生物专业综合实训指导书.docx

生物专业综合实训指导书.docx

《生物专业综合实训指导书.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物专业综合实训指导书.docx（32页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

生物专业综合实训指导书

生物产品生产实训

指导书

生物技术教研室编写

2011年7月

目录

第一章生产实训实施管理规则…………………………………………………2

第一节实训目的与生产组织…………………………………………………2

第二节生产条件要求与步骤…………………………………………………3

第二章酵母生产技术…………………………………………………………5

第一节酵母菌种选育………………………………………………………………6

第二节培养基制备…………………………………………………………………8

第三节菌种扩培……………………………………………………………………11

第四节酵母发酵生产………………………………………………………………13

第五节酵母过滤分离………………………………………………………………19

第六节酵母产品质量分析和生产成本核算…………………………………………19

附录1：

发酵罐操作使用规程……………………………………………………20

附录2：

酵母生产中的检验和分析………………………………………………23

附录3:

酵母发酵力的测定…………………………………………………………30

第二章糯米甜酒的生产技术……………………………………………………31

第三章传统小曲米酒生产技术…………………………………………………32

第一章：

生产实训实施管理规则

第一节实训目的与生产组织

一、实训目的

本次实训是在校内进行的一次生产性实训，学生将利用生物工艺实训室的设备为客户生产食用活性干酵母、糯米甜酒、小曲米酒和果蔬酒。

在这次实际生产实训过程中学生将有机会全面应用所学的专业知识和生产管理知识，并进一步熟练专业技能。

学生经过这次实训将熟练掌握以下知识和技能。

1、微生物菌种选育、纯化和保藏的有关知识和技能；

2、微生物菌种扩大培养的有关知识和技能；

3、培养基制备的有关知识和技能；

4、发酵罐及其附属设备和管路等结构原理和操作技能；

5、发酵工艺制定和过程参数的控制的技能。

6、分离发酵产品的知识和技能；

7、发酵产品生产过程质量控制的知识和技能；

8、原材料、中间制品和产品的检验知识和技能；

9、发酵工厂生产管理的技能。

二、生产组织机构与管理

1、组织机构

全班分若干个组，每组为一个独立生产单位，负责完成食用活性干酵母生产任务。

每个生产单位设置的生产岗位有：

（1）厂长：

全面负责生产组织；

（2）生产技术岗：

负责制定生产工艺及生产控制指标。

（3）质量控制岗：

负责原材料、中间制品和产品的分析与检验

（4）菌种选育岗：

负责酒曲、酵母的选育、纯化和保藏，为生产提供合格优良菌种；

（5）菌种扩培岗：

负责酒曲、酵母的扩大培养为发酵提供充足优良菌种。

（6）培养基制备岗：

负责制备合格的培养基；

（7）发酵岗：

负责发酵生产；

（8）产品提取岗：

负责从发酵液中分离提取产品。

2、生产管理

按发酵工厂的管理模式管理整过生产实训过程。

实行白班制，必要时进行加班，学生上下班要考勤。

每一个独立生产单位下班时要写交班记录。

教师将按生产秩序、设备与仪器使用熟练程度、产品成功率、生产绩效来考核各小组与个人。

交班记录（表头）

班组

生产时间

年月日时至年月日时

生产情况

存在问题及建议解决办法

备注

当班班长：

第二节生产条件、要求和步骤

一、生产条件与要求

1、产品名称：

食用活性干酵母、糯米甜酒、小曲米酒和果蔬酒；

2、产品质量：

执行国家标准；

3、产量：

食用活性湿酵母250g以上、糯米甜酒和小曲米酒各1KL；

4、客户提供的原料：

糖蜜，麦芽，糯米和大米，其它由生产者自备。

5、客户提供的主要生产设备：

10L发酵罐1个，小型粉碎机1台、恒温培养箱1台，摇床1台，过滤机1台，离心分离机1台，分析检验仪器1套。

二、生产进程

第一阶段：

