深海玫瑰杆菌固碳及蛋白质组分析海洋生物专业毕业论文.docx

1、深海玫瑰杆菌固碳及蛋白质组分析海洋生物专业毕业论文25结果与讨论 28251生理培养及生理生化特征测定 28252基于iTRAQ定量的比较蛋白组学分析 45第三章一株来自于中国南海的玫瑰杆菌的分离与鉴定 5331研究背景 5332材料与方法 5333实验结果与讨论 5934鉴定总结 7035本章节小结 71第四章本论文的主要结论和创新点 7341主要结论 7342创新点 7343本论文的不足与展望 74参考文献 75硕士期间已发表的论文 86致谢 87万方数据ContentSCoritentsAbstract in Chinese IAbstract in English II Chapter

2、 1 Introduction 111 Marine microorganisms and marine carbon cycle 1】【2 study progresses ofRoseobacter Clade 2 121 The introduction and distribution ofRoseobacter Clade 2122 The physiological and metabolic characteristics ofRoseobacter C lade 4 13 Trophic modes ofRoseobacter dade and the mixotrophic

3、strategy 4 131 Trophic modes of Roseobacter clade 4132 The mixotrophic strategy ofmarine microorganisms 6 14 Carbon fixation pathways and the role ofRoseobacter Clade in carbonfixation 9 141 Different carbon fixation pathways of marine micmorganisrm 9142 Marine microorganiSlIE and marine carbon fixa

4、tion 11143 The role ofRoseobacter clade in carbon fixation 121 5 Marine sulfur cycle and the role of Roseobacter Clade in marine sulfurcycle 14 151 Sulfur-oxidizing bacterias and marine sulfur cycle 14152 The role ofRoseobacter clade in marine sulfur cycle 16】I6 Targets ofthis study and research sig

5、nificance 17 Chapter 2 Studies on the difference metabolic strategies of a deep-sea Roseobacter strain 1821 Research background 1822 Experimental design 1823 Experimental strain and culture medium 18 231 Experimental strain 18232 Culture medium 1824 Experimental methods 20 241 Foundamental culture 2

6、0242 Physiological experiments 20243 iTRAQ-based quantitive proteomic test 24万方数据ContentS25 Results and discussion 28251 Physiologicalculture and biochemicalcharacteristics 28 252 iTRAQbased quantitive proteomic analysis 45Chapter 3 Isolation and identification of a Roseobacter from southchina sea 5

7、3 31 Research background ，5332 Materials and methods 5333 Results and discussion 5934 Identification summary 70 35 Summarise of this chapter 71Chapter 4 Conclusions and innovations 7341 Conclusions 73 42 Innovations 73 43 Deficiency and perspectives 74References 75List ofpublications ， 。 86Acknowled

8、gements 87万方数据摘要摘要玫瑰杆菌类群(Roseobacter bacteria clade)是海洋微型生物q变形菌中红 螺菌科的主要分支，在海洋中分布广泛、普遍存在，并参与海洋碳循环和硫循环。 该类群系统发育相近，但具有非常丰富的形态和生理特征。玫瑰杆菌生活环境多 样复杂，生存代谢方式受到环境的影响呈现多样化，并具有一定的灵活性。人们 对分布在近岸、表层及深海沉积物的可培养的玫瑰杆菌已有相当认识，但处于深 海这片广阔区域的玫瑰杆菌却少有分离及培养。本研究基于深海玫瑰杆菌 Thiobacimonas profunda JLT2016的全基因组测序结果，发现其具有多样可变的 代谢方式，

9、例如具有异养代谢中心环节糖酵解途径及三羧酸循环途径的关键基因，同时还具有固定二氧化碳的卡尔文循环的关键酶二磷酸核酮糖羧化酶以 及无机硫氧化酶的相关基因。这说明了深海玫瑰杆菌JLT2016具有自养、异养 及混合营养的代谢潜能。之后对JLT2016设计并开展了在不同代谢方式下的生 理培养实验，分析了各类生理生化特征及蛋白组表达水平上的差异性。主要研究 内容及结果如下：1对深海玫瑰杆菌JLT2016设计生理培养实验，包括自养、异养及混合营 养代谢等。固体平板验证实验及液体血清瓶培养实验证实了其可营异养、自养并 且在异养生存的同时可进行自养碳固定，即具有混合营养代谢能力。2对JLT2016生长代谢中底

10、物的吸收和利用的测定及比较蛋白组学的分 析得出：在仅有有机物葡萄糖和无机碳酸氢钠的添加而无硫代硫酸盐的添加培养 条件下，无机碳的固定几乎不发生。并且蛋白水平表明硫代硫酸盐的添加能促进 自养固碳酶RubisCO的表达。3对JLT2016不同生存代谢下细菌主要物质分配以及比较蛋白组学的分 析可以得出：不同生存代谢下的细菌虽然蛋白质的总量占干重的比例相差不大， 但是相关代谢途径的关键蛋白在不同代谢状态下表达水平具有明显差异性。本研究的生理培养、各类生理生化特征测定及蛋白组学的结果为了解深海玫 瑰杆菌的代谢情况提供了信息，并为后续深入研究深海细菌及玫瑰杆菌类群生态 功能提供了参考。关键词：深海；玫瑰杆

