RTPCR原理与实验操作步骤讲解.docx

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RTPCR原理与实验操作步骤讲解

RT-PCR原理与实验操作步骤

要点词：

链式反应

RT-PCR引物设计

逆转录酶reversetranscriptase

DNA聚合酶

聚合酶

一、知识背景：

1、基因表达：

DNARNAProtein

单拷贝基因表达存在逐渐放大概系，如一个蚕丝心蛋白基因

104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105

个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。

所以单拷贝基因的

mRNA表达水平对于其功能水平的调控是特别重要的。

2、PCR技术（olymerasechainreaction）：

即聚合酶链式反

应。

在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于

聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决

定。

反应分三步：

DNA

A、变性：

经过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链

DNA；

B、退火：

将反应混杂液冷却至某一温度，使引物与模板结

合。

C、延伸：

在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火

引物沿5'3'方向延伸。

以上三步为一个循环，这样频频。

3、逆转录酶和RT-PCR

逆转录酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，最少拥有以下三种活性：

1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：

以RNA为模板合成cDNA第一条链；

2、Rnase水解活性：

水解RNANA杂合体中的RNA；

3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：

以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.

二、RT-PCR的准备：

1、引物的设计及其原则：

1）引物的特异性决定PCR反应特异性。

所以引物设计能否

合理对于整个实验有着至关重要的影响。

在引物设计时要充

分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不一样亚型，不一样

的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性

的影响。

尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，也许在目的蛋白表达过程中特异存在而在其余亚型中不存在的内含子。

2）引物设计原则的掌握：

引物设计原则包含

a、引物长度:

一般为15～30bp，引物很短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超出Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。

b、碱基分布：

四种碱基最好应随机分布，防范嘌呤或嘧啶

的齐集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。

GC含量（Tm值）：

40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。

c、3'端要求：

3'端一定与模板严格互补，不可以进行任何修

饰，也不可以有形成任何二级结构的可能。

末位碱基是配的引起效率最低，G、C居中间，所以引物的用A、G、C而尽可能防范连续出现两个以上的

A时错3'端最好选T。

d、引物自己二级结构：

引物自己不该存在互补序列，不然

会自己折叠成发夹状结构或引物自己复性。

e、引物之间的二级结构：

两引物之间不该有多于4个连续

碱基互补，3'端不该超出2个。

f、同源序列：

引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8

个的互补碱基存在。

g、5'端无严格限制：

5'尾端碱基可以游离，但最好是G或C，

使PCR产物的尾端联合稳固。

还可以进行特异修饰（标志、酶切位点等）等等。

依据实验目的选择合适的引物。

常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。

2、耗材：

实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP

管之类早先都需经过0.1%DEPC水浸泡办理，除去RNA酶，

防范操作过程中RNA降解。

而后经高压灭活（灭菌和灭活

DEPC）。

3、试剂准备：

变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、

75%酒精、经DEPC办理并高压的水。

三、RNA的提取方法：

RT－PCR中从细胞分其余RNA的质量至关重要，包含RNA的纯度和完好性。

RNA分其余最要点要素是尽量减少RNA酶的污染。

但RNA酶活性特别稳固，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大批RNA酶。

所以在提取

RNA时，应尽量创建一个无RNA酶的环境，包含去除外源

性RNA酶污染和克制内源性RNA酶活性，主若是采纳焦

碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，经过RNA酶的

阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍克制

内源性RNA酶。

实验操作步骤

一、实验用具与资料：

1、移液枪：

1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

2、吸头：

1ml、200μl、20μl

3、匀浆管：

5ml

4、吸头台：

搁置1ml吸头的一个，搁置20μl吸头的一个

5、EP管：

1.5ml、0.2ml、100μl

6、试剂瓶：

2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）

1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）

7、量筒：

50ml、250ml、500ml

8、容量瓶：

250ml、500ml、1000ml

9、试管架：

5ml、1.5ml、20μl

10、盐水瓶：

250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，

另一个装DEPC水

11、铝制饭盒：

4个

12、塑料小饭盒：

1个

13、大瓷缸：

2个

14、锡泊纸：

一卷

15、卷纸：

2卷

16、三角烧瓶：

带盖，稍大二、实验用具的办理与准备

1、塑料制品：

（包含枪头、EP管、匀浆管等）

先将DEPC水沉着量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐一浸泡此中，此中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，而后高压，再烤干备用，实验前将枪优等放入吸头台，再高压一次（EP管）

