血型鉴定.docx

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血型鉴定

血型鉴定操作规程

玻片法（仅适用于正定型）

1.原理：

1.1根据红细胞上有无A抗原或（和）B抗原，可以将红细胞血型分为A型，B型、AB型和0型。

根据抗-A和抗B抗体与对应红细胞的凝集反应，可以鉴定ABO血型。

1.2根据抗-D抗体与对应红细胞抗原的凝集反应,区分RhD阳性和RhD阳性。

2标本采集：

用EDTA抗凝管采集被检对象静脉血，充分混匀，确保抗凝充分。

紧急情况下可以使用抗凝动脉血。

婴幼儿及其他不便于真空管采血的患者，如不进行反定型试验可采集末稍血。

3.标本运送与储存：

采集好的标本与申请单同期尽快（一般2小时内）送往输血科。

标本采集后和检测后，应置于2~8℃环境下，检测后的标本应至少保存？

天，以备结果查对。

4.仪器与材料：

抗-A/B血型定型试剂（单克隆抗体）、RhD（IgM）血型定型试剂（单克隆抗体）、载玻片、试管架、次性塑料滴管,记号笔。

5.操作步骤：

5.1用标记笔在载玻片上划分成斗、B、D三个区域：

5.2在标记好的玻片上分别加1滴抗-A、抗-B和抗-D血型定型试剂:

5.3再各加1滴10%患者红细胞悬液（该红细胞悬液可以是盐水悬液，也可以是悬浮于自身血浆或血清中的红细胞）；

5.4用干净的搅拌棒将红细胞悬液和试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖大约直径20mm的面积：

5.5缓慢连频斜推动玻片1-2min,观察结果并记录。

6.结果判定：

6.1减集或发生酒血为阳性结采；

6.2细胞混句2min后仍呈悬液状态的为阴性结果；

6.3对结果有怀疑，应用试晋法或徽柱准胶法重复实验。

二、纸板法

1.原理：

1.1根据红细胞上有无A抗原或（和）B抗原，可以将红细胞血型分为A型、

B型、AB型和0型。

根据抗-A和抗-B抗体与对应红细胞的凝集反应，可以鉴定

ABO血型正定型。

A1细胞上含有A和A1抗原，B细胞上含有B抗原。

用已知的A、B细胞检测被检者血清中有无相应的抗-A或抗-B抗体，即反定型。

综合正反定型结果确定受检标本ABO血型。

1.2根据抗-D抗体与对应红细胞抗原的凝集反应，区分RhD阳性和RhD阳性。

2.标本采集：

用EDTA抗凝管采集被检对象静脉血，充分混匀，确保抗凝充分。

紧急情况下可以使用抗凝动脉血。

婴幼儿及其他不便于真空管采血的患者，可采集末梢血。

3.标本运送与储存：

采集好的标本与申请单同期尽快（一般2小时内）送往输血科。

标本采集后和检测后，应置于2~8℃环境下储存。

检测后的标本应至少保存7天，以备结果查对。

4.仪器与材料：

抗-A/B血型定型试剂（单克隆抗体）、RhD（IgM）血型定型试剂（单克隆抗体）、血型鉴定专用纸板、试管架、一次性塑料滴管、记号笔。

5.操作步骤：

5.1取洁净五孔血型鉴定专用纸板，做好姓名标记；

5.2按纸板标识向每孔中分别加入相应试剂抗A、抗B、抗D血清各1滴以及受检者血清各2滴；

5.3各孔中分别加入受检者红细胞适量及相应所需3-5%A型、B型试剂红细胞（自制或商品化试剂）并搅匀，使其覆盖直径15-20mm的面积；

5.4轻轻旋转摇晃混匀，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块，边摇边观察；

5.53min以上记录结果。

记录观察到的凝集程度或溶血程度。

6.结果判定：

6.1凝集或发生溶血为阳性结果；

6.2细胞混匀2min后仍呈悬液状态的为阴性结果：

6.3对结果有怀疑，应用试管法或微柱凝胶法重复实验。

三、试管法

1.原理：

1.1根据红细胞上有无A抗原或（和）B抗原，可以将红细胞血型分为A型、B型、AB型和0型。

根据抗-A和抗-B抗体与对应红细胞的凝集反应，可以鉴定ABO血型正定型。

A1细胞上含有A和A1抗原，B细胞上含有B抗原。

用已知的A、B细胞检测被检者血清中有无相应的抗-A或抗-B抗体，即反定型。

综合正反定型结果确定受检标本ABO血型。

1.2根据抗-D抗体与对应红细胞抗原的凝集反应，区分RhD阳性和RhD阳性。

2.标本采集：

用EDTA抗凝管采集被检对象静脉血，充分混匀，确保抗凝充分。

紧急情况下可以使用抗凝动脉血。

婴幼儿及其他不便于真空管采血的患者，如不进行反定型试验可采集末梢血。

3.标本运送与储存：

采集好的标本与申请单同期尽快（一般2小时内）送往输血科。

标本采集后和检测后，应置于2~8℃℃环境下储存。

检测后的标本应至少保存7天，以备结果查对。

4.仪器与材料：

抗-A/B血型定型试剂（单克隆抗体）、RhD（IgM）血型定型试剂（单克隆抗体）、一次性试管、试管架、一次性塑料滴管、记号笔。

5.操作步骤：

5.1ABO血型正定型试验

5.1.1取两支洁净试管，做好标记，按试管标记向试管中加入抗-A、抗-B血清各1滴：

5.1.2向每管中各加入1滴3-5％被检红细胞盐水（血清或血浆）悬液：

5.1.3轻轻混合试管内容物，1000g高心15s:

