实验绿色荧光蛋白.docx

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实验绿色荧光蛋白

生物技术实验报告

姓名：

张龙龙

学号：

2011506066

班级：

11级生技02班

前言：

绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。

GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27.0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。

1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.

一.实验目的

1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。

2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。

3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。

二．实验原理

基因工程一般包括四个步骤：

一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。

本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。

再利用双酶切切开表达载体pET23b和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。

将含GFP基因的重组表达载体导入宿主菌BL21（DE3）,在IPTG的诱导下，使GFP基因表达

3.实验材料及仪器

1、实验材料：

含有GFP的质粒；DNAMarker；DH5α；BL21；

2、仪器：

恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。

四.实验内容

4.1质粒的提取、酶切及电泳鉴定：

1）实验试剂：

LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸染色剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ（10U/μl）；NdeⅠ（10U/μl）；T4DNAlisase。

2）实验步骤：

质粒的提取与鉴定

（1）在含有质粒的DH5α平板菌落上挑取单菌落，接种于20ml含有100μl/mlApm的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。

（2）分装菌液到1.5ml离心管中，冰浴2min。

4℃、12000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。

再用同样方法收集一次菌体。

（3）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，涡旋剧烈振荡，混匀，冰浴10min。

（4）加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管5次，充分混匀，冰浴5min。

（5）加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置10min。

4℃、12000rpm离心10min。

（6）加等体积的酚/氯仿（1：

1），震荡混合有机相和水相，冰浴3min。

4℃、12000rpm离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中。

（7）加等体积的氯仿：

异戊醇（24：

1），振荡混合有机相和水相，4℃、12000rpm离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中。

（8）加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀DNA10-20min。

4℃、12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀（管底有少量白色沉淀）。

（9）分2次加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，抽吸去除所有上清，放置室温干燥，让酒精挥发。

（10）加30μlTE（内含浓度50μg/ml的RNaseA）溶解DNA，37℃放置30min，消化RNA。

-20℃保存备用。

（11）制1%的琼脂糖凝胶：

加25ml×TAE缓冲液于三角瓶。

称取0.25g琼脂糖加到三角瓶中，与微波炉加热至完全溶化。

冷却至60℃左右，加1μl的GoldView溶液，摇匀。

轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30min以上。

轻轻拔掉梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm。

（12）点样：

取5μl质粒DNA及2μl加样缓冲液混合上样，80—100v约电泳20—30min。

质粒DNA的酶切

（1）酶切：

按如下双酶切体系（20μl）混合

反应物

Ⅰ

Ⅱ

质粒

5μl

3μl

XhoⅠ（10U/μl）

0.5μl

0.5μl

NdeⅠ（10U/μl）

0.5μl

0.5μl

10×buffer

2μl

2μl

ddH2O

12μl

14μl

先加水，再加buffer，加质粒，加内切酶，放离心机上混匀。

在37℃水浴4h。

（2）电泳，在紫外观察分析仪上观察酶切结果。

4.2目的基因的获得和重组载体的构建

1）实验试剂：

模板DNA；dNTP；TaqDNA聚合酶；引物；10×buffer（内含Mg2+）；ddH2O；10×T4DNA连接酶buffer；T4DNA连接酶。

2）实验步骤：

目的基因的获得、检测及回收

（1）依次混匀下列试剂：

反应体系

ddH2O

9.5μl

Mix

12.5μl

上游引物

1μl

下游引物

1μl

模板

1μl

混合后瞬时离心。

（2）PCR反应程序

94℃预变性3min

94℃变性30sec

52℃退火30sec30个循环

72℃延伸1min

72℃延伸1min

4℃

（3）电泳：

扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。

（4）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。

（5）以0.1g凝胶对应300μl的体积加入PN。

（6）50℃水浴10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解。

（7）将上一步的到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管中，13000rpm离心60s，弃掉废液。