11、菌；混合营养代谢；固碳：硫氧化万方数据AbstractAbstractTl硷Roseobacter clade is a major lineage of the Rhodobacteraceae w“hin the AlphaproteobacteriaSwains ofthis clade are widespread in marine environments and make a conlribution to marine carbon and sulfur cycleThe Roseobacter clade showsa phylogeneticaHy coherent，but

12、 has heterogeneous phenotypic and physiologicalcharacteristicsWl】atS morea large variety of habitats lead to the flexible and versatile metabolic conditions of this cladeMany studies have focus on some cultured strains of Roseobacter from the coastal,surface and deep-sea sedimentHowever，the swains o

13、f this clade l?om the deepsea have not been thoroughlyinvestigated and most are umulturedHere，we base on the con-olete genomes of a swain Thiobacimonasprofunda JLT2016 ofRoseobacter clade isolated from deep-sea and fmd that JLT20 1 6 have versatile metabo lisrm and with the capabilities such asglyco

14、lytic pathway，tricarboxylic acid cycleribuiose， bisphosphate carboxyhse-mediated carbon fixation and inorganic sulfur oxidationTherefore，this study suggests that JLT2016 is capable ofautotrophic，hetemtrophic，and rnixotrophic growth and explores the connections and differences of various metabolic st

15、rategiesTllc main research contents and conclusions are as the followiney1Tl砖different culture conditions which include autotrophicheterotmphic andmixotrophic were designed and used to test the metabolic ability of JLT2016Theconclusion is that the strain JLT20 1 6 can indeed grow in autotrophic，hete

16、rotrophicand mixolrophic which means simultaneous autotrophic aud heterotrophicphysiologies2Tl硷consuming rate of the medium substrates and proteome analysis ofJLT2016 suggest that the carbon fixation of the bacteria cultured in the condition which contains glucose and sodium bicarbonate except for t

17、hiosulfate is almost absent The proteome also shows that thiosulfate have all impact on the expression ofRubisCO3The proteome analysis of JLT2016 revealed significant differences of expressions of protein which involved in various metabolic reactions in different culture COnditionsPhysiologic and pr

18、oteomic analysis ofa deep-sea Roseobacter sWain in this study provides the information of metabolic potential of deep-sea Roseobacter and the referenee for subsequent study ofdeep sea and Roseobacter ecological function万方数据AbstractKey Words：Deepsea；Roseobacter；Mixotrophic；Carbon Fixation；Sulfur oxid

19、ationIXI万方数据第一章绪论第一章绪论11海洋微型生物与海洋碳循环 地球上大约近34的面积是海洋，生活着地球上80的生物类群。海洋生物类群除了一些大型植物和动物外，海洋微型生物无处不在，通常包括微型真核 生物(鞭毛虫、纤毛虫等)、微型原核生物(海洋细菌、古菌及自养蓝细菌等) 等单细胞生物以及浮游病毒等个体较小(1000m) 占到了70的海洋水体(图11)，是生物圈中最大的栖息地(Copley,2002)，也是水生系统中最大的微生物圈(Whitman et a1，1998)。在有光合作用发生的 真光层中(200m以上)，光合作用产生的大部分的有机碳运输到深海被微型生 物呼吸消耗(Arist

20、egui et a1，2005)后，可能在几个月或几年的时间尺度中以二 氧化碳的形式回到大气中，而一些直接沉降到深海区域的颗粒有机碳(Particle Organic Matter。POC)或溶解有机碳(Dissolved Organic Matter，DOC)则可深 藏海底长达几个世纪。事实上，海洋中95的有机碳是溶解态的，而其中95 又是惰性的，可在海洋中保存5000年。黑暗的深海区是碳在生物圈中长期存储 的重要区域，是生物圈中最大的有机碳库(Llbes，1992；HansellCarlson,1998； Benner，2002)。所以海洋微型生物在海洋生态系统中的作用不仅是分解者或生产者

21、，更是对海洋碳循环中的储碳做出了重要的贡献。 深海中的微型生物种类繁多、数量巨大，仅深海沉积物中的原核生物的生物量就约占地球总生物量的1030(Parkes et a1，1994)。在较早期的研究认为 深海中的微型生物主要是利用海洋真光层沉降下来的有机物作为其营养物质的 来源进行异养代谢。到1977年，在加拉巴戈斯裂谷第一次发现一个深海热液生 态系统(Lonsdale 1977，Corliss et a11979)的生物类群以化能自养代谢生存为主 (Jannasch&Wirsen 1979，Jannasch&Mottl 1985)。近期，Swan等人通过单细胞和全基因组测序技术对两个亚热带环流

