重组腺病毒AdGFPC197 的构建及其抗肿瘤活性研究7解析.docx
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重组腺病毒AdGFPC197的构建及其抗肿瘤活性研究7解析
第19卷第3期生命科学研究Vol.19No.3
端粒是在染色体末端维持染色体稳定的帽状结构,含有特征性的TTAGGG重复片段。
细胞每一次分裂均会使TTAGGG片段的丢失,最终导致
DNA缺损,引起细胞死亡。
端粒酶是一种核糖核蛋白,能特异性地在染色体DNA末端加上TTAGGG片段,防止端粒缩短。
绝大多数人体细胞中检测不到端粒酶的活性[1]。
与此相反,在85%的肿瘤细胞中检测到了端粒酶活性[2]。
端粒酶对肿瘤的发生发展起到重要的促进作用[3]。
人端粒酶主要组成部分包括RNA（humantolemeraseRNA,hTR和逆转录酶（humantelom-erasereversetranscriptase,hTERT。
hTR作为模
重组腺病毒Ad-GFP-C197的构建
及其抗肿瘤活性研究
邬贤,陈嘉盛,曹莹,丘玉昌,庞建新*
（南方医科大学药学院新药评价中心中国广东广州510515
摘要:
端粒酶是维持端粒长度的重要组成部分,是肿瘤发生的标志物之一。
构建了能表达人端粒酶逆转录酶（hTERTC端936-1132氨基酸片段（C197的重组腺病毒Ad-GFP-C197,并观察其对Hela细胞增殖的影响。
结果显示,Ad-GFP-C197感染Hela细胞后,采用免疫印迹法检测到C197在细胞内得到高效表达。
此外,Ad-GFP-C197明显抑制Hela细胞的增殖,诱导细胞凋亡,并且降低Hela细胞中端粒酶活性。
上述研究为进一步研究hTERTC末端功能打下基础,并为肿瘤的生物治疗提供新的思路。
关键词:
重组腺病毒;Hela细胞;人端粒酶逆转录酶;C197;细胞凋亡;端粒酶活性
中图分类号:
R966文献标识码:
A文章编号:
1007-7847（201503-0237-05ConstructionofRecombinantAdenovirusAd-GFP-C197anditsAntitumorActivity
WUXian,CHENJia-sheng,CAOYing,QIUYu-chang,PANGJian-xin*（CenterofDrugEvaluationandResearch,SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,Guangdong,China
Abstract:
Telomeraseplaysacriticalroleinmaintainingtelomerelength,anditisoneofthemarkersofthetumors.Arecombinantadenovirusvector,Ad-GFP-C197,wasconstructedtoexpressintactC-terminusofhumantelomerasereversetranscriptase（aminoacid936-1132,C197,anditseffectonthegrowthofHelacellswasevaluated.WesternblotassayshowedC197wereexpressedinHelacellsafterinfectionwithAd-GFP-C197.Furthermore,Ad-GFP-C197significantlyinhibitedtheproliferationandpromotedapoptosisofHelacells,aswellassuppressedtelomeraseactivityinHelacells.TheresultshighlightthepotentialofC-197intumortherapy.
