香菇菌种生产的方法与步骤.docx

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香菇菌种生产的方法与步骤

香菇菌种生产的方法与步骤

（一）母种生产培养基的配方选择

一是马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基（PDA）：

去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂16~23克，水1000毫升。

氢离子浓度1000~10000纳摩／升（pH5~6），用于分离、培养菌种。

二是PDA改良培养基（甲）：

马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾（KH2PO4）2克，硫酸镁（MgSO4）0．5克，维生素B110毫克，琼脂20克，水1000毫升，灭菌后氢离子浓度3163～10000纳摩／升（pH5．0～5．5），用于培养、分离菌种。

   三是PDA改良培养基（乙）：

马铃薯（去皮）200克，麸皮或米糠50克，硫酸镁0.5克，维生素B110毫克，琼脂20克，灭菌后氢离子浓度3163～3981纳摩／升（pH5．4～5．5）。

   四是PDA改良培养基（丙）：

心材木200克，细米糠（或麸皮）100克，硫酸铵1克，麦芽糖（或葡萄糖）20克，琼脂20克，水1000毫升，灭菌后氢离子浓度3163～10000纳摩／升

（pH5.0～5.5），用于分离菌种。

   五是麦芽浸膏、酵母浸膏、琼脂培养基（MYD）：

麦芽浸膏3克，葡萄糖10克，酵母浸膏3克，琼脂20克，蛋白胨5克，水1000毫升（用于菌种培养）。

   六是麦芽浸膏、蛋白胨培养基（MPA）：

麦芽浸膏20～25克，蛋白胨10克，琼脂20克，水1000毫升（用于分离、培养、保存菌种）。

   上述6个培养基配方中，马铃薯、葡萄糖、琼脂（PDA）配方应用最普遍。

在此着重介绍PDA培养基的配制方法与步骤：

   1．制备培养基的操作程序

   选择优质马铃薯，去皮或挖去发芽眼，削去发青皮，切成薄片，称取200克，置于钢精锅，加水1000毫升，煮沸后小火保持30分钟，趁热用8层纱布过滤后放人有1000毫升刻度的量杯（或量筒）中，补充水到1000毫升，倒回钢精锅，加琼脂继续加热，待琼脂溶化后，再加葡萄糖，再补水至1000毫升，用玻璃棒搅均匀，趁热分装试管，或装入三角瓶备用。

   2．分装试管

   将配制好的PDA培养基，趁热（60℃）倒人事先准备好的量杯或玻璃漏斗，分装试管。

每支试管装培养基为管长的1／4，培养液不可贴附管口壁，如有沾附物必须揩拭干净。

   3．做棉塞

   取适量棉花做成较紧实的棉塞，塞入试管约2厘米左右，外留1厘米，紧贴试管壁，松紧度以用手指提起棉塞而不脱掉为宜，光圆不起皱（如图3—1），尔后将试管放入铁丝筐。

   4．灭 菌

   将装有培养基的试管放人灭菌锅的铁丝筐，上面盖上牛皮纸或聚丙烯塑料薄膜，包扎好，以防棉塞受潮。

加热灭菌时，排尽锅的冷气，当温度升到121℃时，维持30分钟后停止加热。

待指针回到零点，先打开锅盖的1／10开度，等到无直冲蒸气时，再打开全部锅盖，取出试管。

   5．在斜面上摆放试管

   将取出的试管冷却到50～60℃后，放到用木架或木条摆成一定角度的斜面上，小试管斜面长2厘米，大试管（18×200）斜面长6厘米左右。

待完全凝固后，收取备用。

   6．灭菌效果检查

   随机取3管斜面，放在28℃下进行空白培养5～7天后，检查斜面上有无细菌和霉菌菌落。

如果发现有杂菌，说明灭菌不彻底，要重新灭菌。

（二）接种与培养

   1．接 种

   在无菌室（接种室）或接种箱，酒精灯火焰旁进行无菌操作。

具体程序如下：

左手拿菌种管和待接种的斜面试管，右手拿接种耙，在火焰上来回烧红，拔去菌种管的棉塞，将管口在火焰上烧一下，再把接种耙烧一下，迅速插入种管，稍加冷却，切取米粒大小菌丝块（一定要带培养基），迅速放入待接种管斜面中心位置（为争取时间，在斜面接两点以上为宜），拿出接种耙后，再把管口烘烤一下，烧一下棉塞，迅速塞好棉塞，灼烧一下接种耙。