准备阶段

1实训动员，学生分组并接受生产任务。

2认真阅读生物技术综合实验指导书，回答各章节的思考题。

3查阅资料，阅读指导书，掌握食用活性干酵母、糯米甜酒、小曲米酒和果蔬酒的生产技术并制定初步的生产工艺方案，包括工艺流程及参数、具体工作进度表以及有关检验方法。

4向实训室管理教师领有关实训仪器、试剂。

5熟悉生产设备，熟练发酵罐的操作。

第二阶段：

糯米甜酒和小曲米酒的生产

1酒曲的选用。

2培养基制备。

3发酵。

4酒过滤与蒸馏。

5酒陈酿。

6酒质量测定。

第三阶段：

活性干酵母生产用酵母菌种的选育和保藏

7酵母的选育用的培养基制备

8钭面、平板的制备。

9美兰染色液的配制。

10酵母的分离和纯化。

11酵母菌种质量鉴定。

12酵母的保藏。

第四阶段：

酵母菌种扩培和发酵用培养基制备

1估算种子扩培及发酵生产用培养配方，并计算其用量。

2确定培养基制备工艺：

糖蜜处理工艺、麦芽汁制备工艺。

3进行培养物料衡算，根据制备工艺制备培养基

4培养基质量检测

第五阶段：

酵母菌种的扩大培养

1制定种子扩培流程。

2确定各级培养基的配方。

3估算各级培养基的用量。

4配制各级培养基并灭菌。

5进行扩大培养。

6各级培养结束，必须进行镜检观察酵母形态，测定酵母的大小、浓度、出芽率、死亡率，并测定培养液中的残糖。

第六阶段：

酵母上罐发酵生产

1制定上罐发酵工艺（接种量、罐压、温度、pH值、通风量和糖浓度）

2配制发酵初始培养基及流加糖。

3发酵罐空消。

4发酵罐实消。

5流加糖及其它流加物灭菌。

6发酵过程操作控制。

7发酵过程检测（残糖、酵母的大小、浓度、出芽率、死亡率）。

8绘制发酵过程中的酵母曲线

第七阶段：

酵母的分离

分离酵母，并测定湿酵母的重量。

第八阶段：

产品质量检验和成本核算

1酵母产品发酵力的测定。

2核算生产成本

第九阶段：

实训用品的整理清洗并归还，然后组织笔试、实训后的讨论、总结。

第十阶段：

整理生产记录报告，并及时上交。

第二章：

酵母生产技术

目前，人们已公认单细胞蛋白（singlecellprotein,简称SCP）是最具应用前景的蛋白质新资源之一，对于解决世界蛋白质资源不足问题方面将会发挥重要作用，与传统动、植物蛋白质生产比较，发酵技术生产SCP不受季节影响和耕地的制约，具有生产效率高等特点。

酵母是SCP资源之一，由酵母开发出的产品多种多样，其中全酵母产品有压榨鲜酵母、活性干酵母、药用酵母、饲料酵母等，酵母提取产品有核苷酸、酶类、维生素类、辅酶类等，这些产品广泛应用于食品、饲料、医药、精细化工等众多领域。

目前在广东省生产酵母所用的原料主要是甘蔗制糖生产的副产品糖蜜和麦芽汁，其生产技术请参考糖厂综合利用、啤酒发酵工艺技术和酒精生产技术等。

一般的生产工艺流程是：

麦芽→麦芽汁制备→麦芽汁

糖蜜→糖蜜处理→清净糖蜜→上罐培养配制→发酵→硅藻土过滤→湿酵母

下班生产菌种→菌种扩培→上罐菌种

第一节酵母菌种选育

    优良的酵母菌种是酵母生产的基础和关键，要使酵母生产的产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。

理想的酵母生产工业发酵菌种应符合以下要求。

（1）遗传性状稳定；

（2）生长速度快，不易被噬菌体等污染；

    （3）酵母的产量尽可能接近理论转化率；

（4）酵母的发酵力大，不会分泌对人体有害的物质；

（5）尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离；

（6）培养基成分简单、来源广、价格低廉；

    （7）对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；

（8）对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。

    菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育，以及根据遗传学基础理论和方法，人为引起的菌种遗传变异或基因重组,如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等技术。

