RTPCR原理与实验操作步骤讲解.docx

1、RTPCR原理与实验操作步骤讲解RT-PCR 原理与实验操作步骤要点词：链式反应RT-PCR 引物设计逆转录酶 reversetranscriptaseDNA 聚合酶聚合酶一、知识背景 ：1、基因表达： DNA RNA Protein单拷贝基因表达存在逐渐放大概系，如一个蚕丝心蛋白基因104 个丝心蛋白 mRNA（每个 mRNA 存活 4d ，可以合成 105个丝心蛋白） 共合成 109 个丝心蛋白。所以单拷贝基因的mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是特别重要的。2、 PCR 技术 (olymerase chain reaction) ：即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的

2、条件下依赖于聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：DNAA、变性：经过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA ；B、退火：将反应混杂液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C 、延伸：在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2 存在下，退火引物沿 5 3 方向延伸。以上三步为一个循环，这样频频。3、逆转录酶和 RT-PCR逆转录酶（ reverse transcriptase ）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，最少拥有以下三种活性：1、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链；2、 Rn

3、ase 水解活性：水解 RNANA 杂合体中的 RNA ；3、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性： 以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链 cDNA.二、 RT-PCR 的准备 ：1、引物的设计及其原则：1）引物的特异性决定 PCR 反应特异性。所以引物设计能否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不一样亚型，不一样的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，也许在目的蛋白表达过程中特异存在而在其余亚型中不存在的内含子。2）引物设计原则的掌握：引物设计原则包含a、引物长度 :一

4、般为 15 30bp ，引物很短会影响 PCR 的特异性，引物太长 PCR 的最适延伸温度会超出 Taq 酶的最适温度，也影响反应的特异性。b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，防范嘌呤或嘧啶的齐集存在，特别是连续出现 3 个以上的单一碱基。 GC 含量（ Tm 值）： 40 60 ， PCR 扩增的复性温度一般是较低 Tm 值减去 5 10 度。c、 3端要求： 3端一定与模板严格互补，不可以进行任何修饰，也不可以有形成任何二级结构的可能。末位碱基是配的引起效率最低， G、 C 居中间，所以引物的用 A 、 G、C 而尽可能防范连续出现两个以上的A 时错3端最好选T。d、引物自己二级结构：引

5、物自己不该存在互补序列，不然会自己折叠成发夹状结构或引物自己复性。e、引物之间的二级结构：两引物之间不该有多于 4 个连续碱基互补， 3端不该超出 2 个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8个的互补碱基存在。g、5端无严格限制： 5尾端碱基可以游离， 但最好是 G 或 C ，使 PCR 产物的尾端联合稳固。还可以进行特异修饰（标志、酶切位点等）等等。依据实验目的选择合适的引物。常用引物设计软件如 Primer5.0 ， Oligo6.0 等对于这些条件都可以自行设置。2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、 EP管之类早先都需经过 0.1%DEPC 水浸泡办理，

6、除去 RNA 酶，防范操作过程中 RNA 降解。而后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC ）。3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75% 酒精、经 DEPC 办理并高压的水。三、 RNA 的提取方法：RT PCR 中从细胞分其余 RNA 的质量至关重要， 包含 RNA 的纯度和完好性。 RNA 分其余最要点要素是尽量减少 RNA 酶的污染。但 RNA 酶活 性特别稳固，分布广泛，除细胞内源性 RNA 酶外，环境中也存在大批 RNA 酶。所以在提取RNA 时，应尽量创建一个无 RNA 酶的环境，包含去除外源性 RNA 酶污染和克制内源性 RNA 酶活性，主若是采纳焦碳酸二乙酯（ DE

7、PC ）去除外源性 RNA 酶，经过 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异 硫氰酸胍克制内源性 RNA 酶。实验操作步骤一、实验用具与资料：1、移液枪： 1ml 、 200l、 20l、 10l、 2l2、吸头： 1ml 、 200l、 20l3、匀浆管： 5ml4、吸头台：搁置 1ml 吸头的一个，搁置 20l吸头的一个5、 EP 管： 1.5ml 、0.2ml 、100l6、试剂瓶： 2 个 60ml 的棕色试剂瓶（广口，带盖）1 个 125ml 的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒： 50ml 、 250ml 、500ml8、容量瓶： 250ml 、500ml 、

8、1000ml9、试管架： 5ml 、 1.5ml 、 20l10 、盐水瓶： 250ml 、500ml 各 2 个备用，一个装无水乙醇，另一个装 DEPC 水11 、铝制饭盒： 4 个12 、塑料小饭盒： 1 个13 、大瓷缸： 2 个14、锡泊纸：一卷15、卷纸： 2 卷16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验用具的办理与准备1、塑料制品：（包含枪头、 EP 管、匀浆管等）先将 DEPC 水沉着量瓶中倒入瓷缸中， 将塑料制品逐一浸泡此中，此中小枪头需要吸管打入 DEPC 水，过夜，而后高压，再烤干备用，实验前将枪优等放入吸头台， 再高压一次 （ EP 管）2、玻璃制品： 泡酸过夜， 冲洗干净， 蒙

