深海玫瑰杆菌固碳及蛋白质组分析海洋生物专业毕业论文.docx
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深海玫瑰杆菌固碳及蛋白质组分析海洋生物专业毕业论文
2．5结果与讨论28
2．5．1生理培养及生理生化特征测定28
2．5．2基于iTRAQ定量的比较蛋白组学分析．45
第三章一株来自于中国南海的玫瑰杆菌的分离与鉴定53
3．1研究背景．．53
3．2材料与方法．53
3．3实验结果与讨论．59
3．4鉴定总结．．70
3．5本章节小结．．71
第四章本论文的主要结论和创新点．73
4．1主要结论73
4．2创新点．73
4．3本论文的不足与展望74
参考文献75
硕士期间已发表的论文．86
致谢87
万方数据
ContentS
Coritents
AbstractinChinese．I
AbstractinEnglish．．．．．．．．．．．．．．．IIChapter1Introduction．．1
1．1Marinemicroorganismsandmarinecarboncycle．．1
】【．2studyprogressesofRoseobacterClade．．．21．2．1TheintroductionanddistributionofRoseobacterClade．2
1．2．2ThephysiologicalandmetaboliccharacteristicsofRoseobacterClade41．3TrophicmodesofRoseobacterdadeandthemixotrophicstrategy．．41．3．1TrophicmodesofRoseobacterclade．．4
1．3．2Themixotrophicstrategyofmarinemicroorganisms．61．4CarbonfixationpathwaysandtheroleofRoseobacterCladeincarbon
fixation．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．91．4．1Differentcarbonfixationpathwaysofmarinemicmorganisrm．9
1．4．2MarinemicroorganiSlIEandmarinecarbonfixation11
1．4．3TheroleofRoseobactercladeincarbonfixation．．12
15MarinesulfurcycleandtheroleofRoseobacterCladeinmarinesulfur
cycle．．．．．．．．．．．．．141．5．1Sulfur-oxidizingbacteriasandmarinesulfurcycle14
1．5．2TheroleofRoseobactercladeinmarinesulfurcycle．．16
】I．6Targetsofthisstudyandresearchsignificance．．．．．17Chapter2Studiesonthedifferencemetabolicstrategiesofadeep-seaRoseobacterstrain．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18
2．1Researchbackground．．18
2．2Experimentaldesign．．．．18
2．3Experimentalstrainandculturemedium．．182．3．1Experimentalstrain18
2．3．2Culturemedium．．．18
2．4Experimentalmethods．．．．．．．202．4．1Foundamentalculture20
2．4．2Physiologicalexperiments．．．．．．．．．．．．．．20
2．4．3iTRAQ-basedquantitiveproteomictest．．．．．．．．．．．．．．．．．24
万方数据
ContentS
2．5Resultsanddiscussion．28
2．5．1Physiologicalcultureandbiochemicalcharacteristics．．．．282．5．2iTRAQ—basedquantitiveproteomicanalysis．．．．．．．．．．．．45
Chapter3IsolationandidentificationofaRoseobacterfromsouth
chinasea．．．．．．．．533．1Researchbackground．．．．．．．．．．．．．，53
3．2Materialsandmethods53
3．3Resultsanddiscussion．59
3．4Identificationsummary．．．．．．．．．．．703．5Summariseofthischapter．．．．．．．．．71
Chapter4Conclusionsandinnovations．．．．．．．73