后一类方法在微生物的菌种选育工作中占踞主导地位，其中通过分子生物学手段，定向构建基因工程菌是微生物育种的重要发展趋势。

当然，菌种选育的前提条件是从自然界获得相应的原始菌种。

1.从含有酵母原始菌种的样品中获得新菌种原理

通过分离纯化获得新菌种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。

其原理请参阅《工业微生物学》有关内容。

2.材料和仪器设备

1含有酵母原始菌种的样品3支；

212oBx的麦芽汁，已处理的糖蜜，面粉、食盐，还原糖测定试剂。

3三角瓶、烧杯、糖度计、灭菌锅、培养箱、发酵力测定装置。

3.分离纯化步骤：

①工艺流程：

菌悬液制备→梯度稀释→稀释液涂布平板→28~30℃培养36~48h→挑单菌落划斜面→28~30℃培养36~48h→斜面菌种→性能测定→生产菌种

②培养基：

在12oBx左右麦芽汁中，加入2%（w/w）的琼脂，加热溶解，调pH6.4左右。

各阶段要求：

◎a、菌悬液制备：

称取一定量菌种来源物，放入装有100mL无菌水和玻璃珠的三角瓶内置于摇床摇晃30分钟，使样品中微生物细胞充分分散悬浮于水中，制成菌悬液；

◎b、菌种梯度稀释：

菌种梯度稀释是为了在平板能形成单菌落，通常可将上述菌悬液依次稀释为10－5、10－6、10－7、10－8浓度梯度；

◎c、平板涂布：

将上述各浓度梯度分别涂布麦芽汁琼脂平板，每个浓度分别涂3个。

将涂布好的平板在培养箱中于28~30℃培养36~48h；

◎d、挑单菌落：

从培养好的平板上，挑选生长旺盛，菌落边缘齐整且比较大的酵母单菌落，分别接种至二支斜面，在培养箱中于28~30℃培养36~48h。

一支用于性能测定，一支保藏在冰箱作生产备用种。

◎e、性能测定：

通过镜检、小样摇试和发酵力测定对菌种进行筛选，确定最终生产种。

备选菌种性能测定表（表头）

备选菌种编号

评价指标

生产用种编号：

注：

1、平板制备方法：

在12oBx左右麦芽汁中，加入2%（w/w）的琼脂，加热溶解，调pH6.4左右，装入带棉塞的试管中，在高压灭菌锅中灭菌，于0.07MPa下保温15分钟，然后冷却至50℃左右，倒入事先已包扎灭菌好的平皿中。

2、评价指标由生产者参考工业微生物和发酵技术确定

第二节培养基制备

本次实训生产酵母用的原料是糖蜜和麦芽，要经处理后主可被酵母菌利用，其处理工艺原理和工艺参数确定方法请参考参考糖厂综合利用、啤酒发酵工艺技术和酒精生产技术等有关资料。

一、麦芽汁制备

1.工艺流程

麦芽→粉碎→糖化→过滤→煮沸→冷却沉淀分离→麦芽汁

2.材料与与仪器

1大麦芽（无霉变、虫蛀）。

2水浴锅、烧杯、比色板、碘液、玻璃棒、纱布、漏斗、电炉、高压灭菌锅、粉碎机、过滤机、糖度测定仪。

3.生产操作说明

1根据物料衡算结果，称取大麦芽，用粉碎机粉碎（粉碎度适中，麦皮不能过碎）。

2按质量比：

麦芽粉：

水=1：

6加水。

3参考啤酒工艺的糖化工艺操作进行糖化操作。

4用麦糟过滤，沉淀物，得澄清的麦芽汁。

5将滤得麦芽汁煮沸15分钟，过滤、冷却至10℃，取上清液。

⑥灭菌：

把制得麦芽汁置于三角瓶中，瓶口加盖棉塞，在高压灭菌锅中灭菌，于0.07MPa下保温15分钟。

注：

上罐发酵用的麦芽汁经煮沸40分钟，过滤后即可使用，不必冷却。

糖化工艺生产记录（表头）

时间

物料量与工艺参数

1、

2、

3、

4、

设定值

实际值

操作人

备注

二、糖蜜处理的方法

1.工艺流程

原糖蜜→稀释→酸化→加热、通风→中和→沉淀分离→过滤→清糖蜜

2.材料与与仪器

原糖蜜、硫酸、氧化钙、还原糖测定试剂

不锈钢锅、烧杯、pH计、电炉、高压灭菌锅、过滤机、锤度计，常规玻璃仪器。

3.糖蜜处理量的计算：

根据发酵工艺要求的最后发酵体积及发酵液的菌体浓度要求，结合菌体对糖蜜的得率常数，计算所需的总糖量，再乘以放大系数1.2，作为最后需要糖蜜总量。

4.糖蜜处理步骤:

