实验酵母醇脱氢酶的提纯和性质的研究.docx
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实验酵母醇脱氢酶的提纯和性质的研究
实验三酵母醇脱氢酶的提纯及其性质的研究
醇脱氢酶（ADH）是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，在生物催化、生物医学领域都有较为广泛的应用。
生物体内的很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。
醇脱氢酶来源广泛，种类繁多，可按肽链长度分为短链、中链、长链醇脱氢酶，所含肽链氨基酸残基数分别为250、375和600~750，酵母醇脱氢酶（YADH）是其中研究和应用最为广泛的一种。
酵母醇脱氢酶以NAD+/NADH为辅酶，可逆催化醇和醛/酮之间的氧化还原反应。
酵母醇脱氢酶为四聚体，单个亚基肽链含347个氨基酸残基，亚基相对分子质量为35000。
（一）酵母醇脱氢酶的提纯
一、实验目的
1.学习和掌握醇脱氢酶提纯的原理和方法；
2.掌握醇脱氢酶活力的测定方法。
二、实验原理
以酵母为原料，利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白质等方法，提取具有一定纯度的酵母醇脱氢酶。
在提纯过程中，每经一步提纯处理，都需测定酶蛋白质含量和活力，并计算得比活力（本实验中比活力=活力单位数/mg蛋白质）。
唯有比活力提高了，才证明所用提纯措施有效，酶制剂的纯度提高了。
醇脱氢酶的辅酶NAD（以NAD为辅酶的醇脱氢酶，它只作用于一级醇、二级醇和半缩醛脱氢酶，动物醇脱氢酶还能催化环一级醇脱氢，酵母醇脱氢酶无此活力。
另有以NADP为辅酶的醇脱
氢酶，它只作用于一级醇。
），它能催化乙醇脱氢变成乙醛，脱下的氢则使NAD+还原。
CH3CH2OH+NAD+→CH3CHO+NADH+H+
当有过量的醇存在时，NAD+被还原的速度与酶活力成正比，酶活力愈高，单位时间产生的NADH愈多。
NADH对340nm紫外线有较强吸收，NAD+无此能力，因此可用测定A340nm的方法测得反应体系中NADH含量，从而得知酶活力的大小。
0
本实验用Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
三、实验材料、仪器和试剂
1．实验仪器：
（1）干酵母粉：
将鲜酵母分散成小块，放在搪瓷盘吹干。
干燥后，研磨成粉末。
（2）烧杯
（3）吸管0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml
（4）容量瓶
（5）试管
（6）量筒
（7）水浴锅
（8）台天平
（9）电子天平
（10）离心机（5000r/min）
（11）722型分光光度计
（12）UV-900型紫外可见分光光度计
2．实验试剂：
（1）3mol/L乙醇溶液：
量取无水乙醇（比重：
0.789，相对分子质量：
46.07）174.6ml，加蒸馏水稀释至1000ml。
（2）0.06mol/L焦磷酸钠溶液（pH8.5）：
称取焦磷酸钠（Na4P2O2·10H2O）22.56g，溶于蒸馏水，稀释至1000ml。
（3）0.0015mol/LNAD溶液：
称取NAD0.0995g（NAD相对分子质量：
663.44）溶于蒸馏水，稀释至1000ml。
（4）0.01mol/L磷酸氢二钾溶液：
溶1.74gK2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml。
（5）丙酮（A.R.）
（6）0.066mol/L磷酸氢二钠溶液：
溶9.37gNa2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml。
四、实验操作步骤
1．酵母醇脱氢酶的提纯
（1）粗提
置20g干酵母于250ml烧杯中，加0.066mol/LNa2HPO4溶液80ml，37℃水浴锅保温2h，不断搅拌、再于室温提取3h，离心20min（4000r/min）取上清液3ml，测定蛋白质含量及酶活力，其余上清液量得体积后，倾于150ml烧杯中。
（2）热变性沉淀杂蛋白
将上清液55℃保温15~20min，不断慢速搅拌。
保温毕，立即置冷水中冷却，离心20min（4℃，4000r/min）。
吸取上清液3ml，测蛋白质含量及酶活力。
其余上清液量得体积后，倾于烧杯中。
（3）有机溶剂沉淀杂蛋白
将上清液置盐冰浴中降温至-2℃以下，按100ml上清液加50ml丙酮的比例加入预先冷至-2℃以下的丙酮，边加边搅。
加毕，放置片刻，低温离心20min（0℃，4000r/min）。
吸取上清液3ml，测蛋白质含量及酶活力。
其余上清液量得体积后，倾入已置于盐冰浴的烧杯中。
（4）有机溶剂沉淀酶蛋白
按100ml上清液加55ml丙酮的比例，逐滴加入冰冷的丙酮，使溶液保持-2℃以下。
待沉淀完全后，低温离心15min（0℃，4000r/min）。
弃去上清液，沉淀溶于少量蒸馏水，转移至透析袋内，对冷水透析3h（在冰箱中进行）。
离心除去沉淀，上清液即为达到一定纯度的醇脱氢酶制剂。
2.蛋白质浓度的测定
吸取1、2、3步骤所取的样液及最后制得的酶制剂0.5ml，用蒸馏水稀释100~200倍。
按考马斯亮蓝法或紫外吸收法测定蛋白质含量。
3.酶活力测定
样液及酶制剂均需用0.01mol/LK2HPO4溶液稀释，稀释倍数如下：
