分子生物 仪器.docx
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分子生物仪器
分子生物实验仪器
施冬艳
目录
实验室内所有设备都有潜在的危险，操作方法不正确，就会出现意外，所以实验室中的所有仪器的使用都应在老师的指导下进行，或者阅读本仪器的使用说明书后，方可使用。
不仅如此，正确地使用仪器对整个实验都有着至关重要的作用，操作不当还可能会对实验结果产生意想不到的影响，浪费时间和精力。
所以在使用仪器前我们要清楚它们的原理以及注意事项，下面我们就分类地来看一下分子生物实验室常用的仪器。
一、灭菌
在分子生物学实验中，许多溶液、玻璃器皿和微量移液器枪头都要高压灭菌，特别是在做RNA有关实验时，更需要干热及湿热高压灭菌，以去除RNA酶，电热干燥箱主要用于干热灭菌；而高压灭菌锅主要用于高压湿热灭菌。
1、电热干燥箱
以电热恒温干燥箱为例，
使用方法：
1．操作者先把所需的产品排列在箱内的隔板上。
2．关好箱门，打开总电源，然后打开仪表上的电源----高温鼓风机开关，观察仪表指针是否会走动。
调动该产品所需的最高温。
并且每隔10分钟看一次观察指针是否已经走动，不然就说明内部有故障，及时关电检修。
3．待到最高温时，机器自动切断电源进入恒温状态，关掉电源（高温开关），并且保温30分钟。
4．关掉总电源，开箱，并将产品冷却，整齐摆放在容器内待转序。
注意事项
在放置待灭菌物品时注意不要碰壁
2、高压灭菌锅
热可以灭活一切微生物，包括细菌繁殖体、真菌、病毒和细菌芽胞。
因此，热力灭菌在所有可利用的灭菌方法中应用最早、效果最好、使用也最广泛。
热力灭菌包括干热灭菌和湿热灭菌。
由于干热灭菌所需的温度较高，并且时间较长，如乙型肝炎病毒在压力蒸汽121℃下作用1min就能破坏其抗原性，却能耐受干热160℃达4min。
因此，湿热灭菌在医院物品灭菌中占主导地位。
灭菌时，锅内的温度和压力呈一定的协调性，只有蒸汽的压力和温度相匹配才是保证灭菌效果的重要条件。
例如，灭菌器内的超热蒸汽很难达到灭菌效果。
所谓超热蒸汽是指在一定压力下，温度高于在该压力下水的蒸发曲线要求的蒸汽。
超热蒸汽遇到待灭菌物品时不能充分凝结成水，不能释放出足够的热能，不利于灭菌。
另外，灭菌效果还跟蒸汽的饱和度有关，如果灭菌室内的空气未排除或未完全排除，则蒸汽达不到饱和，压力和温度的协调性破坏，可导致灭菌失败。
另外，若空气未完全排除，饱和蒸汽不能穿透到待灭菌包裹的中心部位，会发生包内温度低、包外温度高的情况，致使包内达不到灭菌要求。
此外，水质、水温和蒸汽饱和度都会影响灭菌的效果，特别时蒸汽饱和度，灭菌器应使用干燥程度不小于0.9的饱和蒸汽，即蒸汽含水量不超过10%。
当锅内温度到达121℃，压强达到0.14MPa时，是杀灭芽孢的最有效条件。
芽孢是某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体，芽孢有极强的抗热、抗幅射、抗化学药物和抗静水压等的能力。
如肉毒梭菌在100℃沸水中，要经过5.0~9.5小时才被杀死，至121℃时，平均也要经10分钟才能杀死；芽孢的抗紫外线的能力，一般要比其营养细胞强一倍；芽孢的抗辐射能力要比大肠杆菌的营养细胞强36倍。
芽孢的休眠能力也是十分惊人的，在休眠期间，不能检查出任何代谢活力，因此也称隐生态。
一般的芽孢在普通的条件下可保存几年到几十年的生活力。
操作步骤：
（一）、放置排气贮存桶
1.从灭菌器中取出排气贮存桶，取下桶盖。
2.将水注入至最低水位以上，不需要太满，因为在灭菌时桶中的水会有所增加，如高于最高水位时应排掉部分。
盖紧桶盖。
3.确认排气软管的填密件可靠的插入到排气贮存桶的孔中（一边左右来回转动，一边塞到底部）。
4.确认排水阀处于关闭状态。
5.将排气贮存桶收存于灭菌器中，并确认排气软管未折叠或未扭曲（往外拿出排气贮存桶时不可强制性取出）。
（二）、接通电源开关
6、控制杆关闭时显示设定内容（设定温度、时间），进入到待机状态。
7、确认灭菌器箱内温度时同时按下增减按钮，显示当前温度。
8、控制杆打开时，显示灭菌器箱内的现在温度。
（三）、打开灭菌器盖子
9、务必在打开盖子前确认①电源开关处于接通状态②压力表处于0Mpa（兆帕）③控制杆锁定指示灯不发光
10、一面将盖子往下压，一面将控制杆滑动到[打开]位置
11、慢慢地打开盖子（相反的动作关闭盖子）。
（四）、注入加热用水
12、加入蒸馏水至加热器罩的水位水准器配件尖端浸入水中为止（大约4-5L）。
（五）、放入灭菌物品
将灭菌物品放入附属不锈钢筐中，再将筐轻轻地放置于灭菌器箱室内，注意：
不要让灭菌物品堵塞灭菌器箱室内的空和温度传感器，也不要让温度传感器受力，否则会导致控制失控和灭菌不充分。
（六）、关闭灭菌器盖子
1.根据数字显示部件Ⅰ，确认灭菌器箱室内温度在60℃以下。
（温度不到25℃时，显示[L0]）
2.检查确认盖子衬垫和灭菌器箱室开口部分未曾弄脏，也未粘附灰尘（否则可能引起蒸汽泄漏）。
3.一面将盖子向下压，一面将控制杆滑向“关闭”位置，数字显示部件显示设定温度和时间。
注意事项
1、每次使用时要注意国内的水位是否在最低水位以上