◎稀释

糖蜜稀释至30~40oBx。

◎调酸

一般用浓硫酸调节pH值至3.5左右，硫酸的用量视糖蜜品种和产地不同而有所区别。

由于酸中带有阳电荷的氢离子和带阴电荷的糖蜜胶体物质相互作用，胶体凝聚成絮状物，使之沉淀分离；加酸使部分双糖转化为单糖；加入的硫酸与后来加入的石灰乳作用生成硫酸钙沉淀，在沉淀过程中吸附胶体色素等；加酸后释放的挥发酸，可在加热和通风时被驱逐。

◎加热煮沸并通风

加热煮沸并通风60~90min，促使胶体蛋白质凝固，便于沉淀；杀死营养细胞；驱逐有害气体。

◎加碱中和

加石灰乳调pH值至5.0~5.5，并适当补加水使其浓度为30~40oBx，便于杂质沉淀排除。

◎澄清

静止澄清24小时以上，取上清液过滤备用。

糖蜜处理生产记录（表头）

时间

物料量与工艺参数

1、

2、

3、

4、

设定值

实际值

操作人

备注

5.糖蜜处理工艺评价

处理后的糖蜜质量

◎外观：

清澈透亮、棕色或红棕色，无沉淀和明显悬浮物。

◎总浓度30~40oBx，含可发酵性糖250g/L左右，pH5.0~5.5。

◎钙的含量<0.02%；胶体含量<0.1%；灰份含量低。

发酵糖转化率计算

糖蜜处理工艺评价表（表头）

工艺方案

评价指标

1、

2、

备注

第三节菌种扩培

菌种扩大培养的生产目的是从少量酵母繁殖出大量质量高的酵母细胞，以供给发酵罐发酵时所需酵母种子。

本次实训生产酵母的扩培工艺方案确定，请参考糖厂综合利用、啤酒发酵工艺技术和酒精生产技术等有关资料。

一、扩培工艺流程

分离纯化原种→钭面试管培养→液体试管培养→一级三角瓶培养→二级三角瓶培养→上罐

要求：

1、接种量10%~15%；

2、上罐时间要安排在上午7：

30~8：

00之间。

3、每级扩培转接时间不能安排在下半夜。

二、扩培培养基

在工业生产与实验室中常用的酵母培养基配方如下，仅供参考，实施方案由生产者查阅有关资料确定：

培养基1：

葡萄糖50克磷酸二氢钾2.5克尿素1克

酵母膏0.5克硫酸镁1克硫酸铁0.1克

孟加拉红（1%）0.23毫升水1000毫升

培养基2：

马铃薯（去皮）200克水1000毫升

将马铃薯洗净去皮，称取200克，切成小块，加1000毫升煮沸1小时，用双层纱布滤成清液。

加水补充因蒸发而减少的水分。

培养基3：

蔗糖150克蛋白胨5克磷酸二氢钾5克

硫酸镁2克碳酸钙5克水1000毫升

培养基4：

蛋白胨3%酵母膏0.5%酪蛋白水解物0.5%

葡萄糖4%硫酸锌1.4%自然PH值

培养基5：

豆汁100毫升酵母膏2克葡萄糖3克

自然PH值

豆汁制备：

取黄豆100克，加水1000毫升，煮沸30—40分钟取汁备用。

培养基6：

将普通麦芽汁稀释到12°Bx，调pH约6.4即成。

培养基7：

将普通麦芽汁稀释到12°Bx，加营养盐后调pH约6.4即成

扩培过程注意事项：

1、在菌种扩培过程中，必须严格采用无菌操作方法，手、接种针及三角瓶瓶口均需用75%酒精擦拭。

2、菌种在扩培过程中必须镜检跟踪酵母的生长状况。

菌体形态正常，圆形或椭圆形，没有杂菌；菌体内较少空泡；出芽率20~30%；美蓝染色，酵母菌的死亡率在1.0%以下。

酵母培养液应具有酵母香味或少许酒味，不能有其他杂味。

三、扩培操作说明

1、斜面试管培养：

首先用12oBx麦芽汁加入2%琼脂，制成试管斜面培养基，灭菌后备用。