4．1Conclusions．．．．．．．．．．734．2Innovations．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．734．3Deficiencyandperspectives．．．．．．．．．．74
References．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．75
Listofpublications．．．．．．．，．．．．．．。
．．．．．86
Acknowledgements．．．．．．．．．．．．．．87
万方数据
摘要
摘要
玫瑰杆菌类群（Roseobacterbacteriaclade）是海洋微型生物q．变形菌中红螺菌科的主要分支，在海洋中分布广泛、普遍存在，并参与海洋碳循环和硫循环。
该类群系统发育相近，但具有非常丰富的形态和生理特征。
玫瑰杆菌生活环境多样复杂，生存代谢方式受到环境的影响呈现多样化，并具有一定的灵活性。
人们对分布在近岸、表层及深海沉积物的可培养的玫瑰杆菌已有相当认识，但处于深海这片广阔区域的玫瑰杆菌却少有分离及培养。
本研究基于深海玫瑰杆菌ThiobacimonasprofundaJLT2016的全基因组测序结果，发现其具有多样可变的代谢方式，例如具有异养代谢中心环节糖酵解途径及三羧酸循环途径的关键基
因，同时还具有固定二氧化碳的卡尔文循环的关键酶——二磷酸核酮糖羧化酶以及无机硫氧化酶的相关基因。
这说明了深海玫瑰杆菌JLT2016具有自养、异养及混合营养的代谢潜能。
之后对JLT2016设计并开展了在不同代谢方式下的生理培养实验，分析了各类生理生化特征及蛋白组表达水平上的差异性。
主要研究内容及结果如下：
1．对深海玫瑰杆菌JLT2016设计生理培养实验，包括自养、异养及混合营养代谢等。
固体平板验证实验及液体血清瓶培养实验证实了其可营异养、自养并且在异养生存的同时可进行自养碳固定，即具有混合营养代谢能力。
2．对JLT2016生长代谢中底物的吸收和利用的测定及比较蛋白组学的分析得出：
在仅有有机物葡萄糖和无机碳酸氢钠的添加而无硫代硫酸盐的添加培养条件下，无机碳的固定几乎不发生。
并且蛋白水平表明硫代硫酸盐的添加能促进自养固碳酶RubisCO的表达。
3．对JLT2016不同生存代谢下细菌主要物质分配以及比较蛋白组学的分析可以得出：
不同生存代谢下的细菌虽然蛋白质的总量占干重的比例相差不大，但是相关代谢途径的关键蛋白在不同代谢状态下表达水平具有明显差异性。
本研究的生理培养、各类生理生化特征测定及蛋白组学的结果为了解深海玫瑰杆菌的代谢情况提供了信息，并为后续深入研究深海细菌及玫瑰杆菌类群生态功能提供了参考。
关键词：
深海；玫瑰杆菌；混合营养代谢；固碳：
硫氧化
万方数据
Abstract
Abstract
Tl硷RoseobactercladeisamajorlineageoftheRhodobacteraceaew“hintheAlphaproteobacteria．Swainsofthiscladearewidespreadinmarineenvironmentsandmakeaconlributiontomarinecarbonandsulfurcycle．TheRoseobactercladeshows
aphylogeneticaHycoherent，buthasheterogeneousphenotypicandphysiological
characteristics．Wl】at’Smore．alargevarietyofhabitatsleadtotheflexibleandversatilemetabolicconditionsofthisclade．ManystudieshavefocusonsomeculturedstrainsofRoseobacterfromthecoastal,surfaceanddeep-seasediment．
However，theswainsofthiscladel?
omthedeep—seahavenotbeenthoroughly
investigatedandmostareumultured．Here，webaseonthecon-oletegenomesofaswainThiobacimonasprofundaJLT2016ofRoseobactercladeisolatedfromdeep-seaandfmdthatJLT2016haveversatilemetabolisrmandwiththecapabilitiessuchas
glycolyticpathway，tricarboxylicacidcycleribuiose，bisphosphatecarboxyhse-mediatedcarbonfixationandinorganicsulfuroxidation．Therefore，thisstudysuggeststhatJLT2016iscapableofautotrophic，hetemtrophic，andrnixotrophicgrowthandexplorestheconnectionsanddifferencesofvariousmetabolicstrategies．Tllcmainresearchcontentsandconclusionsareasthefollowiney