Keywords:
adenovirus;Helacell;humantelomerasereversetranscriptase;C197;apoptosis;telomeraseac-tivity
（LifeScienceResearch,2015,19（3:
237~241
收稿日期:
2014-12-16;修回日期:
2015-02-09
基金项目:
广州市科学研究专项基金项目（2014J100195
作者简介:
邬贤（1991-,女,广东广州人,硕士研究生,主要从事抗肿瘤药理及新药评价研究;*通讯作者:
庞建新（1965-,男,广东广州人,南方医科大学药学院教授,博士,主要从事抗肿瘤免疫及新药评价研究,Tel:
020-61648673,E-mail:
pjx@。
板,在hTERT的作用下使端粒末端得以延长。
hTERT有3个结构域,分别是N末端部分,具有逆转录活性的中间部分（逆转录区,以及一小段C末端序列[4]。
N末端主要是与hTR结合部位,C末端主要是与DNA结合部位,这两部分是hTERT与其他逆转录酶的主要区别。
逆转录区是催化活性部位,几乎所有的逆转录酶在该区的活性基团都高度保守。
目前对hTERT不同片段的研究较多的是将hTERT的N末端和逆转录区的保守基因进行缺失突变或识别hTERT自然存在的不同mRNA剪切体,观察这些突变体或剪切体对肿瘤细胞增殖的影响和端粒酶活性[5~7]。
另外,一些剪切体可以翻译成蛋白质,表现出不同的生理和病理功能,如抑制细胞增殖、抑制Wnt信号途径等端粒外功能[8,9]。
目前对hTERTC末端的研究较少,有研究表明,hTERT的C末端可调节hTERT在细胞内定位[10],对端粒酶的功能不可或缺[11]。
在前期的研究中,我们曾经构建了表达hTERTC末端197个氨基酸（hTERT936-1132,C197的真核表达质粒[12],但表达量不高。
在此基础上,本研究构建了能大量表达C197片段的重组腺病毒Ad-GFP-C197,为进一步研究hTERT的C末端功能打下基础。
同时还发现,过表达C197可明显抑制Hela细胞增殖,促进其凋亡,降低细胞端粒酶的活性,为肿瘤的生物治疗提供新的思路。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种、细胞系、载体
BJ5183、DH5α、HEK293细胞、Hela细胞、重组腺病毒系统AdEasy-1（包含骨架质粒PAdEasy-1和穿梭质粒PAdTrack-CMV均由本实验室保存。
1.1.2实验试剂和设备
胎牛血清、高糖培养基购自美国Hyclone公司;SalⅠ和EcorⅤ限制性内切酶、T4DNA连接酶、Ex-Tag酶、PmeⅠ酶、PacⅠ酶均购自美国Thermo公司;小量质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自美国OMEGA公司;Trizol试剂盒购自上海生物技术有限公司;台盼兰试剂盒购自碧云天公司;凋亡检测试剂盒购自美国BD公司;PVDF膜、TRAP法端粒酶活性检测试剂盒均购自美国Millipore公司;ECL显色试剂盒购自美国Thermo公司;EB溶液购自美国Sigma公
司;6-histag抗体、凝胶成像分析仪（美国Kodak公司;GDPDH抗体、羊抗鼠IgG二抗均购自美国
Santa公司;细胞恒温培养箱（美国Thermo公司;高速离心机（美国Backman公司;荧光倒置显微镜（日本Nikon公司。
1.2方法
1.2.1目的基因获取
根据GenBank公布的人hTERT基因序列,选取C端936-1132氨基序列片段（命名为C197,在该片段中的C端引入EcorⅤ限制性酶切位点,在N端引入6个his标签和SalⅠ限制性酶切位点,片段总长度为650bp,合成后克隆至pGSI载体（上海生工公司合成。
1.2.2重组腺病毒大质粒的构建和鉴定将含有目的基因的pGSI载体进行双酶切（SalⅠ和EcorⅤ酶,酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分离后,回收含有histag的C197基因。
穿梭质粒PAdTrack-CMV分别用SalⅠ和EcorⅤ限制性内切酶进行双酶切,随后在T4DNA连接酶作用下与C197基因进行连接,获得重组质粒PAdTrack-C197。
用PmeⅠ酶线性化PAdTrack-C197,将其转化进入到含有骨架质粒PAdEasy-1的BJ5183细菌中进行同源重组,得重组大质粒PAd-C197。
以重组大质粒PAd-C197为模板,C197基因的上下游引物（上游引物序列:
