天然药物化学实验.docx

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天然药物化学实验

天然药物化学实验

2011年10月

天然药物化学实验室守则

为了确保天然药物化学实验室安全、正常地进行，培养学生良好的实验习惯和严谨的科学态度，学生必须遵守以下规则：

1、学生进入实验室后首先要了解实验室内的水、电、气开关位置和消防灭火器材的地点以及使用方法。

2、实验前必须认真预习实验内容，写好预习报告。

3、在实验过程中应保持实验台面清洁整齐，有条不紊，要认真操作，仔细观察，详细记录，不得擅自离开。

4、实验中的固体废物和废液（如废酸、废碱、废有机物溶剂等）不得乱丢乱倒，固体废物应放入废物箱中，废液要倒入指定的废液缸内，并按照有关规定处理废物废液，养成良好的环境保护意识。

5、严格按照实验中规定的药品规格、用量和步骤进行实验，若要更改，必须征得指导教师同意后才可实施。

公用药品不得任意移动，用后立即盖好，注意节约使用。

6、爱护实验仪器，严格按照操作规程使用仪器，自制仪器用后必须洗净，妥善收藏，公用仪器使用后放回原处，仪器若有损坏要及时办理登记手续，按照实验室的有关规定赔偿。

大型精密仪器使用后要填写仪器使用记录登记表。

7、尊重教师指导，实验结束后须经教师全面检查，当教师在实验本上签字后才能离开实验室。

8、值日学生在实验结束后，负责打扫实验室，复原公用仪器的位置，关闭水、电、气开关，由教师检查后方可离去。

实验1-1虎杖中蒽醌类成分的提取与分离实验

虎杖又名阴阳莲、土地榆、苦杖、为蓼科植物虎杖（PolygannumcuspidtumsiebetZuce）的根茎。

有活血化瘀、清热解毒、祛痰止咳等作用。

近年来用于治疗黄疸、低血脂、高血小板，并可治疗慢性支气管炎和烧伤等。

虎杖中含有大量的蒽醌类成分和二苯乙烯类成分，其主要已知成分和结构和理化性质如下：

1、大黄素（Emodin）橙黄色结晶，其mp.256-257℃，能L华，易溶于乙醇、氨水、碳酸钠和氢氧化钠水溶液，几乎不溶于水。

2、大黄酚（Chrysophanol）金黄色六角形片状结晶，mp.196-197℃，能L华，易溶于苯、氯仿、乙醚、乙酸、乙醇，难溶于石油醚，不溶于水、碳酸氢钠和碳酸钠可溶于氢氧化钠及热碳酸钠溶液。

3、大黄素甲醚（Phgsion）金黄色针状结晶，mp.207℃，能L华，可溶于苯、氯仿、吡啶、甲苯、微溶于乙酸、乙酸乙酯、乙醚，不溶于水，易溶于氢氧化钠溶液。

4、白黎芦醇（Resveratrol）无色针晶，mp.256-257℃，261-264℃，能L华，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮等，白黎芦醇苷称为虎杖苷，mp.255℃,323℃微溶于水，易溶于热水、甲醇、乙醇、丙酮等，可溶于乙酸乙酯，难溶于乙醚。

苷和苷元都可溶于碳酸钠和氢氧化钠水溶液。

5、其他虎杖中还含有少量大黄素-8-葡萄糖苷、甾醇等。

结构：

大黄素R=OH二苯乙烯衍生物

大黄酚R=H

大黄素甲醚R=OCH3

白黎芦醇R=H

白黎芦醇R=C3H11O5

一、目的要求

掌握蒽醌类及其苷的提取原理、分离过程、pH梯度萃取法在分离中药有效成中的应用。

了解蒽醌类物质提取的意义及渗漉装置用法。

二、实验原理

利用苷和苷元都微溶于乙醇的性质，用乙醇提取虎杖中苷及苷元总成分，再根据苷和苷元的溶解性能不同，用乙醚分出极性小的苷元游离蒽醌物质，最后用水分离出极性大的苷类成分。

