原花青素对大鼠实验性血栓形成的影响.docx

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原花青素对大鼠实验性血栓形成的影响

原花青素对大鼠实验性血栓形成的影响

作者：

名实医药研发中心

【摘要】本研究旨在探讨原花青素（PC）的抗血栓作用及其机制。

麻醉动物，然后给颈动脉局部施以20%三氯化铁溶液20分钟，以造成大鼠颈动脉血栓模型。

实验分6组：

假血栓（对照）组、血栓模型组、阿斯匹林［10mg/（kg·d）］组、PC100mg/（kg·d）组、PC200mg/（kg·d）组及PC400mg/（kg·d）组。

假血栓（对照）组和血栓模型组用生理盐水灌胃，其它各组分别用阿司匹林和PC低、中、高3个不同剂量悬液灌胃，每日2次，连续4周。

观察各组药物对实验性血栓形成的大鼠血浆中的血栓烷（TXB2）和6酮前列腺素F1α（6KetoPGF1α）及血小板P选择蛋白（GMP140））含量的影响。

结果发现：

①与假血栓对照组比较，血栓模型组血浆TXB2和血小板P选择蛋白（GMP140）含量明显升高，血浆6KetoPGF1α含量明显降低，差异非常显著（P＜0.01）；②与血栓模型组比较，3个PC组和阿司匹林组大鼠血浆TXB2和血小板P选择蛋白（GMP140）含量明显降低，差异非常显著（P＜0.01），血浆6KetoPGF1α含量明显升高（P＜0.01）；③与阿司匹林组比较，3个PC组血浆TXB2和血小板P选择蛋白（GMP140）含量均不同程度降低，而血浆6KetoPGF1α含量升高，其中尤以PC400mg/（kg·d）组最为显著（P＜0.01）。

结论：

PC具有明显的抗血栓形成作用，其抗血栓形成的机制与抑制血小板活化、聚集及保护血管内皮细胞密切相关。

PC抗血栓形成作用有明显的剂量依赖性。

PC400mg/（kg·d）组的抗血栓作用优于阿司匹林［10mg/（kg·d）］组。

【关键词】原花青素　血栓形成　血小板活化　血栓烷　6酮前列腺素F1α　血小板P选择蛋白

　　EffectsofProcyanidinOligomersonExperimentalThrombosisinRats

AbstractThestudywasaimedtoinvestigatethepotentialeffectofprocyanidins（PC）asаantithromboticagentanditsmechanism.48maleSDratswererandomizedinto6groups,whichinclude8ratseach.GroupAwasnormalcontrol,groupBwasmodelcontrol（notreatment）,groupCwasgrouptreatedwithaspirin［10mg/（kg·d）］,groupsD,EandFweretreatedwithlow,medialandhighdose［100,200and400mg/（kg·d）］ofPCrespectively.InaccordancewithKurz′sprotocols,rat′smodelofthrombosisofcommoncarotidarterywascontructedwithFeCl3,butforgoupA0.9%ofnormalsalinewasusedfor20minutes.ThethromboxaneB2（TXB2）,6KetoPGF1αandGMP140contentsinplasmaweremeasured.Theresultsshowedthatcomparedwiththenormalcontrolgroup,thecontentsofTXB2andGMP140inplasmamarkedlyincreasedinallofPCgroupsandaspiringroup,andthecontentsof6KetoPGF1αinplasmadecreased.Comparedwiththemodelgroup,thecontentsofTXB2andGMP140inplasmamarkedlydecreasedinallofPCgroupsandaspiringroup,andthecontentsof6KetoPGF1αinplasmaincreased.Comparedwiththeaspiringroup,thecontentsofTXB2andGMP140inplasmareducedinallofPCgroupsandthecontentsof6KetoPGF1αinplasmaincreasedwhichwasobviousinPC400mg/（kg·d）group.ItisconcludedthatPCshowsobviousantithrombosiseffect,itsmechanismcloselycorrelateswithinhibitionofplateletactivationandaggregationaswellasprotectingvasoendothelialcells.AntithrombosisofPCshowssignificantdosedependence.TheeffectofthePC400mg/（kg·d）surpasstheaspirin,butthereisnosignificantdifferencebetweenthePC200mg/（kg·d）andaspirin.Thisstudyprovidesexperimentalbasisforclinicalpreventionandtreatmentofthrombosis.