V1（粗提取液）：
V（Na2HPO4）=1：
4（或1：
9）
V2（热变性去杂蛋白样液）：
V（Na2HPO4）=1：
9（或1：
19）
V3（有机溶剂去杂蛋白样液）：
V（Na2HPO4）=1：
9（或1：
19）
V（酶制剂）：
V（Na2HPO4）=1：
9（或1：
19）
吸取0.06mol/L焦磷酸钠溶液0.5ml、3mol/L乙醇溶液0.1ml、0.0015mol/LNAD溶液0.1ml、蒸馏水2.2ml置于石英比色杯中（容量4ml），加入已稀释的样液或酶制剂0.1ml，立即混匀，测定A340nm，以后每隔15s测1次，直至A340nm不变，记下反应时间和A340nm读数。
于另一石英杯中，以蒸馏水代替底物，作空白试验。
每分钟A340nm增加0.001为1活力单位。
表17测酶活力加样表（ml）
比色杯
焦磷酸钠
乙醇
NAD
蒸馏水
稀释后酶液
空白杯
0.5
0
0.1
2.3
0.1
测试杯
0.5
0.1
0.1
2.2
0.1
表18实验结果记录分析表
提取步骤
总体积
/ml
A
蛋白质浓度
/（mg/ml）
B
蛋白质
总量/mg
C
酶活力
/U
D
总活力
/U
E
比活力
/（U·mg-1）
F
回收率（%）
蛋白质
G
酶活力
H
1．粗提
100
2．热变性去除杂蛋白
3．有机溶剂去除杂蛋白
4．有机溶剂沉淀杂蛋白
注：
C=A×B，E=A×D，F=D/B
回收率=（每次总活力/第一次总活力）×100%纯化倍数=每次比活力/第一次比活力
4.结果
将测得数据或计算结果填入上表。
提纯酶时，常用此表，它反映了所采用的每一提纯步骤的效果。
（二）酵母醇脱氢酶的专一性
一、实验目的
了解酵母醇脱氢酶的专一性
二、实验原理
用不同的醇（乙醇、正丙醇、甲醇）作底物，观察醇脱氢酶的专一性。
RCH2OH+NAD+→RCHO+NADH+H+
根据NADH对340nm波长紫外线有最大吸收的特性，可用A340表示酶活力。
每毫克酶蛋白有多少酶活力单位称为比活力。
醇脱氢酶对于各种不同的醇应有不同的比活力。
三、实验材料、仪器和试剂
1．实验仪器：
（1）吸管0.1ml、0.5ml、1ml
（2）试管
（3）722型分光光度计
（4）UV-900型紫外可见分光光度计
2．实验试剂：
（1）3mol/L甲醇溶液：
120ml无水甲醇（比重：
0.786，相对分子质量：
32）加蒸馏水稀释至1000ml
（2）3mol/L乙醇溶液：
174.6ml无水乙醇（比重：
0.789，相对分子质量：
46.07）加蒸馏水稀释至1000ml
（3）3mol/L正丙醇溶液：
225ml正丙醇（比重：
0.804，相对分子质量：
60.0）加蒸馏水稀释至1000ml
（4）0.01mol/L磷酸氢二钾溶液：
溶解1.74gK2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml
（5）0.06mol/L焦磷酸钠溶液（pH8.5）：
称取焦磷酸钠（Na4P2O2·10H2O）22.56g，溶于蒸馏水，稀释至1000ml
（6）0.0015mol/LNAD溶液：
称取NAD0.0995g（NAD相对分子质量：
663.44）溶于蒸馏水并稀释至1000ml
（7）酵母醇脱氢酶液：
将酵母醇脱氢酶的提纯实验制得的酶制剂，用0.01mol/L磷酸氢二钾溶液稀释至每毫升含200~1000活力单位。
（8）Folin-酚试剂
四、实验操作步骤
1.将4只石英比色杯（光径1cm）编以0、1、2、3号，按下表加入试剂。
先向0号比色杯加入0.1ml稀释酶液，混匀，放入分光光度计，用以调零。
再向1号比色杯，加入0.1ml酶液（开始计时），迅速混匀测A340nm，以后每隔15s测一次A340nm，直至A340nm值不再上升。
0
1
2
3
0.06mol/LNa4P2O2溶液（pH8.5）
0.5
0.5
0.5
0.5
0.0015mol/LNAD溶液
0.1
0.1
0.1
0.1
3mol/L甲醇溶液
—
0.1
—
—
3mol/L乙醇溶液
—
—
0.1
—
3mol/L正丙醇溶液
—
—
—
0.1
H2O
2.3
2.2
2.2
2.2
表19酵母醇脱氢酶的专一性测定加样表
按同法再测2、3号比色杯内的溶液。
以A340nm为纵坐标，时间（s）为横坐标作图。
取初速度（曲线上升部分）求得酶活力。
本实验以A340nm每改变0.001单位定义为一个活力单位，以酶活力单位/分表示酶活力。
2．取酶液0.1ml，加蒸馏水4.9ml，摇匀。
按（三）紫外吸收法测定蛋白质含量。
（以蒸馏水代替酶液作空白试验，以此调零）。
对照标准曲线，求得蛋白质浓度。
计算得酵母醇脱氢酶对三种醇的比活力（比活力=活力单位数/mg蛋白质）。
以比活力为纵坐标，醇的碳链长度为横坐标作图，按图说明酶的专一性。
（三）紫外吸收法测定蛋白质含量
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。
特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。
故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。
核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。
但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。