5′-AGGGTCGACACCAT-GCATCATCACCATCACCAT-3′,下游引物序列:
5′-TGGATATCTCAGTCCAGGATGGTCTTGAA-3′进行PCR扩增鉴定和基因序列测序,同时用SalⅠ和EcorⅤ限制性内切酶对质粒进行双酶切鉴定。
1.2.3重组腺病毒Ad-GFP-C197的包装将重组大质粒PAd-C197进行PacⅠ线性化,用脂质体2000将线性化产物转染进入HEK293细胞中进行腺病毒包装,待细胞出现CPE病变现象时,收集细胞,反复冻融3次,离心（3000r/min,4℃收集上清,得到病毒原液Ad-GFP-C197。
空载体对照病毒Ad-GFP按照同样的方法进行包装。
1.2.4重组腺病毒的纯化及滴度测定Ad-GFP-C197和Ad-GFP在HEK293细胞中扩增后,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒;最后转入透析袋,4℃透析过夜[13]后分装保存,分别取一管用绿色荧光蛋白标记法[14]检测病毒滴度。
1.2.5C197蛋白在Hela细胞中的表达Hela细胞接种于6孔板（每孔2×105个细
胞,分别将Ad-GFP-C197和Ad-GFP（MOI=100转染Hela细胞48h,提取6孔板中细胞的总蛋白行免疫印迹实验。
1.2.6Ad-GFP-C197对Hela细胞凋亡及增殖的影响
收集Ad-GFP-C197和Ad-GFP转染24h、48h和72h的Hela细胞,按照AnnexinV-PE凋亡试剂盒说明书处理样品后上流式细胞仪进行检测并收集数据,根据早期凋亡细胞占活细胞数的比例来计算凋亡率并进行统计;同时将Hela细胞铺于24孔板中（每孔1×104个,共7块板,每组实验6个复孔。
用Ad-GFP-C197和Ad-GFP分别感染各组细胞,每天取1块板进行实验,用胰酶消化各组细胞,采用台盼兰计数法对活细胞进行计数,并绘制细胞增殖曲线图。
1.2.7TRAP法检测Hela细胞的端粒酶活性收集Ad-GFP-C197转染24h、48h和72h后的Hela细胞,Ad-GFP转染72h的Hela细胞以及正常的Hela细胞。
分别提取总蛋白并调成一致浓度,按照TRAPEZETelomeraseDetectionKit说明书操作;产物行12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后用EB溶液染色,于凝胶成像系统下拍照。
1.2.8统计方法
均采用GraphPadPrism5统计作图软件进行统计学分析。
结果均以±s表示。
组间比较采用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1获得目的基因
从含有目的基因C197的pGSI质粒中,用
SalⅠ和EcorⅤ酶进行双酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳可见650bp特异性条带,大小与目的基因相符。
结果见图1。
2.2PAd-C197大质粒的鉴定
以大质粒PAd-C197为模板,C197基因的上下游引物进行PCR,且将PAd-C197大质粒进行SalⅠ和EcorⅤ双酶切,均得到目的条带（650bp,测序结果显示该片段序列与我们预计的序列一致,表明重组大质粒PAd-C197构建正确,结果见图2。
2.3重组腺病毒包装及扩增
PacⅠ酶切线性化的重组大质粒PAd-C197转染至HEK293细胞,1周后镜下可见细胞呈彗星状绿色荧光,见图3;表明重组大质粒在细胞内得到表达,可视为重组腺病毒包装成功。
2.4病毒滴度的测定
Ad-GFP-C197和Ad-GFP经扩增纯化后,采用绿色荧光蛋白法进行病毒滴度测定,结果显示Ad-GFP-C197的滴度为3.14×1011pfu/mL,对照病毒Ad-GFP的滴度为2.34×1011pfu/mL。
2.5C197在Hela细胞内的表达
Ad-GFP-C197转染Hela细胞48h后,和空载体病毒Ad-GFP组相比,Ad-GFP-C197组的C197蛋白成功表达,进一步说明了重组腺病毒Ad-GFP-C197构建成功。
结果见图4。
2.6Hela细胞凋亡和增殖情况
与Ad-GFP组比较,Ad-GFP-C197转染Hela细胞后,在第3d开始出现增殖抑制作用,细胞增图1双酶切获得目的基因C197
1:
DL2000DNAmarker条带;2:
C197cDNA条带（650bp。
Fig.1ObtainedtheC197byrestrictionenzymeassay1:
DNAmarkerDL2000;2:
C197cDNA（650bp.