5.1.4结果判断：

将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块；

5.1.5记录结果：

记录观察到的凝集程度或溶血程度。

用ABO反定型实验进一步验证正定型结果。

5.2ABO血型反定型试验

5.2.1取两支洁净试管，做好标记，向每管中各加2滴被检血清（或血浆）；

5.2.2接试管标记向试管中加入3-5%A型、B型试剂红细胞各1滴：

5.2.3轻轻混合试管内容物，1000g离心15s；

5.2.4结果判断：

将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块;

5.2.5记录结果：

记录观察到的凝集程度或溶血程度。

与正定型结果进行相互验证：

5.2.6如果反应较弱，可将试管于温（或4）放置5～~10min，以促进弱抗体的反应，再离心观察结果。

如果反应还是很弱可以增加血清（或血浆）滴数，最多到6滴以加强反应。

5.3RhD血型鉴定试验

5.3.1取一支洁净试管，做好标记，加入抗-D血清1滴：

5.3.2向试管中加入1滴3-5%被检红细胞盐水（血清或血浆）悬液：

5.3.3轻轻混合试管内容物1000g离心15s:

5.3.4结果判断：

将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块：

5.3.5记录结果：

记录观察到的凝集程度或溶血程度。

6.1凝集或发生溶血为阳性结果：

6.2细胞混匀2min后仍呈悬液状态的为阴性结果。

四、微柱凝胶法

1.原理：

ABO/RhD卡的微管中装填有葡聚糖凝胶颗粒和抗A、抗B、抗D标准血清，如果红细胞表面存在A或B或D抗原，就会与对应的抗体发生凝集反应，凝胶颗粒具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过凝胶颗粒，使其悬浮在凝胶颗粒中，未凝集的红细胞则可以通过凝胶颗粒到达微管底部。

2.标本采集及处理：

用EDTA抗凝管采集被检对象静脉血，充分混匀，确保抗凝充分。

紧急情况下可以使用抗凝动脉血。

3000rpm，离心3-5min。

（婴幼儿及其他不便于真空管采血的患者，如不进行反定型试验可采集末梢血。

）

3.标本运送与储存：

采集好的标本与申请单同期尽快（一般2小时内）送往输血科。

标本采集后和检测后，应置于2~8℃环境下储存。

检测后的标本应至少保存7天，以备结果查对。

4.仪器与材料：

ABO\RhD血型定型检测卡（单克隆抗体）、ABO\RhD血型检测卡（微柱凝胶）、、试管架、一次性塑料滴管、记号笔、一次性试管。

5.操作步骤：

5.1将微住凝胶试剂卡做好患者姓名等标记；

5.2将待检红细胞用低离子强度溶液稀释成0.5%-0.8%的悬浮液，加入标有-A、-B、-D（和对照）的微管中，各1滴（或50ul）;

