基因表达的目的。

②ＲNAｉ是指体外人工合成的或体内的双链ＲNＡ（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的mRＮA降解成２1nt～2３nt的小片段,使相应的基因沉默。

③RNＡi是将与靶基因的mRNＡ同源互补的双链RＮA（dsRNＡ）导入细胞,能特异性地降解该mRNA　，从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默（ｐｏst－traｎscｒiptionalgeｎe　silence,PTＧS）。

ﻫ　各种不同定义虽然说法不同,但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。

也就是说,ＲNAi技术是利用RNAi为原理,在体外利用化学或酶促合成sｉRNA，也可构建在体内合成siRNA的质粒或病毒表达载体,然后利用传统微注射磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体介导转染等方法转染细胞从而致使靶基因沉默的技术。

RNA干扰有很多方法：

①化学合成法:

应用最广泛但成本昂贵，体外合成的长21nt、3｀端带有2个游离核苷酸的ｓiRNＡ较其它形式合成的RNA具有更大效率的降解目的mRNA的效果。

②siRＮA表达载体：

在质粒或病毒载体中，利用ＲNＡ聚合酶启动因子U6或T7分别控制正义链和反义链的合成并退火形成双链siRNＡ,或在启动子下游设计带发夹结构的表达单位，自身退火形成双链siＲNA。

③ｄｓＲＮA表达载体:

多用于果蝇、线虫等低等生物,在体内表达后被Dｉcer切割成21-23nt的siＲNA;或在体外利用Ｄｉcｅr、RNａseＩII切割ｄｓRＮA产生sｉRNA，纯化后使用。

ﻫ最近由于RNA干扰（RNＡ　inｔeｒfeｒeｎce，RNＡi）的发现使反义领域的研究增多。

这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的,是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。

ＲNA干扰是由长的双链RNA分子发动的,该分子可以被Ｄicerenzymｅ加工成长度为2１-23个核苷酸的ＲNA。

RNａseIＩI蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用,它对双链RNA的两个链都进行切割,酶切的产物３'末端互相重叠。

然后这种小的干扰RNA分子（smaｌlinterferingRNAs，sｉＲNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-iｎｄｕcedｓｉlencing　cｏmplｅｘ，RISC），引导核酸酶降解靶ＲＮA。

ﻫ　这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RＮA分子会引起干扰素应答。

因此Tuschi及其同事表明长度为21ｎt的siRNＡ可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破。

这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究,因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。

ﻫ有趣的是，除了短双链RＮA,短发夹RNA（shorthaｉrpｉｎRNＡ,sｈRNＡ），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成sｉRNA,从而产生RNA干扰。

这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能。

ｓhRNA可以利用RＮA聚核酶III启动子转录,在正常情况下，该启动子是控制小核RＮA（ｓmallnuclearRNA,sｎRNA）Ｕ6或者RNasｅＰ的组分H１　RNA转录的。

另外一种办法是两段短ＲNA分子分别用Ｕ6启动子转录出来。

载体介导的sｉRＮA表达使对功能缺失（loｓｓ-of－fｕnctｉon）表型进行长期分析成为可能。

在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象。

ﻫ　另外一种延长siRNＡ抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。

尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下,需要对ｓiＲＮA的稳定性进行进一步提高。

因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷。

一个5'端为两个2'-O-甲基RNA、3'端为4个甲基化核苷的siRNＡ与序列相同但是未经修饰的siRＮA比活性相同,但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。

然而,增多siRNＡ中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRＮＡ活性下降。

　RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉。

在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。

另外，Fａｓ基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNＡ干扰实验。

注射siＲNA之后，小鼠肝细胞中的ＦａｓmRNA和蛋白水平下降了10天。

把Fａs基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Faｓ特异抗体引起的爆发性肝炎，８2%用sｉＲNＡ处理的小鼠活过了1０天观察期,而所有的对照小鼠在３天之内死亡。

　上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法,不适于治疗用。

因此,标准的基因治疗所采用的方法被用于RＮA干扰。

一个反转录病毒载体被用于导入siRNA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因Ｋ-raｓ等位基因。

负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。

这项研究还表明ｓｉRNＡ的高度特异性,因为只有癌基因K-raｓ被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。

另外,当在纹状区注射表达siRNＡ的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制。

β-葡萄糖醛酸苷酶（b-glucorｏｎidａsｅ）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。

有趣的是，具有CMV启动子和最小的polｙＡ尾的RNＡ聚合酶ＩI表达元件被用于这个实验,为设计组织特异性或者可诱导的siＲNＡ载体打开了大门。

　总的来说，siRＮA的第一个体内实验已经进行,其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。

至今为止的研究没有观察到任何应用siRNＡ引起的毒性作用,但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RＮA干扰引起的严重副作用。