到此即完成了一个接种程序，以下依此类推。

   2．培 养

   将接种后的试管，放入培养箱或培养室进行恒温培养（25℃±1℃），或利用适宜的自然气温培养。

要保证培养室空气新鲜，环境干净，无光或弱光。

为此，必须保持空气相对湿度

70％左右，在试管上盖上纱布，或盖上薄棉毯，拉上窗帘，形成无光培养。

因试管斜面长短不同，一般需经8～14天培养，才能长满试管斜面。

   （三）母种质量检查及提高纯度对策

   1．斜面优质菌丝形态

   在马铃薯、葡萄糖、琼脂（PDA）培养基斜面上，菌丝生长洁白，呈棉绒状，密度一致，前沿菌丝（先端）整齐，粗壮。

有的棉绒状菌丝发达，如香1号，Cr-02；有的棉绒状菌丝不发达，如271A，271B，早生一号。

后者比前者菌丝生长快，但菌龄较长。

   2．斜面菌丝不纯现象

   在斜面上菌丝灰白，棉毛菌丝不平坦不整齐，前沿菌丝不齐、有缺口，这说明有杂菌污染。

如斜面上有异色，可能是镰刀菌污染。

如斜面上特别是菌丝边缘出现粘稠状物即蜡状、油状，可能是细菌污染。

如斜面上呈黄、绿、黑等颜色，则可肯定是霉菌污染。

若斜面产生色素，也表明有杂菌污染。

将斜面对着光看背面，如有小黑点遮光，说明杂菌菌落被香菇菌丝覆盖了。

   3．提高香菇母种纯度的措施

   必须使培养基彻底灭菌，严格无菌操作，保持培养环境干燥、清洁、恒温、无光、空气流畅，从而保证菌丝健壮生长。

如发现母种有异常现象，应予剔除。

   二、原种生产与质量标准及保证对策

   原种和栽培种的培养料配方制作技术基本相同，只是装料容器大小不同。

因此，本节只介绍原种生产技术，栽培种生产技术在相关章节中介绍。

（一）培养料配方选择

   共有7个配方可供选择，前3个为常用配方，后4个为参考配方。

①木屑78％，麸皮（或米糠）20％，蔗糖1％，石膏1％。

②木屑63％，棉籽壳20％，麸皮15％，蔗糖1％，石膏

1％。

⑧木屑60％，蔗渣18%，麸皮20％，蔗糖1％，石膏1％。

④稻草（麦草）58%，砻糠30％，木屑10%，糖1％，石膏1％。

⑤发酵松树、杉树木屑50％，木屑28％，麸皮20％，糖1％，石膏1％。

⑥棉籽壳40％，木屑40％，麸皮18%，糖1％，石膏1％。

⑦花生壳80％，杂木屑19％，石膏1％。

   上述7个配方都要求含水量在60％左右，氢离子浓度（pH值）随自然情况。

配方中各原料一般在3个月前备好。

（二）培养料配制的方法和步骤

   1．时间安排

   春、秋、冬季节皆可，晴天或阴天配料装瓶最为理想。

夏天宜在每天早、晚配料装瓶，应在4小时装好瓶。

   2．生产组织

   使用一台机器，由6人操作。

其中1人向斗铲料，1人装瓶，1人洗瓶，2人做棉塞，1人运输。

   3．配料前的木屑处理

首先过筛（2～3目），用竹筛或铁筛皆可，筛除掉有棱角的木块、木条、木片等硬物。

然后，按照生产计划和配方成分（百分率），称好主料、辅料和添加剂。

接着，将各种原料混合拌匀，有机器用机器拌，无机器用人工来回拌3～4次。

最后，再加入适量的水，继续用机器拌3分钟或用人工拌3～4次。

对出现的团块一定要拍散，或用铁筛过筛。

在配料过程中，需灵活掌握以下3点：

（1）灵活掌握含水量：

对干料、细料、质松料，加水宜多一些；对粒硬、吸水差的料，加水宜少一些。

