金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠海马CA1区神经元细胞凋亡的阻碍.docx

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金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠海马CA1区神经元细胞凋亡的阻碍

金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠海马CA1区神经元细胞凋亡的阻碍

马飞煜王凤王虎田贤先张昱

【摘要】目的研究金属硫蛋白3（MT3）对快速老化痴呆模型小鼠（SAMP8）海马CA1区神经元细胞凋亡的阻碍及其机制。

方式将7月龄SAMP8小鼠随机分成6组，分为痴呆组、3种浓度的MT3组、MT1组、空白对照组。

快速老化小鼠对照（SAMR1）小鼠为正常对照组。

持续腹腔注射28d后灌注取脑，进行海马CA1区原位结尾标记（Tunel）试剂盒和免疫组化（SP）试剂盒染色。

结果痴呆组海马CA区神经元细胞凋亡指数明显高于正常对照组。

高浓度MT3组凋亡指数最低，Bcl2蛋白表达增强，Bax蛋白表达最低（P＜，P＜。

MT3组对Bax蛋白表达的抑制作用强于MT1对照组，而二组对Bcl2蛋白表达的不同不显著。

结论SAMP8小鼠海马结构存在大量神经元细胞凋亡，MT3通过减少Bax表达和增加Bcl2表达，减少细胞凋亡，并有浓度依托关系；且作用强于MT1。

【关键词】MT3；SAMP8；细胞凋亡；Bax；Bcl2

第一马飞煜（1975），女，主治医师，博士，要紧从事脑血管病及老年痴呆的研究。

阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，其特点性病理转变之一是脑内神经元数量的明显减少，尤其以海马结构受累最为严峻。

细胞凋亡是AD神经元丢失及其他病理学特点形成的要紧缘故。

已有研究发觉身后的AD患者脑内存在大量凋亡神经元，并有凋亡信号分子凋亡增进基因（Bax）的高表达〔1〕，而在非痴呆老年人脑内几乎无表达。

1991年，Uchida等〔2〕第一次从人脑组织中分离出金属硫蛋白3（MT3），因其只在脑内特异表达，可能具有重要的神经生理和神经调剂功能。

临床报导AD患者脑内MT3含量明显减少〔3〕，这就引发了许多MT3与AD发病机制的研究。

快速老化痴呆模型小鼠（SAMP8）是日本Takeda等人精心培育，具有快速老化痴呆的特点，平均寿命个月〔4～6〕，是目前公认的比较理想的自然衰老痴呆模型。

SAMP8小鼠的快速老化机制是不是与神经元细胞凋亡有关，和MT3对其海马结构细胞凋亡和相关蛋白表达阻碍的研究还未有报导。

　　1材料与方式

　　要紧实验试剂及仪器

　　原位结尾标记（Tunel）试剂盒，兔抗鼠Bas多克隆抗体，兔抗鼠凋亡抑制基因（Bcl2）多克隆抗体，生物素化羊抗兔IgG/Biotin，DAB显色剂均由武汉博士德生物工程提供。

MT3及MT1由北京大学生命科学院蛋白质工程实验室惠赠。

Imageproplus图像分析系统（日本）。

　　实验动物分组

　　选择雄性SAMP8小鼠60只，7月龄，体重25～30g，随机分成6组：

空白对照组（生理盐水）、低mg·kg-1·d-1）、中（3mg·kg-1·d-1）、高（6mg·kg-1·d-1）浓度MT3组、MT1对照组（3mg·kg-1·d-1）和痴呆组。

另将雄性SAMR1小鼠10只，7月龄，体重30～40g，为正常对照组。

天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供。

　　方式

　　持续28d腹腔注射给药，停药1d后将各组小鼠用4%多聚甲醛灌注取脑，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明后，浸蜡，石蜡包埋制成蜡块，每只鼠海马持续发4～5μm片，备Tunel和免疫组化（SP）法利用。