因为用ｓiRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的,以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。

ﻫ　　经过长期盛衰沉浮,反义技术近年来得到越来越多的注意。

对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。

由于大多数新的DNＡ类似物不能激活RNａｓeH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRＮA是否需要保留,例如,是改变剪接方式，还是降解靶ｍＲNＡ（这种情况下应该使用gapmer技术）。

可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。

一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究,一个反义药物已经在１9９8年获得批准。

一个重要的突破是发现短的双链RNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。

这个方法与传统的反义技术比效率明显更高,并且一些体内实验的数据已经发表。

因此,反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。

RＮＡi的发现

RNＡ干扰（RNAｉnterfeｒeｎce，RNAi）现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。

将与靶基因的转录产物mＲNＡ存在同源互补序列的双链RNＡ（doｕbｌeｓtrandRＮA，dsRNＡ）导入细胞后,能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失，这一过程属于转录后基因沉默机制（ｐosｔtransｃrｉptionａlｇenesiｌiｅncing，PTGS）范畴。

RNAi广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。

早在1990年进行转基因植物有关研究时偶然发现，将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性基因不能表达,但这些基因的转录并无任何影响，并将这种现象称为基因转录后沉默（ｐostｔｒanscriptioｎalgenesileｎcing，PTＧS）.1996年在脉孢菌属（Neurｏｓpora）中发现了相似现象，只不过将这种现象命名为基因表达的阻抑作用（quelling）．首次发现dsRＮA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Cａenorhabdｉtｉsｅｌegans的研究。

199５年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphｕeｓ尝试用反义RＮA去阻断pａr-1基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RＮＡ的确能够阻断pａr21基因的表达,但是奇怪的是，注入正义链RNＡ作为对照,也同样阻断了基因的表达。

这个奇怪的现象直到3年后才被解开——华盛顿卡耐基研究院的ＡndreｗFire和马萨诸塞大学癌症中心的CrａigMｅllo首次将双链dsＲNA——正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。

实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA已经足够完全阻断同源基因的表达。

后来的实验表明在线虫中注入双链ＲNA不单可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其第一代子代的同源基因沉默。

他们将这种现象称为ＲNA干扰。

ﻫ过去认为，哺乳动物细胞中不存在RNAi现象，因为较长的dsRNA在哺乳动物细胞中能诱导ＩＦN（干扰素）生成,并激活ＳTAT途径参与的PKR（dsRNＡ依赖性激酶）的转录，同时dsＲNA本身与ＰKＲ结合也能令其激活，继而磷酸化翻译起始因子eIＦ2a使之失活,导致非特异性的蛋白质合成障碍；另一方面,dsＲNA又能诱导细胞产生多种抗病毒蛋白的2′，5′腺苷合成酶，生成2′，5′腺苷酸,激活非特异性的ＲＮA酶L,发生非特异性的RNA降解效应。

现在发现,只要ｄsRＮA短于30bp,就不会促发干扰素效应，同时又能特异性地降解mRNA,引起基因沉默，说明dsRNＡ在哺乳动物细胞中也能发挥一定作用,为以后的基因治疗等RNＡi应用领域提供了新的研究方向。

RNAi的详细机制和过程还不十分清楚，目前大致分为以下几个阶段进行：

①siRNＡ的形成阶段：

此阶段需要Rde-1，Rde-4和ｄsRＮＡ特异性的核酸内切酶Diｃer等共同参与。

Rde-1,4编码的蛋白识别外源dｓRNA，引导dsRＮA与Dicer结合，然后,Diｃer将dsRＮA解旋,再将其裂解为21-２5nt大小的小干扰ＲNA（smaｌl　ｉnterferｉngRNA,siRNA）。

Dｉｃｅr定位于胞浆中，但核内mRＮA剪切修饰后在向核外运输过程中也存在RＮAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。

现认为21-25nｔ大小并在3′端带有2-3个碱基悬端且5′端磷酸化的siRNA诱导的RＮAi效应最强。

Ｄicer家族在进化上非常保守，有5个组成部分:

N－端RＮA解旋酶结构域、1个PAZ结构域（Piｗi，ａｕgonaute，Zwiｌle/ｐinｅheａd,PAZ）、2个　RNａsｅIIＩ结构域和C端dsＲNA结合基序。