在晴天、高温、秋千天气而水蒸发量较大时，加水宜多些；在阴雨、空气偏湿而水不易蒸发时，则加水宜少一些。

在水泥场地拌料，加水可少一些；在干泥渗水场地拌料，加水宜多一些。

在高海拔地区，加水宜多一些

（2）拌料要均匀：

要做到主料、辅料、添加剂均匀，干湿均匀，酸碱度均匀，不结块。

   （3）操作要敏捷快速：

在气温28℃，如拌料灭菌时间过长，则料易变酸，接种后轻则发菌慢，重则不发菌，而且易使杂菌病毒发生。

因此，必须根据机械化水平和劳动者的技术熟练程度，安排好每日的生产量，保证适时快速装袋（瓶），及时灭菌。

在高温期间从拌料到灭菌，不能超过4小时；在低温期间从拌料到灭菌，要求不过夜。

（4）搞好环境卫生：

选用的原材料要无霉变，配料前要曝晒，拌料装瓶环境要清洁，尽量减少空气中的杂菌孢子率。

 （三）装瓶（袋）

   使用机器装瓶，平均每人每日可装720多瓶。

具体操作程序如下：

装料至瓶颈，清洁瓶口，用小木棒或试管将料压实，并呈凹式，将瓶口外壁洗净。

   （四）做好棉塞

   取一块完整而略大于掌心的棉絮，其大小厚薄正好适合瓶口的大小长短，平摊在左掌心，右手捏住棉絮边缘往卷成圆形，尔后用右手的拇指和中指相对捏住棉絮，接着用左手的

拇指和食指也相对捏住棉絮，再用右手趁势捏成棉球，塞人管口或瓶口2／3处。

   （五）灭菌

   常用的高压灭菌锅分为立式或卧式两种。

在高度密封的高压锅，通入高压蒸气，达到彻底灭菌的方法，称为高压蒸气灭菌，又叫湿热灭菌。

原种和栽培种的培养料，由于不易被

蒸气穿透，灭菌时必须在150千帕即1．5千克／厘米2。

条件下灭菌2.0～2.5小时。

在灭菌的全过程中，要严格操作规程，并注意掌握3点：

①料瓶和料袋排放密度要适当，使蒸气流畅，无死角。

②通蒸气前，检查安全阀是否灵活，有无故障。

③通蒸气后，打开排气阀，驱散锅冷空气（自身发生蒸气的高压锅应加足水），或关上排气阀，接通蒸气。

待压力升至0.5千克／厘米。

时，开阀放气。

待指针回到0位时，保持5分钟，再关上排气阀。

等压力升到1.5千克／厘米。

时，灭菌2.0～2.5小时。

然后让其自然冷却，当压力指针回到0位时，打开锅盖或门的1／4开度，继续让热烘烤棉塞，防止骤冷。

接着趁热取出料瓶（袋），送入清洁消毒过的冷却室。

   也可以用常压灭菌法，常用的是灭菌灶或灭菌箱。

以低压蒸气进行灭菌的方法，称为常压蒸气灭菌法。

这种灭菌法投资省，可自行建造，取材容易，成本低廉，适用于农村。

缺点是灭菌时间长，能耗大。

常压灭菌法的具体操作程序是：

①当点火发生蒸气时，打开放气阀排出冷空气，直至见到放出的直冲蒸气后，再排气5分钟，接着关上阀门，待气温升到100~102℃时，开始计时，连续保持8小时以上。

②料瓶叠放，瓶颈朝，瓶底朝外。

料袋按品字形叠放，以求压力平衡。

行间要留有间隙。

③点火前，将铁锅加足水。

在灭菌的全过程中要注意铁锅的水位，保持通水流畅，且水温较高。

④在灭菌的全过程中，火力应按猛攻→恒温→徐降的程序掌握。

即开始升温火力宜猛，尽快达到100℃，防止升温缓慢，时间过长，引起原料变酸。

当温度升到100℃时，要保持温度不变，不能时高时低，以免影响灭菌效果。

当到达灭菌时间后，让仓（膛）温度缓缓降低，直降至60℃，方可开门取物。

（六）冷却接种 ①接种前必须使料瓶（袋）冷却到适宜温度，防止高温接种热死种菌。