2、玻璃制品：

泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）

3、匀浆器：

（包含剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需

要泡DEPC）

三、试剂配制：

1、DEPC水：

吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、75%乙醇：

用无水乙醇DEPC水配，而后放-20℃保存

（此中DEPC水需先高压）

3、异丙醇：

放入棕色瓶中

4、氯仿：

放入棕色瓶中

5、琼脂糖

四、几种缓冲液的配制：

1、电泳缓冲液：

Tris54g

硼酸

0.5MEDTA20ml？

蒸溜水1000ml

5×TBE（储存液）

再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml储存液450ml水--→500ml工作缓冲液

2、上样缓冲液：

0.25%溴酚蓝

0.25%二甲苯青FF

30%甘油

6×缓冲液，4℃保存

五、琼脂糖凝胶的配制：

1、1.0%：

1.0g琼脂糖100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，融化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温

下搁置30-45min后现进行电泳。

2、1.5%:

同上，将琼脂糖的量改为

六、需购置的RT-PCR资料：

（生工.Tel.2236106.）

Taq酶（含MgCl2Buffer）

dNTP:

1支

Oligo（dT）15:

1OD40.00promega

M-MLV:

1支250.00promega（Buffer）

RNasin:

1支110

---20℃

Trizol100ml/1瓶InvitrogenLifetechnologies

--4℃

Marker:

10μμ科威

（1543.994.697.515.377.231）

七、引物合成

正义：

5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′

反义：

5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′

2、par-4:

正义：

5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′

反义：

5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′

3、退火温度计算

2（AT）4（GC）

正反义均匀数，再上下颠簸度（±4℃，或±5℃）

4、引物各合成5OD，每OD一瓶分装好

5、引物稀释：

加DEPC水量为（μl）

=?

nmol/OD×管上所标OD数×100

是为10pmol/μ浓l度的引物溶液

八、PCR产物电泳

先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，频频

吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳

30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。

九、几个注意点：

1、逆转录的要点步骤是马上冰水浴？

2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。

3、RNA抽提早，打开离心计预冷。

TRIzol法抽提总RNA

细胞1×107

组织100mg

↓

加1mlTRIzol

细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块

↓

匀浆（要完全，后转至EP管）

（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）

↓

颠倒混匀10下，室温5分钟

↓

加氯仿1/5体积（0.2ml）（一定按整体积的1/5）

颠倒混匀10下，室温5分钟

↓

4℃，离心12000g，15分钟

↓

转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中

↓

加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟

↓

4℃，离心12000g，10分钟

↓

弃上清

↓

加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml

↓

4℃离心7500g，5分钟

↓

弃上清，空气干燥5-10分钟（不可以完好干燥）

↓

溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）

（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）

注：

1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，不然DEPC溶解

2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃搁置最少一个月（甚

至可一年以上）

3、RNA在75%乙醇中，2-8℃最少可保存一周，-20℃最少

可保存一年

两步法RT-PCR

（第一步：

逆转录反应）

试剂浓度体积终浓度

RNA23μμl）

μg/μl4μl（2μμg/μl

（稀释10倍后用）

↓

混匀，离心，70℃5min

↓

马上冰水浴，稍离心

↓

试剂浓度体积终浓度

M-MLVBuffer5×8μl（4μl）1×

dNTP10mM2μl（1μ

RNasin40U/μl1μμl）20μ

M-MLV200U/μl2μl（1μl）200U

整体积40μl（20μl）

↓

混匀，离心，42℃60min

↓

95℃10min（破坏MLV）

↓

4℃保存

两步法RT-PCR

（第二步：

PCR反应）

整体积20μl（50μl）

试剂浓度体积终浓度

TaqBuffer10×2μl（5μl_）1×

MgCl225mM1.2μl（3μ

dNTP10mM0.2μμl）<200uM

上游引物10pmol/μμl（1μl）10pmol

下游引物10pmol/μμl（1μl）10pmol

cDNA模板X（?

）（1-10μl）

DEPC水20μl-4.3μl-X