1．Tl砖differentcultureconditionswhichincludeautotrophic．heterotmphicand
mixotrophicweredesignedandusedtotestthemetabolicabilityofJLT2016．The
conclusionisthatthestrainJLT2016canindeedgrowinautotrophic，heterotrophic
andmixolrophicwhichmeanssimultaneousautotrophicaudheterotrophic
physiologies．
2．Tl硷consumingrateofthemediumsubstratesandproteomeanalysisof
JLT2016suggestthatthecarbonfixationofthebacteriaculturedintheconditionwhichcontainsglucoseandsodiumbicarbonateexceptforthiosulfateisalmostabsent．Theproteomealsoshowsthatthiosulfatehaveallimpactontheexpressionof
RubisCO．
3．TheproteomeanalysisofJLT2016revealedsignificantdifferencesofexpressionsofproteinwhichinvolvedinvariousmetabolicreactionsindifferentcultureCOnditions．
Physiologicandproteomicanalysisofadeep-seaRoseobactersWaininthisstudyprovidestheinformationofmetabolicpotentialofdeep-seaRoseobacterandtherefereneeforsubsequentstudyofdeepseaandRoseobacterecologicalfunction．
Ⅱ
万方数据
Abstract
KeyWords：
Deep．sea；Roseobacter；Mixotrophic；CarbonFixation；Sulfuroxidation
IXI
万方数据
第一章绪论
第一章绪论
1．1海洋微型生物与海洋碳循环地球上大约近3／4的面积是海洋，生活着地球上80％的生物类群。
海洋生
物类群除了一些大型植物和动物外，海洋微型生物无处不在，通常包括微型真核生物（鞭毛虫、纤毛虫等）、微型原核生物（海洋细菌、古菌及自养蓝细菌等）等单细胞生物以及浮游病毒等个体较小（<20gm）的类群（焦念志等，2006）。
这些看起来“不起眼”的小家伙才是海洋生物量的主宰者，是海洋中的“巨人”（Karl，2002）。
与较大的生物相比，微型生物常常具有更小的营养吸收半饱和
系数、更高的生产效率和更强的竞争力（Jiao&Wang，1994），它们与其它生物相互作用，从而影响整个地球生态系统。
这些数目巨大的微型生物不仅仅是全球海洋生物量的主要贡献者，是生命和非生命系统联系的关键环节，同时也在海洋物质循环和能量流动及维持海洋生态系统多样性与稳定性中发挥着不可或缺的作用。
图1．1海洋垂直剖面图（wikipedia）
Fig．1-1Theoceanverticalcrosssectionchart（wikipedia）
l
万方数据
第一章绪论
海洋是地球上最大的碳库，在整个地球的生物生产力中海洋贡献了87％，并在调节全球气候变化中扮演着至关重要的作用。
海洋中黑暗深海区（>1000m）占到了70％的海洋水体（图1．1），是生物圈中最大的栖息地（Copley,2002），
也是水生系统中最大的微生物圈（Whitmaneta1．，1998）。
在有光合作用发生的真光层中（200m以上），光合作用产生的大部分的有机碳运输到深海被微型生物呼吸消耗（Aristeguieta1．，2005）后，可能在几个月或几年的时间尺度中以二氧化碳的形式回到大气中，而一些直接沉降到深海区域的颗粒有机碳（ParticleOrganicMatter。
POC）或溶解有机碳（DissolvedOrganicMatter，DOC）则可深藏海底长达几个世纪。
事实上，海洋中95％的有机碳是溶解态的，而其中95％又是惰性的，可在海洋中保存5000年。
黑暗的深海区是碳在生物圈中长期存储的重要区域，是生物圈中最大的有机碳库（Llbes，1992；Hansell＆Carlson,1998；Benner，2002）。
所以海洋微型生物在海洋生态系统中的作用不仅是分解者或生
产者，更是对海洋碳循环中的储碳做出了重要的贡献。
深海中的微型生物种类繁多、数量巨大，仅深海沉积物中的原核生物的生物
量就约占地球总生物量的10％．30％（Parkeseta1．，1994）。
在较早期的研究认为深海中的微型生物主要是利用海洋真光层沉降下来的有机物作为其营养物质的来源进行异养代谢。