进一步用pH梯度法使酸性强弱不同的蒽醌化合物得以分离出来。

三、仪器与试剂

渗漉装置1套铁架台1个瓷蒸发皿1套

木槌1个减压回收装置1套薄层板1张

层析缸1个抽滤装置1套烘箱1台

电子天平（0.01g）1台层吸柱（2×30cm）1根

pH试纸1本滤纸1张硅胶H（140目，活度Ⅳ-Ⅴ级）30ｇ

圆底烧瓶1000ml1个分液漏斗500ml、250ml各1个

烧杯500ml3个烧杯2000ml1个

虎杖300g甲醇50ml乙醇2000ml

乙醚400mlNaHCO320gNa2CO320g

盐酸50mlNaOH2苯50ml

氯仿50ml石油醚（60-90℃）60ml醋酸乙酯60ml

四、实验操作步骤

（一）渗漉法提取

1、渗漉装置在渗漉筒下口装一安有玻管的橡皮塞，玻管上套一根带有螺旋夹的乳胶管，渗漉筒内放一块包有两层纱布的隔板，将渗漉筒固定在铁架台上，旋紧乳胶管的螺旋夹。

2、装筒称取虎杖根茎粗粉约300g，加95%乙醇拌湿，拌匀后装筒，边装边用木槌压紧，整平，使筒内药材均匀一致，装筒后表面上盖一圆形滤纸，滤纸上面用几块干净的小石块压住，加300ml95%的乙醇于渗漉筒中，浸泡过夜，次日打开螺旋夹，收集渗漉液，将渗漉液装入圆底烧瓶中，减压回收乙醇至小体积（75ml），得乙醇总提取物。

（二）总游离蒽醌与亲水性成分的分离

将乙醇总提取物抽滤（沉淀部分留作重结晶），滤液置500ml分液漏斗中，加乙醚200ml振摇，静置，分层。

分出上层醚液，下层残留液用乙醚萃取，每次100ml萃取2次，合并三次乙醚萃取液。

（三）游离蒽醌的分离

1、强酸性成分的分离将乙醚萃取液置于500ml分液漏斗中，加入5%NaHCO3溶液50ml萃取3次，合并三次NaHCO3萃取液，于250ml烧杯中，滴加20%的HCl调pH1-2，放置沉淀、抽滤、水洗、干燥称重，得强酸性成分，乙醚液再以5%NaHCO3萃取2次，每次50ml。

弃去NaHCO3液。

2、大黄素的分离将NaHCO3提取过的乙醚液，用5%Na2CO3水溶液萃取，每次50ml，萃取3次，合并碱液于500ml烧杯中，滴加20%的HCl调pH1-2，放置沉淀、抽滤、水洗、干燥称重，得大黄素，用95%的乙醇重结晶。

3、大黄酚和大黄素甲醚混合物的提取将Na2CO3提取过的乙醚液，用2%的NaOH水溶液萃取，每次50ml，萃取2次，合并碱液，滴加20%的HCl调pH1-2，放置沉淀、抽滤、水洗、干燥称重，得大黄酚和大黄素甲醚混合物。

沉淀以甲醇-氯仿（1：

1）或苯-氯仿（1：

1）重结晶。

4、柱层析分离大黄酚和大黄素甲醚混合物

（1）层析条件

吸附剂硅胶H（140目，活度Ⅳ-Ⅴ级）

洗脱剂a、石油醚（60-90℃）-醋酸乙酯（15：

1）

b、石油醚-醋酸乙酯（12：

3）c、石油醚-醋酸乙酯（3：

12）

（2）装柱将玻璃层析柱尾端塞上少许棉花，轻轻将棉化填平，使层析柱端正地固定在铁架台上。

称取约30g硅胶H，置50ml小烧杯中，加入35ml石油醚-乙酸乙酯（5：

1）。

搅匀，不得有气泡存在，于柱内加入少许石油醚-乙酸乙酯（15：

1）混合溶剂，通过层析柱上小漏斗将硅胶H缓缓地不断地加入柱内，开启活塞，控制流速20-30滴/分，并且不断地用手轻轻地振动柱子，使硅胶H沉降均匀，柱顶面平整，表面盖一小圆滤纸。