此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。
下面介绍四种紫外吸收法：
1.280nm的光吸收法：
因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。
蛋白质浓度可控制在0.1～1.0mg/ml左右。
通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。
由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。
下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。
文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。
蛋白质浓度=（A28010）/A1％1cm,280nm（mg/ml）
（因为1%浓度10mg/ml）
例：
牛血清清蛋白：
A1％1cm=6.3（280nm）
溶菌酶：
A1％1cm=22.8（280nm）
若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。
标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。
常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。
标准曲线的测定：
取6支试管，按表24编号并加入试剂：
表24标准曲线的测定加样表
管号
1
2
3
4
5
6
BSA（1.0mg/ml）
0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
H2O
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0
A280
用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵坐标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横坐标作图，绘制标准曲线。
标准曲线应为直线。
表25样液蛋白质浓度测定加样表
管号
1
2
3
4
5
6
样液
0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
H2O
5.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
A280
利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质浓度（或含量），也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm。
（四）酵母醇脱氢酶的凝胶层析
一、目的
学习用凝胶层析技术纯化酶，并为动力学实验提供一定量的酵母醇脱氢酶。
二、原理
本实验用SephadexG-100纯化酵母醇脱氢酶。
三、实验器材
1.层析柱1cm*90cm。
2.恒流泵。
3.紫外检测仪。
4.部分收集器。
5.记录仪。
6.试管等普通玻璃器皿。
四、实验试剂
1.酶样品：
实验102.1经有机溶剂沉淀后的上清酶液。
2.葡聚糖凝胶SephadexG-100。
3.洗脱液：
0.05mol/LTris-HCl缓冲液。
4.冷冻干燥机。
五、操作
1.凝胶的处理
SephadexG-100干粉经过蒸馏水室温充分溶胀24h，用倾泌法将悬浮在上层的较细颗粒出去，抽干，用10倍体积的洗脱液处理约1h，搅拌后继续用倾泌法出去悬浮的较细颗粒，备用。
2.装柱
将层析柱垂直装好，关闭出口，加入洗脱液约1cm高。
将处理好的凝胶用等体积洗脱液搅成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝胶沉积约1cm高时，再打开出口，继续加入凝胶浆，至凝胶沉积至一定高度（约80cm）即可。
3.平衡
将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，用2-3倍床体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml/min。
4.加样与洗脱
将柱中多余的液放出，将液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开低端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭关闭出口，用少量洗脱液洗柱内壁两次，加洗脱液至液层4cm左右，按上恒流泵，调节流速（0.5ml/min）,开始洗脱。
5．收集与测定
用部分收集器收集洗脱液，每管4ml。
紫外检测仪280nm处检测，用记录仪或将检测信号输入色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。
本实验在用280nm检测的同时需测定酶的活力大小，收集280峰和活力峰重叠的区域。
将收集液反复冷冻干燥，得纯的酵母醇脱氢酶，测定酶的比活力。
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