到1977年，在加拉巴戈斯裂谷第一次发现一个深海热液生态系统（Lonsdale1977，Corlisseta1．1979）的生物类群以化能自养代谢生存为主（Jannasch&Wirsen1979，Jannasch&Mottl1985）。
近期，Swan等人通过单细
胞和全基因组测序技术对两个亚热带环流海区研究发现深海中广泛存在着大量具有化能自养潜能的未能纯培养的细菌类群（Swaneta1．，2011），这为深海微型生物在海洋碳循环中的地位及意义提供了新的角度和视野。
1．2海洋玫瑰杆菌类群的研究概况
1．2．1玫瑰杆菌类群的概况与分布
玫瑰杆菌类群是海洋中最丰富的浮游微型生物类群之一。
其16S核糖体RNA（rRNA）克隆文库分别占到某些海洋表层和深海沉积物细菌类群的总文库的10-25％和2-15％（Moraneta1．，2007），其与海洋另一大细菌类群SARl1一样受到研究者的关注与重视（图1．2）。
玫瑰杆菌属于变形菌门五个亚纲（a-亚纲、p一亚纲、丫．亚纲、6．亚纲和￡一亚纲）中的叶亚纲，隶属于其中的红螺
杆细菌科（Garrityeta1．，2005），并且这一类群细菌的16SrRNA之间的相似性
2
万方数据
第一章绪论
均在89％以上。
SAR406肿arIrte
groupASAR324（61
i’I】
’^·{．
图1-2海洋浮游生物中，细菌域中最常见的16SrRNA基因簇的出现频率
（Munn,2003）
Fig．1-2Frequencyofthemostcommon16SrRNAgeneclustersofBacteriainmarineplankton（Munn,2003）
最先描述的玫瑰杆菌Roseobacterlitoral西Ochl14和RoseobacterdenitrificansOchl49出现在1991年，呈玫瑰色，含有细菌叶绿素a，分自于海洋藻类（Shiba，1991）。
目前通过实验室人工培养方法分离和描述玫瑰杆菌类群占预估玫瑰杆菌总数量的0．1％。
它们在海洋中分布极为广泛，从沿海到开阔大洋、从极地冰区到热带海洋，几乎无处不在。
并且多分离自多样化的海洋或盐水的栖息地，如海洋沙滩、深海沉积物、潮滩沉积物（Seljeeta1．，2004；Shiba，1991；Lafayeta1．，1995；Prokiceta1．，1998）、黑海（Sorokin,1995）、北海（Wagner—D6bler
ela1．，2003）、半对流湖（Yurkovaeta1．，2002）、黑烟囱（Yurkov&Beatty,1998）温泉（Petursdottir&Kristjansson,1997）、含有超盐性水的盐场（DongHanChoieta1．2006），以及海鞘（Young-OkKimeta1．，2012）和大型藻类等。
在沿海和表层，玫瑰杆菌类群更是重要的优势细菌类群（Giovannoni&Rapp6，2000；
Gonzfilezeta1．，2000；Suzukieta1．，2001；Gonzfilez&Moran,1997）。
玫瑰杆菌分布虽然广泛且生存环境多样，但对于真光层200m以下的黑暗
3
万方数据
第一章绪论
海洋尤其是深海（>1000m）的广阔空间来说，分离较少。
另外，约有60多株玫瑰杆菌个体完成了全基因组测序，而仅有l株来自深海的Roseobactersp．SK209．2-6菌株进行了单细胞测序。
除此之外，目前对于深海玫瑰杆菌类群的基因组信息还基本处于未知。
1．2．2玫瑰杆菌类群的生理生化及生存代谢特征复杂多样的生态环境决定了玫瑰杆菌类群多样化的生理特征和生存形式。
首
先，从已有的可培养的玫瑰杆菌的研究中体现了这个类群具有非常多样及丰富的形态和生理特征，例如有些具有液泡（Gosinketa1．，1997），作为储能物质的聚羟基丁酸酯（poly-13．hydroxybutyrategranules，PHB）（Choeta1．．2004），玫瑰花
环结构（LabrenzetaL，1998），toga．1ike晶体（Gonzalezeta1．，2003），并且可
以分泌毒素（Gallachereta1．，1997；Holdeta1．，2001）等多种次生代谢物质（Brinkhofr酊a1．，2004；Howardeta1．，2008；Moraneta1．，2007；Moraneta1．，2004；Newtoneta1．，2010；Swingleyeta1．，2007）。
另外，玫瑰杆菌类群生存营养代谢方式也非常多样化，其中有的种类以单细胞形式生存，有的以多细胞小规模群居，有的常与海洋浮游植物、藻类、无脊椎动物和脊椎动物等共生。
玫瑰杆菌类群中一些菌株属于好氧不产氧光合细菌（儿廿B）功能类群或变形菌视紫红质（PR）功能类群，能够进行光能混养代谢生存。
一些玫瑰杆菌类群细菌还可以高效降解芘、萘和荧葸等多种多环芳烃类化合物，氧化CO，还原亚硫酸（Sorokin，1995），降解藻类渗透物二甲基巯基丙酸内盐从而产生与气候调节相关的气体二甲基硫（ZubkovetaL，2001；Zubkoveta1．，2002）。
1．3玫瑰杆菌类群的营养方式及混合营养代谢方式
1．3．1玫瑰杆菌类群的营养方式
由于玫瑰杆菌分布广泛，生活环境复杂多样，其生存代谢方式必然会受到环境的影响呈多样化，并具有较高
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