当层析柱内液体表面刚好接触硅胶H时，立即关闭活塞。

（3）样品液制备及上样取大黄素甲醚与大黄酚混合物100mg，于水浴上加石油醚-乙酸乙酯（15：

1）溶解（溶剂体积以刚溶为度），放冷，备用。

（4）梯度洗脱及收集用吸管吸取洗脱剂a，绕管壁缓慢加入，开启活塞，控制流速20-30滴/分。

待柱上呈明显的二色带后，换用洗脱剂b进行洗脱，当橙黄色第一色带到达柱底时，收集此溶液，二组分经过适当的浓缩，分别作薄层层析检查。

五、复习思考题

1、为什么用5%Na2CO3水溶液萃取大黄素？

2、为什么用2%的NaOH水溶液萃取大黄酚和大黄素甲醚？

实验1-2蒽醌类化合物的鉴定实验

一、目的要求

掌握蒽醌类化合物的理化性质的差异、薄层色谱鉴定方法。

了解蒽醌类化合物鉴别意义及鉴别结果。

二、实验原理

羟基蒽醌类化合物遇碱后显红色或紫红色，该反应是检查中草药中羟基蒽醌成分的常用方法之一；而蒽酚、蒽酮、二蒽酮类化合物则需经过氧化后形成蒽醌物质后才能显色。

羟基蒽醌类成分也能与醋酸镁的甲醇溶液反应生成橙红色、紫红色或紫色络合物。

三、仪器与试剂

显微镜1台紫外荧光灯1台层析缸1个

薄层板1张烘箱1个电子天平（0.01g）1台

石棉网1张三角架1个毛细管5根

研钵1个试管10支载玻片、盖玻片1套

量筒5ml5支烧杯100ml2个酒精灯1个

虎杖提取液2mlNaOH1g过氧化氢溶液0.5ml

醋酸镁0.5g虎杖粉末1g硅胶G（TLC）2g

甲醇100ml丙酮50ml苯50ml

醋酸乙酯15ml乙醇10ml氨水10mlKOH5g

四、蒽醌类化合物的鉴定

（一）蒽醌类化合物的一般鉴别反应

1、Borntrager’s反应取1ml乙醇提取液，加数滴10%NaOH，然后加0.5ml过氧化氢溶液，加热后再加酸使成酸性，最后再碱化，观察反应过程中颜色变化。

2、醋酸美反应取乙醇提取液1ml，加0.5%醋酸镁甲醇液0.5ml，观察是否产生橙红色或兰紫色反应。

3、L华实验取虎杖粉末少许，置载玻片上，玻片两端各放小火柴棍一根，然后再取一洁净的载玻片，放在小木棍上，注意切勿接触下面粉末，再移置有三角架的石棉网上小心加热（不使药粉炭化），玻片上有L华物凝结为止。

冷却后取下盖片，使L华物面朝上，放在显微镜下观察，可见黄色针晶或羽毛状晶体，此晶体遇碱成红色。

（二）薄层鉴定

1、制板称取2g薄层层析用硅胶G于小乳钵中，加5ml蒸馏水研磨成糊状，待气泡逸尽后，均于地铺于洁净干燥的玻璃板上，晃动或振动玻板，使糊状物流布于整个板面上，使其表面光滑平整，然后将玻板放平，室温晾干后，于105℃加热活化30min，备用。

2、点样分别取少量总提取物和分得的各部位游离蒽醌于小试管中，用丙酮溶解。

用管口平整的毛细管吸样品，轻轻点在活化过的薄板上，点样的原点不得超过3mm，几个样品需点在距薄板边缘1cm左右的同一起始线上，有一定的间隔

3、展开剂苯-醋酸乙酯-乙醇（48：

12：

1）

4、显色

（1）日光下观察；

（2）浓氨水熏后观察；（3）喷5%KOH后于紫外灯下观察荧光，记录层析图谱。

五、复习思考题

1、试述Borntrager’s反应的反应机理。

2、计算薄层色谱图中各斑点的Rf值。

实验2-1槐花米中黄酮类化合物芦丁的提取与精制实验

一、目的要求

掌握从槐花米中提取芦丁的原理、提取、精制芦丁的实验操作步骤。

了解提取意义及提取过程中注意事项。

二、实验原理

芦丁为黄酮苷，利用黄酮苷能溶解在稀碱溶液中，而在酸中沉淀析出的性质，用酸碱法提取芦丁。

槲皮素R=H

芦丁R=芸香糖

三、仪器与试剂

电炉1500W1个抽滤装置1套烘箱1台

电子天平0.01g1台　

脱脂棉1包PH试纸1盒烧杯1000ml1个

烧杯500ml2个表面皿1个锥形瓶200ml1个

槐米20g石灰乳100ml盐酸10ml

氢氧化钠5g

四、实验操作步骤

（一）芦丁的提取

称取槐米约20g，研碎后投入盛有200ml沸水的1000ml烧杯中煮沸2-3min后，加入石灰乳调pH8-9，微沸30min（注意添加水，保持原体积并维持pH8-9）,趁热用棉花过滤，滤渣再加入100ml水，加石灰乳调pH8-9，煮沸30min，趁热过滤，合并两次滤液，在60℃左右加浓盐酸调pH4-5，放置后析出沉淀，抽滤，用蒸馏水洗涤沉淀（洗至沉淀为黄色），抽干，此沉淀即为芦丁粗品。