　　Tunel实验方式

　　①石蜡切片脱蜡和脱水；②用4%多聚甲醛固定；③100μl新配制的蛋白酶K工作溶液消化；④再置于4%多聚甲醛溶液固定；⑤加100μl平稳液缓冲，室温平稳5～10min；⑥滴加50μlTdT酶反映液；再加入50μl2×SSC溶液终止反映；⑦用%的H2O2浸洗；⑧滴加100μl稀释的链酶亲和素过氧化物酶（StreptavidinHRP）溶液；⑨DAB显色剂加至标本片上；⑩去离子水漂洗；梯度乙醇浸洗；二甲苯浸洗固定，树脂封片。

阴性对照在操作步骤⑥所用到的反映液中不添加TdT酶，其余与实验组步骤相同。

　　SP分析

　　①石蜡切片脱蜡和脱水；②1%H2O2灭活内源性过氧化物酶；③枸橼酸盐缓冲液修复抗原；④正常山羊血清封锁非特异性抗原；⑤滴加特异性一抗（兔抗鼠Bas多克隆抗体或兔抗鼠Bcl2多克隆抗体）；⑥生物素化羊抗兔（IgG/Biotin）；⑦滴加StreptavidinHRP溶液；⑧DAB显色；⑨苏木精复染，中性树脂封片。

对照用聚丁二酸丁二醇酯PBS代替一抗作阴性对照。

　　图像分析及统计学分析

　　在光镜下进行观看，每张切片随机选取20个高倍（×400）视野，计数细胞，计算凋亡百分率，即凋亡指数（AI），计算公式如下：

AI＝（阳性细胞数/总细胞数）×100%。

数据以x±s表示，用统计软件，进行方差查验和t查验。

　　2结果

　　各组小鼠海马CA1区神经元的AI

　　①正常对照组罕有凋亡细胞，AI为±%；②痴呆组海马CA1区可见大量凋亡细胞，AI别离为±%，与正常对照组相较，不同显著（P＜。

③低、中、高浓度MT3组的小鼠海马CA1区AI依次为±%、±%、±%，高浓度MT3组凋亡指数最低；与空白对照组AI相较，不同显著（P＜。

④相同浓度MT3和MT1对照组小鼠海马CA1的AI别离为±％、±％，组间不同不显著。

　　Bcl2蛋白在各组小鼠海马CA1区神经元中的表达

　　①Bcl2蛋白在正常对照组组海马神经元中表达较强，IOD值较高；而在痴呆组海马神经元中表达弱，IOD值低，两组间不同显著（P＜。

②3种浓度MT3组相较，Bcl2蛋白在高浓度MT3海马神经元中表达增强，但无统计学意义；别离与空白对照组比较，高浓度组Bcl2蛋白表达明显增强，IOD值明显增高（P＜。