Keywordsprocyanidins；thrombosis；plateletactivation；TXB2；6ketoPGF1α；GMP140

原花青素（procyanidins，PC）是植物界中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类，随着分离鉴定技术的提高和研究的深入，现已成为一大类物质［1-4］，其化学结构式如下［3］：

法国教授JacquesMasquelier于1951年首次发现了PC的抗氧化性能。

自上世纪60年代开始，欧洲的医生就知道用葡萄籽的提取物治疗枯草热和过敏症，并获得满意的效果；上世纪80年代初，法国医生用它治疗毛细血管脆化，慢性外周性静脉机能不全和视网膜微血管病等微循环疾病。

PC作为一种天然强力抗氧化剂，安全无毒副作用。

近年来，对原花青素的研究热点主要集中在抗氧化、抗心肌缺血再灌注损伤、抗高血压及调节血脂等方面［5-9］，而PC抑制血栓形成的研究比较少见［10,11］，其作用机制尚需进一步阐明和验证。

中国实验血液学杂志JExpHematol2007;15（3）原花青素对大鼠实验性血栓形成的影响材料和方法

材料

原花青素粉剂（批号20040719）天津尖峰集团提供。

阿司匹林粉剂（批号20040225）山东新华制药股份有限公司提供。

血浆血栓烷（TXB2）放射免疫分析药盒（批号20050101）和血浆6酮前列腺素（6KetoPG）放射免疫分析药盒（批号20050101）均购置于北京市福瑞生物工程公司。

人血浆血小板P选择蛋白（GMP140）酶标试剂盒（批号20041210）购置于苏州大学血液研究所。

这3种试剂盒均为人鼠通用。

实验分组和给药

48只健康SpragueDawley（SD）大鼠，雌雄各半，体重240-300g，由同济医学院实验动物中心提供。

SD大鼠随机分为6组，假血栓（对照）组、血栓模型组、阿司匹林组、原花青素100mg/（kg·d）组、原花青素200mg/（kg·d）组和原花青素400mg/（kg·d）组，每组8只。

原花青素和阿司匹林粉末准确称量后用蒸馏水新鲜配制为悬浊液，按照表1分组与给药。

大鼠急性颈总动脉血栓模型的制备

依照Kurz［13］提供的方法诱导产生急性颈总动脉血栓模型。

大鼠按照动物体重，以10%乌拉坦（1ｇ/㎏）腹腔注射进行全身麻醉。

将麻醉后的动物仰位固定，切开颈部皮肤，分离皮下结缔组织，暴露一侧颈总动脉。

将吸有20%三氯化铁溶液10μl的1cm×1cm的滤纸小片包裹在此段颈总动脉上，计时20分钟取下。

假血栓组（正常对照）除不滴加三氯化铁溶液，而应用生理盐水代替外，其余手术步骤同模型组。

大鼠血浆指标检测

末次给药后半小时，在麻醉下，暴露另一侧颈总动脉，用注射器抽取大鼠血液约6ml，严格按照试剂盒说明书操作并检测各项指标，包括：

TXB2、6KetoPGF1α、血小板P选择蛋白（GMP140）。

统计学分析

在WindowsXP操作环境下，用SPSS11.0统计软件进行分析与检验。

各组实验值以均数±标准差（±SD）表示，数据应用t检验。

其他组间比较采用单因素方差分析（F检验）及LSDt检验。

P＜0.05被认为有显著性差异，P＜0.01被认为有非常显著性差异。

结果

大鼠血浆血栓烷B2（TXB2）和血浆6KetoPGF1α含量的测定

血浆血栓烷和血浆6KetoPGF1α含量测定结：

与假血栓（正常对照）组相比较，血栓模型组血浆中TXB2含量明显升高，有非常显著差异（P＜0.01）；与模型组比较，PC200mg/（kg·d）、PC400mg/（kg·d）组及阿司匹林组［10mg/（kg·d）］血浆中TXB2含量明显降低，有非常显著差异（P＜0.01）；与阿司匹林组［10mg/（kg·d）］比较，PC400组血浆中TXB2含量未见显著差异（P＞0.05）。

正常大鼠颈总动脉血浆6KetoPGF1α含量保持较低水平。

与假血栓组比较，血栓模型组血浆6KetoPGF1α含量明显下降，具有非常显著差异（P＜0.01）；与血栓模型组相比，PC200mg/（kg·d）组和PC400mg/（kg·d）组血浆6KetoPGF1α含量明显升高，差异具有显著性（P＜0.01）。

与阿司匹林组［10mg/（kg·d）］相比，PC200mg/（kg·d）组和PC400mg/（kg·d）组血浆6KetoPGF1α含量明显升高，差异具有显著性（P＜0.01），并呈剂量依赖性。

大鼠颈总动脉血浆血小板P选择蛋白（GMP140）含量的测定

血浆血小板P正常大鼠颈总动脉血浆血小板P选择蛋白含量保持极低水平。

与假血栓组比较，血栓模型组结果显示血浆血小板P选择蛋白含量显著上升（P＜0.01），说明血栓造成可溶性血小板P选择蛋白大量释放。

经PC处理后，3组大鼠的血浆血小板P选择蛋白含量与血栓模型组相比显著下降（P＜0.01），并且呈剂量依赖性，随着处理剂量的增加，血小板P选择蛋白含量下降得越来越明显。