Dｉcer在体内一般是以二聚体的形式发挥作用的,由于不同种族Dicｅr分子大小不一样,所以dsRＮＡ被切割成的sｉRNA大小具有种族差异。

②RNＡ诱导的沉默复合物（RNA－ｉｎｄｕcedsｉｌｉｃencｉnｇcompleｘ，RISC）形成阶段：

生成的siRNA和ＲNAｉ特异性酶如AGO-2、MＵT-7、RED-1、PAＺ蛋白和ＤNA-RNＡ螺旋酶结合形成RISＣ，具有序列特异性核酸内切酶、核酸外切酶和解旋酶活性,能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。

③效应阶段：

　ｓｉRＮA引导RISＣ与同源性的mＲNＡ结合,在ＡTP及解旋酶（如qde-3,ｍut－６,mut-1４）的作用下使siRＮＡ链解离，并使ＲISＣ由250kＤ大小的前体形式变成约１00kD左右活性形式,同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链相互交换,核酸酶在ｍRNA与反义RNA所形成的双链区的5′起始端下游7－１0个核苷酸处切断ｍRNA,起到特异的抑制基因表达的效果。

④扩增阶段：

该反应以ｓiRNA中的一条链为引物，以靶ｍＲNＡ为摸板,在RNＡ依赖的RNA聚合酶（ＲNA-dependｅntRNAｐolymｅraｓｅ,RｄRP）作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级ｓiRNA,而这些siRNＡ又能继续反作用于靶mRNA。

RdRＰ不仅能增加siRNA的拷贝数,而且能将异常的单链RNA转变dsRNＡ。

RdＲP还是一个重要的“senｓｏr”，它能识别正常和异常的RＮA。

转基因RNA和病毒RNA都是在RｄRP的识别下启动ＲＮAｉ的反应过程。

此外,ＲＮAi的扩增效应还可能存在另外两种机制：

①Ｄiceｒ将长dｓRNA切成初级ｓiＲNA,这一放大水平取决于dsRNA的长度;②sｉＲＮA在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。

RNAi的作用机制

干扰性小ＲＮＡ（sｍａllｉｎterｆｅrinｇＲNA,或shoｒｔinteｒferｉｎgＲＮAｓ，ｓiRNＡ）是RNA干扰作用（RNAｉ）赖以发生的重要中间效应分子.siRNA是一类长约２１~２5个核苷酸（nｔ）的特殊双链RＮA（dｓＲNA）分子,具有特征性结构,即sｉRNA的序列与所作用的靶mRＮA序列具有同源性;siRNＡ两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基．此外,每条单链的3′端均有2～3个突出的非配对的碱基RNAｉ的主要过程是，dsRＮA被核酸酶切割成21～２5nt的干扰性小RNＡ（ｓｉRNＡ），由siRNＡ介导识别并靶向切割同源性靶ｍRNＡ分子.细胞中dsＲNA的形成是RＮＡi的第一步.细胞中dｓRNA可通过多种途径形成,如基因组中ＤNA反向重复序列的转录产物；同时转录反义和正义RＮＡ;病毒ＲNA复制中间体;以及以细胞中单链ＲNA为模板由细胞或病毒的ＲNＡ依赖RNA聚合酶（ＲdRｐ）催化合成dsRNＡ等.在线虫（Ｃ.elｅgａｎｓ）可以直接注射dsRＮA或把线虫浸泡在含dsRNＡ溶液中等方式引入外源ｄsRNA，还可以通过喂养表达正义和反义RＮA的细菌获得dsRNA.ﻫ现已初步阐明ＲNＡi的作用机制.RNAi的第一步是,dsRNA在内切核酸酶（一种具有ＲNasｅⅢ样活性的核酸酶）作用下加工裂解形成21～２5nt的由正义和反义序列组成的干扰性小ｄsＲNA，即ｓｉＲＮA.果蝇中RNaseIII样核酸酶称为Ｄicer.Dｉｃeｒ含有解旋酶（ｈeｌｉcａse）活性以及ｄsRＮA结合域和ＰAＺ结构域.已发现在Araｂｉdoｐsis，C.elegａｎs，Scｈizｏsaｃcharomycespomｂe以及哺乳动物中也存在Ｄｉcer同类物.RＮＡi的第二步是，由sｉRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体，该核蛋白体称为ＲNＡ诱导的沉默复合体（ＲNＡiｎdｕcedｓileｎcｉｎｇcoｍｐleｘ，RＩSC），由RＩSＣ介导切割靶mRNA分子中与siRＮＡ反义链互补的区域，从而达到干扰基因表达作用.RISC由多种蛋白成分组成，包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RＮA链搜索活性等.线虫Ｃ．eｌegaｎｓ中的ＭUＴ７（一种RNaseＤ样蛋白）可能是一种3′５′外切核酸酶.此外，PAZPPiwi蛋白家族成员可能是RISC中的构成组分，如Aｒabidposiｓ中的AGO1；N.Ｃraｓsａ中的ＱDE;C.elｅgans中的ＲDE1等,以上这些蛋白与翻译因子eIF2C同源.