③Bcl2蛋白在MT3与MT1两组间表达不同不显著。

见表1。

　　Bax蛋白在各组小鼠海马CA1区神经元的表达

　　①Bax蛋白在正常对照组小鼠海马CA1区神经元表达弱，IOD值低；而在痴呆组小鼠海马神经元表达强，IOD值高，两组间不同显著（P＜。

②高浓度MT3组IOD值是3种浓度组最低，不同显著（P＜；别离与对照组相较高、中浓度MT3组Bax蛋白表达显著减弱，IOD值明显降低（P＜。

③Bax蛋白表达在MT3组明显低于MT1组（P＜。

表1。

表1各组小鼠海马免疫反映阳性神经元IOD（略）　　3讨论

Smale等〔7〕研究发觉，AD患者脑内海马结构细胞凋亡明显增加，凋亡率要高出正常人30～50倍，而正常脑内几乎没有或很少有细胞凋亡。

采纳Tunel等凋亡检侧技术发觉，AD患者脑的易损区细胞凋亡明显增加，可见DNA断裂损伤、凋亡小体及染色质凝集等〔8〕。

有关研究说明，AD脑内存在有多种凋亡病理因素，如氧化损伤、兴奋性毒性、能量代谢低下、凋亡相关基因表达、神经营养因子信息转导障碍等〔9，10〕。

Bcl2家族是细胞凋亡机制中重要的调剂因子，Bcl二、Bax蛋白是这一家族中重要成员，对神经元的凋亡具有调控作用〔11〕。

Bcl2是一种强有力的细胞凋亡抑制因子，在神经系统的发育进程，具有抑制细胞凋亡及类神经营养的作用〔12〕。

Bcl2蛋白参与调控线粒体凋亡途径。

而研究发觉Bax可能是Bcl2家族中最重要的凋亡增进因子〔13〕。

Bax蛋白受到凋亡信号刺激后，可发生构型改变，形成同源二聚体，传递凋亡信号进入线粒体外膜〔14〕，在线粒体外膜形成孔道,排除线粒体膜电位，引发细胞色素c释放，增进细胞凋亡。

本实验Tunel染色可见8月龄SAMP8小鼠海马CA1区神经元细胞核着色及碎片状DNA形成，即凋亡细胞，而正常对照组SAMR1小鼠海马很少有凋亡细胞。

Bax蛋白在SAMP8小鼠海马神经元中高表达，启动了SAMP8小鼠的细胞凋亡机制，通过MT3作用后表达明显减少，越高浓度MT3组Bax蛋白表达越少，说明MT3能够抑制Bax蛋白的表达，降低细胞凋亡的发生，并有浓度依托关系。

而Bcl2蛋白在SAMP8小鼠海马神经元中低表达，给予不同浓度MT3后，高浓度MT3组表达最多。

说明MT3通过增强Bcl2蛋白表达，同时减弱Bax蛋白表达，减少Tunel阳性细胞，抑制细胞凋亡，增进海马神经元存活及损伤修复。

相同浓度MT3与MT1组比较，Bax蛋白表达MT3组明显低于MT1组，而对Bcl2蛋白表达在二组之间不同无统计学意义。

说明只存在于脑组织中的MT3在抑制Bax蛋白表达发挥要紧作用，而对Bcl2的阻碍MT1与MT3作用相差无几。

AD中存在氧化应激损伤，氧化应激损伤可引发细胞凋亡〔15〕。

MT3引发Bcl2基因、Bax基因表达改变的作用机制尚不完全清楚。

可能与清除自由基、抗氧化物酶类活性增强致使的Bax基因受抑制，Bcl2被激活有关。

而Bcl2的表达还能够诱导内源性抗氧化功能的增强，如超氧化物歧化酶（SOD），谷胱光甘肽过氧化物酶（GSHPx）和过氧化氢酶等酶活性增高而阻止细胞进入凋亡进程。

　　马飞煜等〔16〕的研究证明8月龄SAMP8小鼠海马组织存在氧化应激损伤，MT3能直接清除自由基，并使抗氧化物酶的活性增强。

这可能与Bcl2的表达能够诱导内源性抗氧化功能的增强而阻止细胞进入凋亡进程有关。

MT3清除自由基，增加抗氧化物酶类活性，也是抗细胞凋亡的缘故之一。

另外MT3能够增加SAMP8小鼠海马组织锌含量，从而增加抗氧化应激能力〔17〕。

锌能够爱惜性地抵御相关细胞因子介导的氧化压力灵敏转录因素的活化、炎性细胞因子的上调和内皮细胞功能紊乱，从而起到制约细胞凋亡的作用。

补锌抑制反映性氧化产物生成和增加抗氧化途径的活性，发挥抗氧化作用。

【参考文献】

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　　16马飞煜,张昱,何雨,等.金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠海马抗氧化损伤作用的研究〔J〕.中风与神经疾病杂志,2007；24

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　　17马飞煜,张艳梅,王虎,等.金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠海马锌和铜含量转变的阻碍〔J〕.中华老年心脑血管病杂志,2020；11（7）:

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