2、使用前检查下仪器以及线路是否有损坏
二、离心机
离心具有分离速度快，效率高，液相澄清度好，操作时卫生条件好等优点，适合于大规模的分离过程。
根据离心方式的不同，可将离心分离法分为差速离心和区带离心等。
差速离心是生化分离中最为常用的离心分离方法。
以菌体和细胞的收集或去除为目的的固液分离是分级离心操作的一种特殊情况，称为一级分级分离。
在差速离心操作中，离心转速和时间等操作条件要根据实际物系的特点（目标产物和其他组分的性质和相互作用）、分离目的和所需的分离程度来选择，从而使料液中的不同组分得到分级分离。
区带离心作为一种生化研究的重要分离手段，根据离心操作条件的不同，区带离心可以分为差速区带离心和平衡区带离心两种。
区带离心一般适用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化。
缺点是处理量小，仅限于实验规模。
几乎每个分子生物学实验都要用到离心机，一个分子生物学实验室至少需要4台离心机，分别为一台低速（20000r/min）冷冻离心机、一台超速（20000-80000r/min）离心机、一台可离心1.5mL微量离心管的微型（MINI）离心机、一台大容量、低速度的离心机用来收获大量的细菌培养液。
各种离心机的操作方法都大相径庭，主要涉及转速，时间，温度、转子号等参数。
操作步骤：
1.离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使机器处于水平位置以免离心时造成机器震动。
2.打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先以托盘天平平衡好的样品放置于转头样品架上（离心筒须与样品同时平衡），关闭机盖。
3.按功能选择键，设置各项要求：
温度、速度、时间、加速度及减速度，带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆输入的各项信息。
4.按启动键，离心机将执行上述参数进行运作，到预定时间自动关机。
5.待离心机完全停止转动后打开机盖，取出离心样品，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。
离心机使用注意事项
（一）、挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏，以免腐蚀机腔或造成事故。
离心机在预冷状态时，离心机盖必须关闭，离心结束后取出转头要倒置于实验台上，擦干腔内余水，离心机盖处于打开状态。
（二）、转头在预冷时转头盖可摆放在离心机的平台上，或摆放在实验台上，千万不可不拧紧浮放在转头上，因为一旦误启动，转头盖就会飞出，造成事故！
（三）、转头盖在拧紧后一定要用手指触摸转头与转盖之间有无缝隙，如有缝隙要拧开重新拧紧，直至确认无缝隙方可启动离心机。
（四）、在离心过程中，操作人员不得离开离心机室，一旦发生异常情况操作人员不能关电源POWER），要按STOP。
在预冷前要填写好离心机使用记录，并定期对机器各项性能进行检修。
（五）、不得使用伪劣的离心管，不得使用老化、变形、有裂纹的离心管。
（六）、在节假日和晚间最后一个使用离心机例行安全检查后方能离去。
七.在仪器使用过程中发生机器故障，部件损坏情况时要及时与技术人员联系。
运行注意事项
（一）、为了确保安全和离心效果，仪器必须放置在坚固水平的台面上，工程塑料盖门上不得放置任何物品；样品必须对称放置，并在开机前确保已拧紧螺母。
（二）、使用前应检查转子是否有伤痕、腐蚀等现象，同时应对离心杯做裂纹、老化等方面的检查，发现有疑问立即停止使用，并与厂方联系；开机运转前请务必拧紧转头的压紧螺帽，以免高速旋转的转头飞出造成事故。
（三）、转速设定不得超过最高转速，以确保机器安全运转。
使用中如果出现0.00或其他数字，机器不运转，应关机断电，10秒后重新开机，待所设转速显示后，再按运转键，机器将照常运转。
（四）、不得在机器运转过程中或转子未停稳的情况下打开盖门，以免发生事故。
（五）、离心杯必须等量灌注样品，切不要使转头在不平衡的状况下运行。
（六）、离心机一次运行最好不要超过60分钟。
（七）、离心机必须可靠接地；外接电源系统的电压要匹配，机器不使用，请拔掉电源插头。
使用注意事项
（一）、离心机在运转时，不得移动离心机。
（二）、安放离心机的地面应坚实平整，二只调平螺杆调节使离心机与地面接触和均匀受力，以免产生振动。
（三）、离心管加液应称量平衡，若加液差异过大运转时会产生大的振动，此时应停机检查，使加液符合要求，离心试管必须成偶数对称放入。
（四）、若运行时有离心试管破裂，会引起较大振动应立即停机处理。
（五）、每次停机后再开机的时间间隔不得少于5分钟，以免压缩机堵转而损坏。
（六）、每次离心完成后，必须将转子取出，否则长时间放在轴上，可能锈死，转子会取不出而造成离心机整机报废。
（七）、电源必须有接地线。
（八）、过期应更换转子。
（九）、所有转子不能超过其最高转速使用。
三、冷冻设备
至少需要一台普通冰箱（4℃，-20℃），如有条件，还需要一台-80℃冰箱。