研究进一步揭示，AＴＰ在siＲNA介导的ＲNAi中具有重要作用.较长dsＲNA向siRNＡ的转变要有ＡTP参与.siRＮA与蛋白因子形成一个无活性的约360kD的蛋白ＰRNＡ复合体；随之,ｓiＲNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA复合体（RＩＳC），此步具有AＴＰ依赖性.ＲISC活性复合体对靶mRNＡ的识别和切割作用，这一步可能不需AＴＰ参与．ﻫ此外,ATP使sｉＲＮA5′端带上磷酸分子，且对siRNＡ的功能具有重要作用．上述过程中siＲNA双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNＡ双链体与细胞裂解物、ＡＴＰ等孵育后再除去ATＰ及其它辅助因子，含有sｉRＮＡ的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA分子ﻫｓiRNA可作为一种特殊引物,在RNA依赖RNA聚合酶（ＲdRp）作用下以靶mRNA为模板合成ｄsRNＡ,后者可被降解形成新的siＲNA；新生成的siRＮA又可进入上述循环.这种过程称为随机降解性多聚酶链反应（ｒaｎdoｍdｅgradaｔｉｖeＰCR）.新生的dsRNA反复合成和降解，不断产生新的siRNＡ,从而使靶mＲＮA渐进性减少，呈现基因沉默现象.RdＲp一般只对所表达的靶mＲＮA发挥作用,这种在RNAi过程中对靶mRNＡ的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能.每个细胞只需要少量dｓRNＡ即能完全关闭相应基因表达,可见ＲＮAi过程具有生物催化反应的基本动力学特征．

mｉRNA与siRNＡ的区别：

ﻫ

（1）mｉRNA是单链的,而siRNA则是双链的;

（2）miRNA参与正常情况下生长发育基因调控,而siRＮＡ不参与动物体的正常生长，只有在病毒或其它dsRNA诱导情况下才产生siRＮＡ，作为miＲNA的完善和补充;ﻫ（3）　mｉRＮA在转录后水平调节基因表达,推测在翻译水平也起作用,而siRNA为转录后水平调节基因表达调控;ﻫ（４）Diｃｅr酶对两类ＲNA的加工过程,ｍｉRNA为不对称性，仅来自含茎－环结构RNA前体的一侧臂,剩余部分很快降解,而这种不对称性不存在于而siＲＮＡ加工过程中。

RNAi的特点

①高度特异性：

有时sｉＲNA一个碱基改变就会大大降低封闭靶基因的效果。

Brummelkamp[4］等利用载体表达的小发夹RNＡ（sｍallhaｉrpinRNA,sｈRNA）来封闭人MCF-7细胞的CDH1基因,shＲＮA上仅一对碱基的突变就不能抑制ＣDＨ1基因的表达。

其中sｉRNA的中央位置碱基位点和3′末端倒数第二个碱基起了格外重要的作用。

ﻫ②高效率:

在细胞内ＲNＡi途径一旦被启动,反应信号就被放大。

在低等动物中靶基因表达抑制效率大于90%，甚至有人认为每个细胞一份拷贝的dsRNＡ就可以封闭基因的效果。

ﻫ③高成功率：

ＲNＡi已被用于线虫全基因组的功能分析,其中有50%-８0%序列选择有效,１2．9%-27％的基因封闭产生了明显的异常表型。

④种属时-效性:

Iｒie等人发现,在低等生物中RNAi可持续存在,但RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，一般注入dsRＮA后的2－3天,RNAi的作用最明显，尔后1-２天内，靶ｍＲNA的丰度就能恢复到注射RNAi之前的水平。

这可能是由于RNA依赖的核苷脱氨酶脱氨基活性的逐步增高导致ｓｉRNA的生成减少而受到抑制。

ﻫ⑤ｄｓRNA的长度限制性：

引发有效RNＡｉ的dｓRNＡ最短不得短于21ｎt,Dｉcer能与200-50０nt范围内的dsRＮA结合,底物片段越短,Dicｅr酶的活性也就越弱，提示ＲＮＡi具有dsRＮA片段长度限制性。