（8）加入800μl漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。

（9）加入500μl漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。

（10）将离心吸附柱放回收集管，13000rpm离心2min。

（11）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB30μl，洗脱缓冲液在65℃水浴中预热，室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回到离心吸附柱中，13000rpm离心1min。

（12）电泳检测回收产物，余置于-20℃保存。

重组质粒的连接

将PCR扩增的目的基因片段产物与PGM-T载体连接。

反应体系（μl）如下；

体系成分体积（μl）

溶液Ⅰ5

PGM-T载体0.2

目的基因产物4.8

将反应液混合，16℃30min。

4.3感受态细胞的制备及转化

1）实验试剂:

LB培养液；0.1mol/LCaCl2溶液；E.coliDH5α受体菌（R-M-）；LB培养基；氨苄青霉素；IPTG；X-gal。

2）实验步骤

感受态细胞的制备

（1）活化E.coliDH5α菌株：

将实验室保存的E.coliDH5α菌株甘油管用无菌去离子水1:

100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。

（2）按照1%接种量，从上述培养液中吸取菌液2ml，转接入200ml新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡继续培养至OD400值为0.3-0.5左右。

（3）在已灭菌的10ml离心管总吸取上述培养液10ml，冰浴20min后，4℃、6000rpm离心10min，收集菌丝，弃上清。

（4）加2ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，重悬菌体，冰浴10min。

4℃、6000rpm离心10min，收集菌丝，弃上清。

（5）将每一份沉淀轻缓的悬于0.4ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液中，轻轻重悬菌体沉淀。

冰上放置10min。

（6）分装100μl/管（冰浴分装），置-4℃冰箱保存。

连接产物转化感受态细胞

（1）转化用固体LB培养基平板的制备

向含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的固体LB培养基平板上加50mg/ml的IPTG16μl和20mg/ml的X-gal40μl，用灭菌涂布棒涂布均匀，37℃避光倒置3h，让溶解X-gal的二甲基酰胺尽量挥发干净。

加入IPTG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。

（2）连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞

①去5μl连接产物加到100μlE.coliDH5α感受态细胞（从-70℃冰箱取出放于冰上，带钢解冻加入连接产物）中，轻弹混匀，冰浴20min。

②取出离心管，42℃水浴热击90s，立即置冰浴中冷却3min。

③向离心管中加入900μl37℃预热的无抗生素的LB液体培养基，混匀后，37℃、200rpm振荡培养1h，复苏菌体。

④取出离心管，6000rpm离心2min，弃上清800μl，用剩余的月100μl上清液将沉淀菌体吹打混匀后，加到含100μl/ml氨苄青霉素（Amp）的IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀。

放在室温直至液体吸收。

倒置平板，37℃恒温培养14-16h，直至长出单菌落。

4.4重组子的筛选鉴定

1）实验试剂：

dNTP；Taq聚合酶；引物；10×buffer（内含Mg2+）；ddH2O；NdeⅠ；XhoⅠ；Apm；LB培养基

2）实验步骤

重组质粒的PCR鉴定

（1）挑取单菌落：

使用无菌枪头挑取5个白色单菌落，放入内含有氨苄抗生素的LB液体培养基的1.5ml离心管中，振荡培养4h以上，吸取0.5μl菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。

（2）PCR反应体系（10μl）

ddH2O

9.5μl

Mix

12.5μl

上游引物

1μl

下游引物

1μl

模板

1μl

混匀后瞬时离心。

（3）PCR反应程序

94℃预变性3min

94℃变性30sec

52℃退火30sec30个循环

72℃延伸1min

72℃延伸1min

4℃

（4）电泳：

扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。

重组质粒的酶切鉴定

（1）挑取上述经菌液PCR鉴定为阳性的菌落，接种到20ml含60μg/mlApm的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜。