图2PAd-C197重组大质粒的鉴定
（APCR结果。
1:
PAd-GFP组;2:
PAd-C197组（650bp;M:
BM2000Marker条带。
（B双酶切结果。
1~3:
PAd-C197组（650bp;M:
10000Marker。
Fig.2IdentificationofrecombinantplasmidPAd-C197（ATheresultofPCR.1:
PAd-GFPgroup;2:
PAd-C197group（650bp;M:
BM2000plusDNAMarker.（BRestrictionenzymeassay.1~3:
PAd-C197group（650bp;M:
BM10000plusDNAMarker.
bp12
700
500
bpM12123Mbp10000
700500700
500
10
10
10
10
10
PE-APE-APE-A
图3PAd-C197转染至HEK293细胞荧光显微镜图（×
100
（AHela细胞图;（B绿色荧光图。
Fig.3FluorescentimagesofHEK-293cellsaftertrans⁃
fectionwithPAd-C197（×100
（AImageofHelacells;（BFluorescentimageofHelacells.
殖速率明显降低;在转染后24h、48h、72h,Ad-
GFP-C197转染的Hela细胞的凋亡率明显高于
Ad-GFP对照组,表明Ad-GFP-C197能
Hela细胞增殖并诱导Hela细胞凋亡。
结果见图5。
2.7TRAP法检测Hela细胞的端粒酶活性依据TRAP方法检测端粒酶活性,结果显示,每一组都出现了36bp的条带,说明TRAP方法操作成功,阴性对照组无端粒酶活性。
与端粒酶阳性对照组和空白对照组相比,Ad-GFP转染组的端粒酶活性不受影响,而Ad-GFP-C197转染组的端粒酶活性在第2d开始出现降低,第3d降低得更明显。
说明Ad-GFP-C197能够明显地抑制Hela细胞中端粒酶活性。
结果见图6。
3讨论
端粒酶在除造血组织和生殖细胞外的正常组织中不表达或低表达,而在80%~90%的肿瘤中表达异常增高,所以端粒酶的激活可能是肿瘤发生过程中的关键因素。
而端粒酶逆转录酶hTERT是端粒酶活性的限速酶,hTERT的
表达异常增加也通常被认为是肿瘤发生前期标志[15~17]。
已有研究表明在体外降低hTERT的表达,可以缩短端粒长度、诱导细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞的生长,于是hTERT成为抗肿瘤研究中一个新的特异性靶点[18,19]。
端（RNA结合区、逆转录区（A（B
图4免疫印迹法检测C197蛋白在Hela细胞中的表达
水平
1~2:
Ad-GFP-C197组;3:
Ad-GFP组。
Fig.4Westernblotassaywasusedtodetermineex⁃
pressionofC197proteininHelacells
Lane1~2:
Ad-GFP-C197group;Lane3:
Ad-GFPgroup.
图5重组腺病毒Ad-GFP-C197对Hela细胞增殖和凋亡的影响
（AHela细胞增殖曲线（n=6;（BHela细胞凋亡情况（n=3;*P<0.05、**P<0.05,与Ad-GFP对照组相比。
Fig.5TheeffectofAd-GFP-C197ontheproliferationapoptosisofHelacells
（AProliferationcurveofHelacells（n=6;（BApoptosisofHelacells（n=3;*P<0.05,**P<0.05,comparedwiththeAd-GFPgroup.123
C197
GAPDH
t/d
（A
Timeafterinfection
（B
图6TRAP法检测Hela细胞中端粒酶活性
每一个泳道都能见36bp大小条带（S-IC。
1:
阴性对照组;2:
端粒酶阳性对照组（能见相差6个碱基的梯度条带;3:
Ad-GFP转染组;4,5:
分别是Ad-GFP-C197转染24h和48h组;6,7:
Ad-GFP-C197
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