许多动物、植物、微生物的样本以及试剂的贮存需要在低温或者超低温下贮存。
制冰机也是很必要的，因为许多反应是在冰上进行的。
四、光学测量
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。
样品的吸光值与样品的浓度成正比。
它可以用于核酸的定量、蛋白质的直接定量（UV法）、比色法蛋白质定量、细菌细胞密度（OD600）。
紫外/可见分光光度计主要用来检测DNA/RNA的浓度和纯度，有条件的实验室用DNA/RNA计算器来代替分光光度计，使用起来更方便。
使用方法：
1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。
2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。
）
3.根据所需波长转动波长选择钮。
4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。
5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。
6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。
7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。
注意事项
1、如果比色皿有毛面和光滑面，记住一定要握毛面，千万不要握光滑面。
2、该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。
热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。
3、使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮之功能。
在未按通电源之前，应该对仪器的安全性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。
4、在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。
五、天平
分析天平和制备天平，天平的精度要达到千分之一或者万分之一。
分析天平使用方法：
1、调节零点
首先检查天平各部分是否正常，发现问题应及时报告指导教师。
然后慢慢开启天平升降钮，调节好零点。
如零点不准，可用升降旋钮后面的微动调节杆来调节。
2、开始称量
可以把要称量的物体放置在称量纸、称量瓶或者表面皿上面进行称量。
六、计算机和打印机
主要用来进行RAPD等实验的聚类分析及其他软件分析。
七、凝胶电泳装置
电泳技术是分子生物学研究不可缺少的重要分析手段。
电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类，自由界面电泳不需支持物，如等电聚焦电泳、等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电泳目前已很少使用。
而区带电泳则需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶-G薄层等，分子生物学领域中最常用的是凝胶电泳。
Tise-lesa式微量电泳
显微电泳
自由电泳（无支持体）等电聚焦电泳
等速电泳
密度梯度电泳
电泳滤纸电泳
区带电泳（有支持体）薄层电泳
凝胶电泳
依据制备凝胶的材料，凝胶电泳可分成两个亚类：
琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
聚丙烯酰胺分离小片段DNA/RNA（5—500bp）效果最好，其分辨力极高，相差1bp的DNA片段就能分开，其不足之处为制备和操作较为困难。
琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。
用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片段。
（一）琼脂糖凝胶
1．琼脂糖浓度
采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子。
2．EB染料的存在
溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。
含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围
凝胶中的琼脂糖含量[%（W/V）]
DNA/RNA分子的分离范围（kb）
0.3
5—60
0.6
1—20
0.7
0.8—10
0.9
0.5—7
1.2
0.4—6
1.5
0.2—3
2.0
0.1—2
3．电泳缓冲液的组成
有几种不同的缓冲液可用于电泳，分别为Tris—乙酸（TAE）、Tris—硼酸（TBE）或Tris—磷酸（TPE），其浓度约为50mmoL/L，PH为7.5—7.8,这些缓冲液均含有EDTA。