（2）质粒DNA的提取（碱裂解法），加50-100μlTE（内含50μl/ml的RNAaseA）溶解DNA，37℃放置30min，消化RNA。

（3）双酶切鉴定体系：

用限制性内切核酸酶对PCR阳性菌落提取的质粒做双酶切鉴定。

酶切体系（20μl）

体系成分

体积

质粒

5μl

XhoⅠ（10U/μl）

0.5μl

NdeⅠ（10U/μl）

0.5μl

10×buffer

3.0μl

ddH2O

11μl

4.5目的基因在原核细胞中的表达

1）实验试剂：

LB培养基；kan；IPTG。

2）实验步骤

（1）重组质粒的转化：

将重组质粒转化表达宿主菌E.coilBL

（2）重组质粒的鉴定

（3）重组质粒的诱导表达

五.实验结果与分析

实验一：

质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定

实验结果：

当时实验时，有两个是只加氯仿，还有两个是按实验步骤操作的，结果只有两条明显的条带.如图2所示。

有条带的是1、4管

没有条带的是2、3管

实验分析①在实验过程中，试剂添加失误或试剂配制不成功。

导致未提出纯化DNA。

②杂质没有去除干净，DNA没有完全提纯

③加入酚/氯仿没有被异戊醇/氯仿中和完全，导致那两个失败。

实验二：

目的基因的获得和重组载体的构建

实验结果跑胶结果：

与maker比较得bpDNA

胶重：

3g电泳检测结果：

与目的基因大小一致

实验三：

大肠杆菌感受态的制备和连接产物转化感受态细胞

实验结果：

失败，没有筛选出蓝白斑

实验分析：

①在实验过程中，操作不严谨，不够细心

②小组成员在无菌操作时其他组员在旁边说话，可能谈话的过程中，使溶液或器皿受到污染，导致实验失败

③在涂板时，没有将溶液均匀地涂开或涂板的时间太短，导致实验失败

实验四:

重组质粒的酶切和PCR鉴定

实验结果：

获得重组质粒操作过程中仪器故障

实验分析：

①刚开始实验失败，失败的原因是PCR仪在工作时突然停止，导致重组质粒在PCR扩增时没有充分扩增，导致实验失败。

②图片上最后一个条带有点暗，原因是点滴的体积太少。

实验五：

目的基因在原核细胞中表达

实验结果:

可观察到荧光络合物。

如图4所示

实验分析：

归功于小组团员的团结和努力

六．实验讨论

讨论：

重组质粒转化率不高，其原因可能有以下几点：

（1）生长时期：

实验发现在对数中期的大肠杆菌易生感受态，转化时菌浓度应控制在不超过107个/ml。

浓度过高或者过低都会影响转化效率。

（2）CaCl2法0℃放置时间的影响：

细菌经0℃CaCl2处理后转化率随时间的推移而增加，24h达到最高，之后转化率逐渐下降。

（3）化合物及无机离子的影响：

在钙离子的基础上，联合其他二价金属离子或还原剂等物质处理细菌，可使转化率提高100-1000倍。

（4）质粒大小、构型的影响：

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。

转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。

1ng超螺旋DNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。

一般情况下DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。

（5）防止杂菌和杂DNA的污染：

整个操作过程均应在冰浴低温和无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、EP管等均应彻底洗净，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

（6）试剂的质量：

所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

（7）42℃热处理时间很关键，转移速度要快，且温度要准确，同时注意热处理过程中离心管不要摇动。

（8）菌液涂平皿操作时，应避免反复来回涂，因为感受态细胞的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。

心得体会：

本实验设计是一个综合性的，与我们平时实验经历相比对我们的要求更多更严。

它主要要求我们形成认真思考的习惯，自己查阅本实验的相关文献，分析本实验的目的，通过本实验要达到什么样的结果，达到预计的结果需要通过怎样的方案实现，根据实验需要和自己的相关了解自己设置适合的实验方案，增强我们的思维能力和动手能力，同时也使我们的团队合作精神得到了提高，并学会把我们所学的知识有机的结合到一起。

七．参考文献

参考文献

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9959-9960

图一

图二

图三

图四