阿司匹林处理之后，大鼠血浆血小板P选择蛋白含量与血栓模型组相比显著下降（P＜0.01），下降幅度介于PC100mg/（kg·d）、PC200mg/（kg·d）组之间，说明在此项指标中，阿司匹林（10mg/（kg·d））组的效果不如PC400mg/（kg·d）组的效果好。

讨论

在生理状态下，血液中的凝血系统和抗凝血系统（纤维蛋白溶解系统）处于动态平衡。

在某些能促凝血因素作用下，上述动态平衡被打破，触发了凝血过程，血液便可在心血管腔内凝固，形成血栓［14］。

血小板的生理功能主要是参与止血与血栓形成。

在动脉血栓形成中，血小板的作用是最重要的［15］。

在正常生理状态下，血浆或组织中的TXA2和PGI2处于相对平衡，保持机体内环境的稳定。

因TXA2和PGI2的生物半衰期极短，目前难以直接测定，但可通过测定其稳定的代谢产物TXB2和6KetoPGF1α来反映其含量。

本实验中，原花青素处理之后，血浆TXB2含量与血栓模型组相比明显降低，并且呈剂量依赖性，随着处理剂量的增加，TXB2含量下降得越明显。

这说明原花青素能够抗血小板聚集。

原花青素处理组血浆6KetoPGF1α含量与血栓模型组相比明显升高，差异具有显著性（P＜0.01），并且呈剂量依赖性，随着处理剂量的增加，6KetoPGF1α含量增加得越明显。

而阿司匹林不能使实验大鼠血浆6KetoPGF1α含量增加。

血小板P选择蛋白（GMP140）是近年来发现的血小板活化的特异分子标志，其特异性及敏感性较其它标志蛋白为佳。

正常情况下，血小板内含有的颗粒主要有3类：

α颗粒、致密体和溶酶体。

随颗粒内容物的释放，颗粒膜蛋白要整合到活化的血小板质膜内，成为血小板活化的标志，并参与止血、炎症、免疫等反应。

血小板P选择蛋白（GMP140）为α颗粒膜蛋白（GMP）的一种，当血小板受刺激活化时随α颗粒内容物的释放并与质膜融合，能持久存在于活化血小板质膜表面，为血小板活化释放的特异标志之一。

正常情况下，由于机体内环境相对稳定，体内血浆血小板P选择蛋白（GMP140）水平极低。

只有当血小板活化后，一方面其伪足形成和断裂后释放凝血因子进入血浆；另一方面其变形能力下降又加速了血小板的活化和破裂，因此血小板P选择蛋白（GMP140）水平的变化实质上直接反映了血小板的活化程度。

从我们的实验可以看到，PC处理之后，PC3个组的血浆血小板P选择蛋白（GMP140）含量与血栓模型组相比呈现下降趋势，并且呈剂量依赖性，表明PC的抗血小板凝集的效果显著，PC400mg/（kg·d）组能将大鼠血浆血小板P选择蛋白（GMP140）含量控制到假血栓（正常对照）组的水平。

阿司匹林是目前世界上应用最多的抗血小板聚集药物，它可抑制血小板聚集的第二阶段［15］，其抗血小板作用明确。

本研究结果表明，PC400mg/（kg·d）组抗血栓作用优于阿司匹林组。

原花青素可在胃肠道迅速吸收，45分钟即达峰值，半衰期5小时，14%的药物在11小时内经胆汁排泄。

其代谢存在于重要的肠肝循环。

原花青素在血液、肝、肾中为非特异性结合；在皮肤、血管壁、胃肠粘膜中为特异性结合。

据推测这与原花青素的血管保护作用有关。

大鼠口服单次量50mg/kg，70%的药物24小时后被排泄，其中6%以二氧化碳形式呼出，19%经尿排泄，45%经粪便排泄［16］。

有实验表明，大鼠和小鼠口服原花青素的LD50均在4000mg/kg以上，大鼠口服60mg/（kg·d），6个月，狗口服相同剂量12个月均无任何副作用且耐受良好，无致畸、致突变作用；在生殖方面，服用原花青素的雌性动物在生育前后均十分安全［17］。

台湾学者［7］应用PC对大鼠和人血小板凝聚作用进行的研究结果，提示PC抑制血小板凝聚的机理是抑制凝血氧烷的生物合成，这与本实验结果吻合。

本研究发现，原花青素在大鼠体内不仅具有明确的抗血小板聚集作用，明显降低血浆TXB2和血小板P选择蛋白（GMP140）水平，还具有促进血管内皮细胞合成与释放PGI2的作用，且成剂量依赖关系。

综上所述，原花青素的抗血栓作用明确，与阿司匹林相比具有一定的优势。

文献资料表明，PC还具有清除氧自由基，抗氧化、抗心肌缺血再灌注损伤［18-21］、抗高血压及调节血脂［22-26］等多种药理作用，因此其抗血小板聚集的机制可能还与上述药理作用密切相关。

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