接种前半小时，将原种瓶、接种工具及用品放入接种箱（或接种室），然后用5%石炭酸液向上下周壁喷雾消毒，并开启紫外线灯照射灭菌半小时。

启用久停不用的接种箱（室），事先必须用高锰酸钾和甲醛薰蒸处理。

②接种时，操作人员进入接种室前，先用肥皂洗手，换工作服，戴上口罩和工作帽，穿上工作鞋，手在1％～2％来儿液或0.25％新洁尔灭液中浸泡2分钟。

尔后，用5％石炭酸液，对接种室上下及四壁、工作台、凳等喷雾消毒，边喷边后退到缓冲室，关上接种室的门。

待5分钟后，将菌种带入室进行接种操作。

③接种前1分钟，用75％酒精擦手，严格无菌操作（同母种无菌操作法），要求有序不乱，操作敏捷快速，减少室空气流动。

接种时，将种管用脱脂棉蘸上75％酒精，进行种管外壁消毒。

接着，拔取棉塞，用火焰烧一下管口（或瓶口），把烧过的接种耙迅速插入种管冷却。

尔后将斜面前端1厘米长的菌丝块挖去，剩余斜面分成4～6段，分别取出接人原种瓶的穴位中心。

一管母种可接4～6瓶原种。

   （七）接种结束后的工作

   接种完成后，立即将台面收拾干净，将各种剩余物，如种管、洒落的培养基、消毒用过的棉花等均拿出室外，照前述方法进行第二轮接种前处理。

   （八）培养管理

   第一，对培养室必须进行清洗、消毒处理后，方可使用。

   第二，将接种后的原种瓶（袋）搬人培养室，保持温度在24±1℃，调节空气湿度在70％左右。

垂吊黑色窗帘，进行无光培养。

待菌丝吃料1／5后，加强通风换气，保持室空气新鲜。

一般培养40～50天，菌丝即可长满种瓶（250毫升瓶装）。

   第三，培养期间可能出现的异常现象：

一是在原种瓶的不同部位滋生杂菌。

二是菌种块不萌发。

三是菌丝不吃料。

   第四，异常现象发生原因及防治对策：

   一是由于棉花塞受潮，易滋生粉红链孢霉菌。

瓶周壁发生分散杂菌落，可能是瓶子破裂，也可能是灭菌有死角。

若到处有杂菌发生，肯定是灭菌不彻底，应重新灭菌。

少数原种瓶发

生杂菌，应及时清除。

接种块四周发生杂菌，是接种工具消毒灭菌不严或空气污染造成的。

种块滋生杂菌，可能是母种块带杂菌，或接种工具烧灼灭菌不严。

发现上述杂菌危害后，必须密切注视，及早清除，以防蔓延。

大批发生杂菌感染，应及早重新彻底灭菌，重新接种，不可延误。

   二是种块不萌发的原因很多，主要有以下几种情况：

接种工具烧灼后未冷却就挖取菌丝块，菌丝被烫死；菌丝被火焰烧死；母种干涸老化，失去萌发力；消毒熏蒸过头，使菌丝受毒害；培养温度不适宜。

针对上述情况，可采取如下防治对策：

加强计划性，培养适龄母种，不用老化母种，以提高萌发力；熏蒸消毒要适量，避免过量，防止将菌丝杀死；接种工具烧灼后，冷透后方可取种菌丝；菌丝离火焰稍远一些，以防烧死菌丝。

   三是菌丝种块虽能萌发，但不吃料，其原因主要是：

接种块与培养料结合不紧密；培养料含水偏少；培养料中有抑制菌物存在，使菌丝不能生长；培养室控温失灵，高温热死菌丝。

针对上述情况，可采取如下防治对策：

接入种块时，应将种块向料揿一下，使其与培养料紧密结合；坚持随拌料，随装瓶，及时灭菌，防止培养料变酸；购买木屑要严格选择，不要购买有抑制菌丝生长的木屑；时常检查温控是否失灵，发现问题及时修理，以防高温烧死菌丝；配料时不要随意添加或过量添加有害物质，以防菌丝生长受到抑制。