22、海区研究发现深海中广泛存在着大量 具有化能自养潜能的未能纯培养的细菌类群(Swan et a1，201 1)，这为深海微型 生物在海洋碳循环中的地位及意义提供了新的角度和视野。12海洋玫瑰杆菌类群的研究概况121玫瑰杆菌类群的概况与分布玫瑰杆菌类群是海洋中最丰富的浮游微型生物类群之一。其16S核糖体 RNA(rRNA)克隆文库分别占到某些海洋表层和深海沉积物细菌类群的总文库 的10-25和2-15(Moran et a1，2007)，其与海洋另一大细菌类群SARl 1一 样受到研究者的关注与重视(图12)。玫瑰杆菌属于变形菌门五个亚纲(a-亚 纲、p一亚纲、丫亚纲、6亚纲和一亚纲)中的叶亚纲，

23、隶属于其中的红螺杆细菌科(Garrityet a1，2005)，并且这一类群细菌的16S rRNA之间的相似性2万方数据第一章绪论均在89以上。SAR406肿arIrtegroupA SAR324(61i I】 图1-2海洋浮游生物中，细菌域中最常见的16S rRNA基因簇的出现频率(Munn,2003)Fig1-2 Frequency ofthe most common 16S rRNA gene clusters ofBacteria in marine plankton(Munn,2003)最先描述的玫瑰杆菌Roseobacter litoral西Ochl 14和Roseobacter

24、denitrificans Ochl49出现在1991年，呈玫瑰色，含有细菌叶绿素a，分自于海 洋藻类(Shiba，1991)。目前通过实验室人工培养方法分离和描述玫瑰杆菌类群 占预估玫瑰杆菌总数量的01。它们在海洋中分布极为广泛，从沿海到开阔大 洋、从极地冰区到热带海洋，几乎无处不在。并且多分离自多样化的海洋或盐水 的栖息地，如海洋沙滩、深海沉积物、潮滩沉积物(Selje et a1，2004；Shiba，1991； Lafayet a1，1995；Prokic et a1，1998)、黑海(Sorokin,1995)、北海(WagnerD6blerela1，2003)、半对流湖(Yurko

25、vaeta1，2002)、黑烟囱(Yurkov&Beatty,1998) 温泉(Petursdottir&Kristjansson,1997)、含有超盐性水的盐场(Dong Han Choi et a12006)，以及海鞘(Young-Ok Kim et a1，2012)和大型藻类等。在沿海和 表层，玫瑰杆菌类群更是重要的优势细菌类群(Giovannoni&Rapp6，2000；Gonzfilez et a1，2000；Suzuki et a1，200 1；Gonzfilez&Moran,1 997)。玫瑰杆菌分布虽然广泛且生存环境多样，但对于真光层200m以下的黑暗3万方数据第一章绪论海洋尤

26、其是深海(1000m)的广阔空间来说，分离较少。另外，约有60多株 玫瑰杆菌个体完成了全基因组测序，而仅有l株来自深海的Roseobacter sp SK2092-6菌株进行了单细胞测序。除此之外，目前对于深海玫瑰杆菌类群的基 因组信息还基本处于未知。122玫瑰杆菌类群的生理生化及生存代谢特征 复杂多样的生态环境决定了玫瑰杆菌类群多样化的生理特征和生存形式。首先，从已有的可培养的玫瑰杆菌的研究中体现了这个类群具有非常多样及丰富的 形态和生理特征，例如有些具有液泡(Gosink et a1，1997)，作为储能物质的聚 羟基丁酸酯(poly-13hydroxybutyrate granules，

27、PHB)(Cho et a12004)，玫瑰花环结构(Labrenz et aL，1998)，toga1ike晶体(Gonzalezet a1，2003)，并且可以分泌毒素(Gallacher et a1，1997；Hold et a1，2001)等多种次生代谢物质 (Brinkhofr酊a1，2004；Howard et a1，2008；Moranet a1，2007；Moranet a1，2004； Newtonet a1，2010；Swingleyet a1，2007)。另外，玫瑰杆菌类群生存营养代谢方 式也非常多样化，其中有的种类以单细胞形式生存，有的以多细胞小规模群居， 有的常与海洋

28、浮游植物、藻类、无脊椎动物和脊椎动物等共生。玫瑰杆菌类群中 一些菌株属于好氧不产氧光合细菌(儿廿B)功能类群或变形菌视紫红质(PR) 功能类群，能够进行光能混养代谢生存。一些玫瑰杆菌类群细菌还可以高效降解 芘、萘和荧葸等多种多环芳烃类化合物，氧化CO，还原亚硫酸(Sorokin，1995)， 降解藻类渗透物二甲基巯基丙酸内盐从而产生与气候调节相关的气体二甲基硫 (Zubkovet aL，2001；Zubkovet a1，2002)。13玫瑰杆菌类群的营养方式及混合营养代谢方式131玫瑰杆菌类群的营养方式由于玫瑰杆菌分布广泛，生活环境复杂多样，其生存代谢方式必然会受到环 境的影响呈多样化，并具有较高