（二）芦丁的精制

把芦丁粗品加120ml蒸馏水，加热至沸，加50%NaOH溶液调至pH8-9使全溶，趁热抽滤，滤液加20%盐酸调至pH4-5,放置即可析出结晶，抽滤，得精制芦丁，置表面皿中，于80℃以下干燥称重并计算产量。

五、复习思考题

1、试述石灰乳的作用。

2、试述酸碱法提取芦丁的注意事项。

实验2-2黄酮类化合物的鉴定实验

一、目的要求

掌握纸色谱的方法及黄酮类化合物纸色谱的特点。

了解黄酮类化合物的鉴定方法。

二、实验原理

1、芦丁为苷类，遇酸被水解，生成槲皮素黄酮苷元及葡萄糖、鼠李糖。

2、纸色谱法系以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。

三、仪器与试剂

烘箱1台抽滤装置1套电子天平0.01g1台

圆筒型层析缸　　1个新华1号滤纸　　1张锥形瓶200ml1个电吹风1000W1个试管2支

芦丁2g苯胺0.93g正丁醇200ml醋酸　4ml硫酸100ml乙醇30ml

α-萘酚0.1g　　氢氧化钠　20g碳酸钡50g　

镁粉2g硫酸铜1.93g　　酒石酸钾钠34.6g

三氯化铝　　　1g三氯化铁1g苯胺邻苯二甲酸　1.66g

四、实验操作步骤

（一）芦丁的水解与苷元的分离

称取制备的芦丁约1g，置于烧杯中，加1%硫酸100ml，煮沸30min（注意观察有何现象，为什么？

）冷后抽滤，滤液保存在锥形瓶中作糖的纸色谱，沉淀物为芦丁的水解产物槲皮素黄酮苷元的粗品，再用60%乙醇（30ml）作重结晶。

（二）糖的鉴定（纸色谱鉴定）

1、载体取新华1号滤纸，剪成长15cm，宽度按要求决定剪好载体。

必要时也可将色谱滤纸卷成筒形。

2、供试品溶液的制备取滤去槲皮素后的水解母液20ml，加碳酸钡细粉中和，中和时不断搅拌，至溶液呈中性，滤去白色碳酸钡沉淀，滤液浓缩至2-3ml，作为供试品溶液。

3、点样取上述溶液10ul，分次点于距滤纸底边约2.5cm处，每次点样后，让其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干，样点直径约为2-4mm，点间距离为1.5-2.0cm，样点通常应为圆形。

4、展开将点样后的色谱滤纸放入盛有展开剂〔正丁醇-醋酸-水（4：

1：

5）〕的展开缸内，放至展开剂蒸气饱和后，再下降悬钓，使色谱滤纸进入展开剂约0.5cm，展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上L，除另有规定外，一般展开约15cm后，取出凉干。

5、显色用苯胺邻苯二甲酸试剂喷后，放入105℃烘箱中烘10min，显棕色和棕红色斑点。

（三）黄酮苷的一般鉴别方法

1、Molish反应取少芦丁于试管中，加0.5ml乙醇溶液，再加入0.1%α-萘酚溶液数滴；然后沿管壁加入浓硫酸约0.5ml，观察两液面处有何变化。

2、Fehling’s反应取芦丁少许溶于试管中，加入斐林试剂约1ml,沸水浴上加热后，观察有何现象？

如无砖红色沉淀产生则加入HCl，使成酸性，水浴加热30min，观察有无沉淀产生，如有，过滤除去，滤液加入NaOH调至弱碱性，再加斐林试剂检查。

3、盐酸镁粉反应取样品少许，加稀乙醇热溶，加镁粉少许，滴加浓HCl数滴，必要时水浴加热，观察溶液颜色的变化。

4、三氯化铁反应取样品少许，溶于水或乙醇中，加1%的FeCl3乙醇溶液１滴，观察颜色变化。

5、三氯化铝反应取芦丁乙醇溶液滴于滤纸上，紫外灯下观察荧光；然后喷1％三氯化铝乙醇溶液，再在紫外灯下观察颜色变化。

五、复习思考题

1、试述Molish反应的反应机理。

2、试述纸层析的操作要点。

3、计算葡萄糖的Rf值。