9、锡纸烤干备用 （ DEPC 水泡）（洗净后先泡 1DEPC 过夜，再烤干）3、匀浆器：（包含剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡 DEPC ）三、试剂配制：1、DEPC 水：吸出 1ml 放在 1000ml 双蒸水中配成 1 DEPC 水，放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时备用。2、 75% 乙醇：用无水乙醇 DEPC 水配，而后放 -20 保存（此中 DEPC 水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris 54g硼酸0.5M EDTA 20ml ？ 蒸溜水 1000ml5TBE （储存液）再将 5TBE 稀释 1

10、0 倍成 0.5TBE 就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取 50ml 储存液 450ml 水 -500ml 工作缓冲液2、上样缓冲液：0.25% 溴酚蓝0.25% 二甲苯青 FF30% 甘油6缓冲液， 4保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、 1.0% ：1.0g 琼脂糖 100ml 电泳缓冲液，微波炉中火 30 秒至沸腾，融化的琼脂物冷却至 60 时加入 10mg/ml 溴化乙锭 2.5 l，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下搁置 30-45min 后现进行电泳。2、 1.5%:同上，将琼脂糖的量改为 六、需购置的 RT-PCR 资料：（生工 . Tel. 2236106.

11、 ）Taq 酶（含 MgCl2 Buffer ）dNTP: 1 支Oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promegaM-MLV: 1 支 250.00 promega (Buffer)RNasin: 1 支 110- -20 Trizol 100ml/1 瓶 Invitrogen Life technologies- 4Marker: 10 科威（1543. 994. 697. 515. 377. 231 ）七、引物合成正义： 5-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC- 3反义： 5-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT- 32、 par-4:正义： 5-G

12、GGACCTCGGAACTCAAC- 3反义： 5-TGTATCTGCCTGGGACTG- 33、退火温度计算2（A T） 4（G C）正反义均匀数，再上下颠簸度（ 4，或 5）4、引物各合成 5 OD ，每 OD 一瓶分装好5、引物稀释：加 DEPC 水量为（ l）= ? nmol / OD 管上所标 OD 数 100是为 10p mol / 浓l度的引物溶液八、 PCR 产物电泳先将 1- 10l左右 PCR 产物，加已点在纸上的溴酸兰，频频吸打混匀后进行电泳， 一般电流为 10mA ，电源 100V ，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。九、几个注意点：1、逆转录的要点步骤是

13、马上冰水浴？2、 Rt 时，先打开 PCR 预热 30 分钟。3、 RNA 抽提早，打开离心计预冷。TRIzol 法抽提总 RNA细胞 1107组织 100mg加 1mlTRIzol细胞用 1ml 加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆（要完全，后转至 EP 管）（组织匀浆量 100mg 时分装 1ml/ 每 EP 管）颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟加氯仿 1/5 体积（ 0.2ml ）（一定按整体积的 1/5 ）颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟4，离心 12000g ，15 分钟转上层水相（约 400l）于另一 1.5mlEP 管中加等体积异丙醇（约 400l），混匀室温 10 分钟4，离

14、心 12000g ，10 分钟弃上清加冰预冷的 75% 乙醇（用 DEPC 水配） 1ml4离心 7500g ， 5 分钟弃上清，空气干燥 5-10 分钟（不可以完好干燥）溶于 DEPC 水中至 20l（10l-20l）（可在 55-60 水中， 10 分钟助溶）注：1、RNA 若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中， 不然 DEPC 溶解2、细胞组织加 TRIzol 匀浆后，可在 -60 搁置最少一个月 （甚至可一年以上）3、RNA 在 75% 乙醇中， 2-8 最少可保存一周， -20 最少可保存一年两步法 RT-PCR（第一步：逆转录反应）试剂 浓度 体积 终浓度RNA 23 l) g/ l

15、 4 l(2 g/ l（稀释 10 倍后用）混匀，离心， 70 5min马上冰水浴，稍离心试剂 浓度 体积 终浓度M-MLV Buffer 5 8 l (4 l) 1 dNTP 10mM 2 l (1 RNasin 40U/ l 1 l) 20 M-MLV 200U/ l 2 l (1 l) 200U整体积 40l（ 20l）混匀，离心， 42 60min95 10min （破坏 MLV ）4保存两步法 RT-PCR（第二步： PCR 反应）整体积 20l(50 l)试剂 浓度 体积 终浓度Taq Buffer 10 2 l (5 l_) 1 MgCl2 25mM 1.2 l (3 dNTP 10mM 0.2 l) 200uM上游引物 10pmol/ l (1 l) 10pmol下游引物 10pmol/ l (1 l) 10pmolcDNA 模板 X (?) (1- 10 l)DEPC 水 20l-4.3 l-X