这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于室温。
常用的电泳缓冲液的配制
缓冲液
使用液
浓贮存液（每升）
Tris—乙酸（TAE）
1×：
0.04moL/LTris—乙酸
0.001moL/LEDTA
50×：
242gTris碱
57.7mL冰乙酸
100mL0.5moL/LEDTA（PH8.0）
Tris—磷酸（TPE）
1×：
0.09moL/LTris—磷酸
0.002moL/LEDTA
10×：
108gTris碱
15.5mL85%磷酸
40mL0.5moL/LEDTA（PH8.0）
Tris—硼酸（TBE）
0.5×0.045moL/LTris—硼酸
0.001moL/LEDTA
5×：
54gTris碱
27.5g硼酸
20mL0.5moL/LEDTA（PH8.0）
4．加样缓冲液：
缓冲液类型
6×缓冲液
贮存温度
I
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
40%（W/V）蔗糖水溶液
4℃
II
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
15%聚蔗糖水溶液
室温
III
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
30%甘油水溶液
4℃
IV
0.25%溴酚蓝
40%（W/V蔗糖水溶液）
4℃
V
（碱性加样缓冲液）
300mmoL/LNaoH
6mmoL/LEDTA
18%聚蔗糖水溶液
0．15%溴甲酚绿
0．25%二甲苯青FF
4℃
加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。
选用哪一种加样缓冲液纯属个人喜恶。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳
图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图（A为正面,B为剖面）
（1）样品胶pH6.7
（2）浓缩胶pH6.7（3）分离胶pH8.9（4）电极缓冲液pH8.3
图2夹心垂直板电泳槽示意图图3凝胶模示意图
1.样品槽模板2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框
4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统
分子生物实验室中至少有一套可满足不同分子量大小的水平电泳槽和电泳仪，对于从事大规模测序的研究人员需要配备一套测序凝胶装置。
还应有一套用于聚丙烯酰胺蛋白质凝胶的垂直电泳仪及电泳槽，根据需要，配备一套用于双向蛋白质凝胶的特制电泳仪。
琼脂糖凝胶电泳操作步骤：
1.制作胶模：
用胶带将洗净、干燥的水平板的边缘封住，并插入梳子，形成一个胶模并水平放置。
2.熔胶：
按水平板的长×宽×0.5cm胶厚，量取0.5×TBE，并按0.7％的浓度称取agarose琼脂糖，在微波炉或电炉上加热至全熔。
3.制备凝胶板等凝胶温度降至大约50－60℃以下时，加入1mg/L溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5ug/mL；摇匀并轻快地倒入水平板中，并除掉气泡。
4.凝固后，将梳子轻轻拔出。
去掉胶带，将水平板放入加有0.5×TBE电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。
5.点样——在核酸样品中加入适量上样Buffer，混匀后点样。
6.电泳——盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压（≤5V/cm）开始电泳。
7.当色素接近胶的先端，停止电泳，样品在紫外灯下观察、成像。
注意事项
1.EB是强诱变剂，操作时应带手套，并注意安全。
2.制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀；速度也不可太快，否则容易出现气泡。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
1.安装夹心式垂直板电泳槽
（1）装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。
（2）将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
（3）将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。
（4）将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
（5）竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂（糖）。
其目的是封住空隙，凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。