⑥RＮＡi的遗传性：

１９98年Fiｒe等就发现在线虫中RＮAi可以传代,以后Ｗorｂｙ等人在果蝇的培养细胞中也发现了类似的现象。

线虫中的ＲNAi遗传性需要Rde－1和Ｒｄｅ－2来启动。

ﻫ⑦传播性：

RNＡi效应可以在细胞间扩散,dsRNA可在果蝇细胞群落之间传播,在线虫局部注射dｓＲＮＡ也可传播到整个机体。

Ｖan等研究发现ｓｉｄ－1基因编码一种具有十一次跨膜蛋白可能与此现象有关。

ﻫ⑧ATＰ依赖性:

在去除ATP的样品中RNAi现象降低或消失,显示ＲNＡi是一个ATP依赖的过程，可能与Dicｅr和RＩSＣ的酶切反应必须由ＡTP提供能量有关。

⑨模板选择性：

RＮＡi只有效作用于外显子,而对内含子无影响。

dsＲNA序列是某个基因的启动子序列时也没有明显的效应。

另外,RＮAi对稳定并丰富表达的靶基因抑制效率也不高。

ＲNAi的生物学意义及其应用

RＮAｉ的生物学意义主要是维持基因组稳定、抑制转基因表达和保护基因组免受外源核酸侵入。

研究证实RNAi缺陷可引起内源性转座子的移动。

转座子沉默与ＤNA甲基化、H3mK9（hｉsｔｏneH3　ｌｙsine-9ｍｅtｈyｌａｔion）和RNAi有关，大多数转座子沉默与met1（DNAｍethyltransferasｅ）、dｄm1（decreaｓeinＤNAmethyｌaｔion　1）和sｉl1（Ｓtreptｏmｙceｓsubtilｉsin　ｉnhibｉtor－ｌiｋe1）有关，而很少的转座子沉默需要ＫＲＹPTOＮＩNE（H3K9mｅthylｔrａｎｓferase）、AＲGOＮＡUTE1（RＮAigｅnｅ）和CHＲOＭOMETHYＬAＳE3（CXGmeｔhyltrａｓferaｓe）。

Ｈａｌl等研究表明,着丝粒同源重复序列和RNAi组分一起正负调节着异染色质的形成并且共同促使异染色质组装成核。

最近研究发现，RNAi需要的一种　AGＯ蛋白TbAGO2与细胞有丝分裂和染色体分离有关。

dｓRNＡ还出现在许多病毒（包括单链RNA病毒）感染的细胞内，诱发ＲNAi而封闭病毒生存和繁殖所必需的基因或激发干扰素诱导的抗病毒效应。

RＮAi还可能在胚胎发育过程中具有重要功能,也可能参与了生物体正常的基因表达调控，同时与基因印迹也有关。

RNAｉ是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具。

通过实验手段将ｄｓRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的ｍRNA,封闭内源性基因表达,从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。

早期就有人应用此项技术分离了果蝇胰岛素信号转导途径通路中的各种成分。

近来也有实验报道通过RNAｉ研究细胞内脂质平衡过程中涉及的各条途径。

在这之前，曾利用反义RＮA与靶mRNＡ序列互补的特性来抑制其表型的发生，但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱，往往会产生一些过渡表型，易造成对基因功能判断错误,目前已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物———Vitraｖｅnｅ。

RＮAｉ技术与之相比,特异性更高,作用更迅速，副反应小,在有效地沉默靶基因的同时,对细胞本身的调控系统也没有影响。

最近在人类体细胞里已经成功地对近2０种基因功能进行了“敲除”,尤其是因此而了解了人类空泡蛋白Tsg101对HIV在人体内增殖的作用，进一步深化了对HIV的研究。

Leｏnid等以脊髓灰质炎病毒为模型，利用RNAｉ来诱导细胞的胞内免疫，产生抗病毒效应，尤其是针对RNA病毒。

对于易突变的病毒，可设计多种靶向病毒基因保守序列的ｄsＲNA,减少它对dｓＲＮＡ的抵抗。

Maen等也应用RＮAi技术成功地阻断了MCF－7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp21的功能。

RＮAi技术的应用,不仅能大大推动人类后基因组计划（蛋白组学）的发展，还有可能设计出RNAｉ芯片,高通量地筛选药物靶基因,逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能,并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域,用ＲＮAi技术来抑制基因的异常表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。