在无菌条件下，将原种一环，转接到上述培养基中，在28~30℃下培养2~3d，待斜面上长了白色菌苔，即培养成熟。

2、液体试管培养：

用12oBx麦芽汁制成试液体试管培养基，灭菌后备用。

在无菌条件下，将斜面种一环，转接到上述培养基中，在28~30℃下培养24h。

3、三角瓶培养：

按制定配制三角瓶培养基，灭菌后备用。

将上述液体试管种全部倒入三角瓶，然后进行摇床培养，150rpm，28~30℃，8~12h，镜检酵母形态、测定浓度、出芽率、死亡率。

培养成熟后，将培养液接入下一级。

四、成熟培养醪（种子液）的质量要求

生产者要参考糖厂综合利用、啤酒发酵工艺技术和酒精生产技术等确定成熟培养醪（种子液）的质量要求。

一般的质量要求如下：

①酵母细胞形态整齐，健壮，不携带有任何其它杂菌；

②酵母细胞数≥108/ml；

③出芽率≥25%；

④死亡率≤1%；

⑤耗糖率为50%左右；

6酸度不增加。

菌种扩培生产记录（表头）

种子编号

时间

物料量与工艺参数

1、

2、

3、

4、

设定值

实际值

操作人

备注

第四节酵母发酵生产

在进入酵母生产之前，首先必须熟悉相关的发酵设备的操作规程和注意事项，相关内容见附录1。

一、酵母发酵工艺原理

当成熟种子液接种到发酵培养基中，其繁殖生长是随时间而变化的。

通常人们把酵母繁殖生长分为五个时期，即停滞期、对数生长期、减速生长期、静止期和衰老期。

了解各个时期的情况对扩大培养酵母是有帮助的。

停滞期：

酵母在此期间细胞代谢旺盛，降解培养基成分酶含量提高；同样合成细胞组织的酶水平也提高。

这阶段由于细胞新陈代谢需要能量。

细胞贮藏物质降解，细胞干物质稍降低，此时间的长短与接种细胞的老幼及培养基成分有关，老细胞停滞期长，幼细胞则短，培养基营养好停滞期短，反之则长。

对数生长期：

这是酵母生长最旺盛的时期，酵母在恒定的时间间隔中，每个细胞以出芽繁殖，一个变成两个，所得的两个细胞在一定时间内变成四个，依此类推繁殖下去。

对数生长期的长短依培养基的组成、通氧等情况而定，至营养成分枯竭，代谢产物增多，酵母繁殖速度才受到阻碍。

扩大培养酵母最适当的移种时间是在对数生长期，此时虽然酵母总细胞数没有达到最高点，但出芽率最高，可达60%以上，死亡率最小，可在1%以内。

此时移种有最短的停滞期，并且以最大速度迅速增长。

减速生长期：

在此期间，酵母生长迅速降低，每次繁殖时间变化，酵母出现明显的死亡，但总的细胞数仍在增长，只不过增加速度已较对数生长期为迟缓。

静止期：

此期间新细胞的产生和老细胞的死亡几乎维持恒定，细胞总数恒定或稍有增加。

对酵母来说每毫升发酵液细胞数可达1亿个，但细胞出芽率较低，死细胞及老细胞数多。

如果在此时移种，一定时间内强壮酵母反而比对数生长期少。

衰老期：

此时期酵母死亡数已超过新细胞的产生。

这是由于培养基中营养耗尽，pH下降、代谢产物的积累所致，一部分细胞自溶为另一部分细胞吸收，活细胞减少。

根据发酵产品性质的要求，发酵结束的时间可以选择在对数生长期或减速生长期或静止期。

例如，若是生产酵母蛋白饲料，发酵结束的时间可以选择在静止期。

当然，酵母发酵生产最好的结果肯定是在单位时间内、在单位容积的发酵罐中获得最多且活力最高的酵母。

酵母发酵生产受培养基组成、温度、pH值、通氧量等因素影响，为了获得尽可能多且活力高的酵母，应注意控制以上各个因素，满足酵母的繁殖生长，可延长酵母的对数生长期，不但酵母活力高，而且随着对数生长期的延长，酵母细胞数量也不断增加。