   （九）原种的质量标准

   1．优良原种的主要标准

   从外观看，菌丝浓白呈棉绒状，木屑培养料变为淡黄色，菌丝粗壮，双核有锁状联合，菌丝长满瓶后10天左右表面分泌褐色水珠，有少量菌丝扭结或有原基出现，或菌丝将培养料包成块状（结合相当牢）。

这种原种应视为良种，无疑可用于生产。

   2．劣势原种的主要表现

菌丝表面出现拮抗线，菌丝纤细，生长速度缓慢，单核无锁状联合，菌丝脱壁、萎缩、发黄、老化，这种原种不能用于生产，更不能用于转接生产种（或再生原种）。

受热害后，恢复生长原种，可以用于生产。

香菇菌种质量退化现象及预防

 一、菌种质量检验及标准

 菌种质量的优劣，直接关系到栽培的成败及香菇的品质。

菌种质量检查主要包括两个方面：

一是菌株纯度识别；二是菌种质量优劣识别。

（一）菌种质量标准

   一个好的菌种，应具备自身的质量标准，包括标名、菌丝形态、菌丝长势、菌丝纯度、特种香味等主要指标。

   1．标 名

   相当于商品的标牌。

菌种生产单位应在种管（瓶）上标明名称、编号、温型、接种日期，购买者亦应检查有无标名。

   2．纯 度

   一是指菌株菌丝的纯度；二是指杂菌污染程度。

菌株的纯度通过培养菌丝形态特征来识别。

在多级（一、二级）菌种培养基中，凡是发现有其他生物体存在，都可认为是菌种不纯，这种菌种不可使用。

反之，在多级菌种培养基中，只有香菇菌株生长，无其他生物体存在，则认为是高纯，可以用于生产。

   3．香味   

   当打开棉塞（或其他包扎物）闻到有独特的芳香味，而无异味，应认为是优良菌种。

反之，当打开棉塞闻到霉味，这是霉菌滋生感染；如有恶心味，并在培养基边缘和管壁交界处出现

淡黄色或乳白色糊状物，这是细菌感染，均应淘汰。

   4．长势

   是指菌丝形态正常，生长旺盛，而无抑制线、无吐水、无萎缩现象。

优良菌丝生长形态呈绒毛状，浓密，粗壮，均匀齐整，生长速度快，分解培养料能力强，出菇快，出菇适时，出菇多，转潮快，产量高。

反之，生活力差的菌株，菌丝生长缓慢，分解培养料能力弱，出菇迟，产量低。

   5．活力

   从原种瓶（袋）中随机挖取一块菌种，感觉到有韧性，不松散，培养料呈淡黄色。

将样块置于新的培养基上，在29℃±1℃下培养，观察菌种块四周新菌丝萌发快慢。

萌发快者可使

用，恢复活力差者不宜采用。

（二）菌种质量检验方法

   在生产过直接观察和出菇试验，判断菌种优劣，确定其能否使用。

   1．直接观察

   不管是自己选育还是引进的菌株，都必须仔细观察菌株的性状，如色泽、味道、长势，活力恢复，生长速度及均匀度等，并确认有无其他生物体存在。

   2．显徽镜检查

   选取小量菌丝制片，观察菌丝有无分枝、有无细胞横隔、有无锁状联合及其他细胞结构特征，这些均与出菇多少有关。

   3．菌丝生长速度测量

在一般情况下，用斜面或平板培养菌株，测量菌丝生长速度，要求菌丝表面平坦，扩殖均匀，菌丝前沿整齐。

4．耐高温试验

   菌株经斜面培养l周后，分出1组试管置于30～33℃下培养24小时，再放回适温下培养，观察菌株的生活力和适应环境变化的能力。

   5．吃料能力观察

   将菌株接人最佳原种培养料中，适温培养1周后，观察接种块菌丝萌发和吃料的情况。

这种方法也是选择培养料配方的一种手段。

 6．出菇试验

   这是选择优良菌株最基本的方法，即菌株用于生产前，必须作出菇试验。

可采用瓶（袋）栽培的方法作出菇试验，以当家菌株为对照，每个菌株栽培的瓶（袋）不少于10个，最好50

个。

在试验过程中，观察记载某菌株的出菇期、出菇数量、菇形大小、肉质厚薄、菌柄长短及菌盖颜色等，最后进行产量和质量分析。

   （三）母种原种质量标志

   1．母 种

采用马铃薯、葡萄糖、琼脂（PDA）培养基，在斜面25℃培养10~14天后进行观察。

优良母种的质量标志是：

菌丝长满斜面，略有爬壁现象，菌丝洁白，有光泽，粗壮，分枝多，生长浓密，呈绒毛状，平坦，紧贴管壁；培养基含水量适宜，不干缩，不黄化；转接到新培养基上，萌发吃料快，长势又快又旺。