八．恒温箱（37℃）
用于培养细菌。
九．温控摇床
用于培养液的培养。
3.制备凝胶板
将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。
用1mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水（约3–4mm），用于隔绝空气，使胶面平整。
约30-60min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。
将上、下贮槽的蒸馏水倒去，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内（即分离胶上方），距短玻璃上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。
静置电泳槽，10min左右，上胶即可聚合，再放置10-20min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。
4.样品的处理及加样
将样品按0.5–1mg/mL加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子（不要塞紧，以免加热时迸出），在100℃沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。
用微量进样器取25l上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。
5.电泳
将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。
6.染色与脱色
电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。
加入染色液染色1-2h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。
7.结果处理
量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm），按下式计算相对迁移率mR:
相对迁移率mR=
注意事项
（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。
（2）用琼脂（糖）封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。
（3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。
（4）加样时样品不能超出凹形样品槽。
加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。
十一．磁力搅拌器（最好带加热功能）
主要用于试剂的配制，磁力搅拌器适用于加热或加热搅拌同时进行适用于粘稠度不是很大的液体或者固液混合物利用了磁场和漩涡的原理将液体放入容器中后将搅拌子同时放入液体当底座产生磁场后带动搅拌子成圆周循环运动从而达到搅拌液体的目的。
十一．微波炉
用于熔化琼脂和琼脂糖。
十二．PH计（酸度计）
试剂配制。
一、准备工作
1.仪器应平放在符合使用环境的工作台上，依视觉角度支起支架。
3.pH值的定位测量法：
（一）、二点定位法（高精度测量方法）
（1）连接好电极线路，将参比电极及活化满24h以上清洁的PH电极移入第一标准缓冲液pH1中（例pH1=4.00），待仪器响应稳定后，调节定位旋钮至仪器显示为“0.00”；
（2）将电级系统从第1种标准液中取出，用去离子水冲洗干净后以滤纸吸干电级表面水份，移入第2种标准液（例pH2=9.18）中，仪器响应稳定后，调节斜率旋钮，使仪器显示为（△pH=pH1-pH2=9.18-4.00=5.18）此后斜率旋钮不可再动，除非更换电极系统；
（3）斜率调节完成后，重新调节定位旋钮，使仪器显示第2种标准液的实际pH值（9.18），至此2点定位结束；
（4）将电极从第2种标准液中取出冲洗、吸干后移入待测溶液中，仪器响应稳定后显示的数值即为待测溶液的pH值。
（二）一点定位法（粗略测量法）
（1）将温度补偿旋钮调至溶液温度值；
（2）向左将斜率补偿旋钮旋转至头；
（3）将电级系统移入标准液中（一点法仅用一种标准液，如pH=4.00时），调节定位旋钮使仪器显示“4.00”；
（4）取出电级冲洗吸干水分后移至待测溶液中，仪器响应稳定后显示的数值即为待测溶液的pH值。
三、温度的测量
1.将功能选择拨至温度档。
2.将温度探头插入插孔，并将温度探头置于环境条件或溶液中，仪器响应稳定后仪器显示值即为环境条件或溶液温度值。
四、注意事项
1.认真做好仪器使用前准备工作。
2.仪器通电后或测量过程中出现显示不稳或乱跳现象，应切断电源进行检查，如电压、预热时间及电极系统等是否正常。
3.使用不同电极应注意排除离子的干扰
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