①温度：

培养酵母之最适温度为26~30℃；

②pH值：

发酵液的pH之所以维持4.2~4.5，主要在防止细菌侵入，因为细菌生长的pH范围在6.0~8.0。

如pH低于4.0，则酵母易被着色，故pH不能过低，若pH过低，应及时用碱液调整。

③通气：

通气的目的在于防止酒精生成，并促进酵母繁殖。

因此发酵液中，必须供给充分的可溶性氧。

从理论上而言，氧化一公斤糖约需1.006kg（0.726m3）氧气，但实际上溶氧受发酵罐的许多条件下影响，故所需空气量并不一定。

根据White的研究，氧化0.454kg糖蜜大约需要3.09m3空气。

④糖液流加量：

酵母的收率能否达到最高，要视糖被利用的情况来决定。

换言之，即完全不生成酒精的条件下，分次供给糖分最佳，此为流加法。

另外，培养酵母时要注意酵母对糖的得率。

酵母的生长与代谢不仅取决于是否有氧，而且与糖的浓度有关。

由于酵母具有Crabtree效应，当培养基中糖含量高时，即使在有氧条件下，酵母在生长的同时，也会产生大量的乙醇，从而使酵母对糖的得率下降。

为了得到较高的酵母得率，就必须控制培养液中的糖浓度。

不同的酵母菌种，其Crabtree效应的强弱有所不同。

一般来说，酿酒酵母具有较强的Crabtree效应，而假丝酵母等的Crabtree效应相对较弱。

如果采用一次性投料的方法生产酵母，若培养基糖浓度低，虽然可获得较高的酵母得率，但培养浓度太低，造成设备利用率太低；若培养基糖浓度高，虽然可获得较高的酵母浓度，但酵母得率较低。

因此，酵母的高密度培养采用一次性投料的分批培养是不行的，而采用流加培养的方法可望获得满意的结果。

在流加培养过程中，培养基中的糖浓度可按工艺要求控制在较低的水平，在培养过程中根据酵母的耗糖情况流加浓糖溶液，酵母利用多少就补加多少，理想状态是流加速率等于酵母的耗糖速率，使培养基中糖浓度保持在较低的含量。

这样，酵母处于低糖条件下生长，因而酵母得率高，随着流加培养过程的进行，酵母的浓度也就越来越高。

根据White的理论，酵母的生长率及由糖生成的酵母量，均能用公式算出来。

然后根据计算值，来决定糖液的供应量。

通常酵母细胞在充分通气及充足营养条件下，酵母之生长率可由下式计算出：

P——接种的酵母量

A——培养t小时后的菌体量

一般工厂培养酵母时，可得

=1.15~1.25（M=0.1398~0.2231）的生长率，又每100公斤糖可制得56.7公斤的干酵母，故由此关系可求每小时的耗糖量。

⑤氮源的供给：

以糖蜜为原料的流加发酵法生产酵母时，氮源非常缺乏，因此必须另添加氨水、硫铵、尿素等。

至于添加量，每10000公斤应添加硫酸铵50公斤。

⑥磷酸的供给：

糖蜜中非常缺乏磷酸盐，故必须另添加磷酸盐或磷酸。

使用量为酵母重量的3%，亦即为糖蜜的6%。

根据我们目前的具体情况（设备和检测等），保持在很低的残糖浓度状态下连续流加浓糖液的工艺较难实现。

因此，我们只能选择残糖浓度在5%左右进行间歇流加浓糖液的工艺，即把一定量的酵母种子培养醪接种到发酵培养基中进行生长繁殖，发酵过程控制温度为28~30℃，通风比为1:

1.0~3.0，pH值为4.2~5.5，当培养基的营养成分消耗至较低浓度（4%左右）时必须及时流加富含营养成分的浓糖液，经过8~12小时发酵，最后成熟发酵醪送去分离收集酵母。

二、发酵培养基的配制及灭菌

1.干燥酵母化学组成

每100