早熟菌株存放时间长会形成原基，因此必须掌握适龄使用，避免原基形成。

2．原 种

优良原种的质量标志是：

菌丝长满瓶后，菌丝洁白，粗壮浓密，生长均匀，有光泽，香味浓郁；培养35~45天后，表面菌丝（即绒毛菌丝）生长旺盛，菌丝分泌棕褐色水珠，培养料变为淡黄色，且不松散，有一定弹性，菌丝聚集成白色小棉球，在此以前使用最好。

如果菌丝与瓶壁脱离、萎缩，产生较厚的褐色菌膜，说明菌种已老化，要尽快使用，并去掉老化膜，取用中间菌种块。

如木屑培养料未变黄，说明培养时间短，可继续培养一段时间，尔后再使用。

二、菌种退化现象及预防

（一）菌株退化现象

   在生物的进化过程中，遗传性变异是绝对的，而稳定性却是相对的；退化性变异是大量的，而进化性变异却是个别的。

因此，优良菌株种性不是永恒的，而是变化的。

   1．现 象

   在菌株用于生产及保藏过程中，常常出现菌株渐渐丧失原来的生活力和丰产性状，如长势差了、出菇迟了、产量低了、质量劣了等现象，这通常可以认为是菌株退化了。

具体地说，

菌株退化的主要表现是：

菌丝生长速度慢，在培养基上出现白色浓密的扇形菌落，对不良的外界环境抵抗力弱，子实体提前形成或推迟，出菇潮次不明显，菌盖菌柄畸形多，产量下降，品质变劣。

   2．原 因 ①菌株种性不稳，多为杂合性，细胞核杂合，遗传上出现分离变异，丧失原有的某些种性。

②培养条件不适宜，长期在人工培养条件下不能满足野性要求，失去自我调节能力，失去正常生理功能，不能表现出优良性状。

③就某菌株而言，随着培养和使用时间的延长，个体菌龄越来越大，新代机能逐渐减退，失去抗逆能力或高产性能，严重者丧失使用价值。

④菌株被病毒寄生。

香菇菌株退化与感染病毒的症状类似，即菌丝长势减弱，分解培养料的能力下降，导致畸形菇增多，产量及质量下降。

据研究，不正常菌丝体分离出4纳米（nm）的球状病毒颗粒，而正常菌株菌丝没有发现这种病毒颗粒。

这一结果表明，香菇感染病毒后，菌丝体的代活力受到严重抑制，分解木质素、纤维素和半纤维素能力下降，致使出现菌丝生长速度转慢、形态失常和退化等典型病毒感染症状。

因此，可以认为病毒感染的菌丝症状，是菌株退化的一种主要表现。

（二）菌株退化的预防

   将表现出退化的菌株进行种性恢复的技术过程，称为复壮，这是预防菌株退化的主要途径。

   1．控制传代次数

   菌株退化是一个渐变过程。

为了减缓或预防这种渐变的发生，应控制传代次数，最好保持传代1～3次为好。

   2．更换培养基营养成分

   在生产中长期使用一种培养基，常会引起退化。

因此要注意变换培养基的营养成分和配方，最好让菌株回到适宜树种段木或适宜树种木块上培养，并给予适宜的环境条件，这样可

以增强菌株生活力和丰产性状。

   3．选用适当的分离方法

   即利用有性繁殖的方法获得菌株，再以无性繁殖方法保持其优良性状，使菌株的变异遗传朝着生产需要的方向发展。

   4．控制病毒侵染途径

   科学研究认为，病毒是通过菌丝融合而传播，控制有性杂交过程是防止病毒侵染的主要方法。

因此，可采用酶标免疫技术、单克隆抗体技术或DNA探针技术，检测香菇菌株是否感染病毒，对香菇菌株退化进行监测和预防。