5.3用低离子溶液将反定型红细胞A、B配成0.5%~0.8%浓度，分别加入对应的微孔A、B.中，各1滴（或50μ1）。

再分别加入患者血浆各1滴（或50μ1）；

5.4专用离心机离心5分钟，2分钟900rpm3分钟1500rpm，取出肉眼判定结果。

6.结果判定：

6.1阳性结果：

红细胞抗原与相应抗体在微住凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应。

6.1反应强度：

特异性红细胞抗原抗体复合物位于凝胶表面，为强阳性反应：

复合物在凝胶中为弱阳性反应；愈靠近凝胶底部颗粒愈小，反应愈弱。

6.1阴性结果：

被检红细胞抗原无相应的抗体结合，不出现特异性抗原抗体复合物，红细胞沉于为主凝胶的底部。

附：

血型反应格局与结果对照表

正定型试验

（患者红细胞与下列试剂反应）

反定型试验

（患者血清血浆与下列试剂反应）

血型结果

抗A

抗B

抗O

空白对照

A细胞

B细胞

O细胞

+

-

+

-

-

+

-

A型阳性

-

+

+

-

+

-

-

B型阳性

-

-

+

-

+

+

-

O型阳性

+

+

+

-

-

-

-

AB型阳性

+

-

-

-

-

+

-

A型阴性

+

-

-

+

B型阴性

-

-

-

+

+

-

O型阴性

+

+

-

-

-

-

-

AB型阴性

不规则抗体筛查试验操作规程

1.目的为规范红细胞不规则抗体筛选、鉴定的技术操作，保证检查结果准确和临床输血安全、有效，依据《输血实验室管理程序》有关条款的要求制定本规程。

2.适用范围本规程适用于本院红细胞不规则抗体的筛查。

3.职责输血科具有专业技术资格的人员负责红细胞不规则抗体的筛选和鉴定，但只对所筛选或鉴定的标本负责。

4.相关文件

试剂采购、保存和使用管理程序

设备采购、使用管理程序

消毒与清洁管理程序

标本采集、运输、保存和报废管理程序

5.相关记录

仪器设备的采购、使用和维护记录

仪器的温度记录

恒温水温箱的换水和消毒记录

消毒液的配置记录

清洁消毒记录

试剂采购、使用记录

标本交接和报废记录

6.实验原理

采用盐水介质法、凝聚肢法或抗球蛋白法等试验使受检者血清（血浆）与筛选红细胞反应，检测受检者血清（血浆）中是否存在红细胞不规则抗体，红细胞不规则抗体阳性者进一步与谱红细胞反应，根据反应格局鉴定抗体特异性。

7.仪器设备和检测环境

7.1.仪器设备等：

玻璃试管（75X12mm）、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、交叉配血专用离心机、试管架、恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱。

7.2.检测环境：

室温应控制在18~27，湿度应保持在30~70%。

8.试剂

①生理盐水、凝聚胺试剂、直接抗人球蛋白试剂（抗IgGC3d），均为有合格证件的正品。

②市售0型筛选红细胞：

为三支以上不同人份的3%筛选红细胞，均为有合格证件的正品。

或自制0型筛选红细胞：

选择已确认ABO血型为0型的健康者，采集EDTAK,抗凝血标本离心，取少许红细胞置于试管中，用生理盐水离心洗涤3次得压积红细胞[3400转分钟（1000g），每次离心1分钟，离心后将上清液全部倒出]，再取30川1游离红细胞加入到标记为1号的试管中，然后加入1ml生理盐水混匀，即得I号0型3%的筛选红细胞；依同样方法分别制备不同人份的Ⅱ号和I号0型3%的筛选红细胞。

9.血标本的处理

将受检者血标本离心分离出血清（血浆）和压积红细胞，血清（血浆）备用；再吸取30μL压积红细胞中的游离红细胞，加入1ml生理盐水中，混匀配成3%的自身对照红细胞悬液备用。

10.实验方法与步骤

10.1.盐水介质法

①取4支干净试管，分别标记为Ⅱ、Ⅱ、ⅡI和自身对照：

②每管中先各加入2滴受检者血清（血浆）；

③再分别加入1滴对应的3%的Ⅰ号、Ⅱ号、Ⅲ号筛选红细胞和自身对照红细胞悬液：

④混匀后，用交叉配血专用离心机120g高心1分钟：

⑤先肉眼观察溶血情况，再轻轻充分混匀后，用肉眼或光学显微镜观察凝集情况，并记录。

③结果判读：

自身对照管和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号管均无凝集者，为不规则抗体筛查阴性，表明未检出红细胞不规则抗体;自身对照管和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号管均凝集者，为不规则抗体筛查阳性，表明受检者血清（血浆）中含冷自身抗体或同时伴有同种免疫性红细胞不规则抗体;自身对照管无凝集，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号管中至少有1管出现凝集，为不规则抗体筛查阳性，表明受检者血清（血浆）中含IgM同种免疫性红细胞不规则抗体。

10.2.凝聚胺法

①盐水介质法筛选红细胞不规则抗体试验结束后转做凝聚胶法试验，具体执行《凝聚胺法交叉配血试验操作规程》。

②结果判读：

自身对照管和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号管均无凝集者，为不规则抗体筛查阴性，表明未检出红细胞不规则抗体;自身对照管和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号管均凝集者，为不规则抗体筛查阳性，表明受检者血清（血浆）中含IgG自身抗体或同时伴有IgG同种免疫性红细胞不规则抗体;自身对照管无凝集，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号管中至少有1管出现凝集，为不规则抗体筛查阳

性，表明受检者血清（血浆）中含IgG同种免疫性红细胞不规则抗体。

10.3.直接抗人球蛋白法

①盐水介质法筛选红细胞不规则抗体试验结束后转做直接抗人球蛋白试验，具体执行《直接抗人球蛋白试验操作规程》。

②结果判读：

同10.2.

10.4.红细胞不规则抗体特异性鉴定对红细胞不规则抗体筛选试验阳性的血标本，建议受检者到省级以上三甲医院作进一步的红细胞不规则抗体特异性鉴定。

11.质量控制

11.1.进行红细胞不规则抗体筛选试验时，应至少选择1种可检出IgG抗体的方法。

11.2.所有试剂均应在有效期内使用，每批试剂使用前均应对试剂进行质量控制，以确保质量符合要求。

11.3.操作时，应同步设置必要的阴性、阳性和自身对照。

12.注意事项

12.1.多数IgG类红细胞不规则抗体比IgM类红细胞不规则抗体更有临床意义，盐水介质法通常只能检出IgM类红细胞不规则抗体，不宜单独采用盐水介质法检测红细胞不规则抗体，可结合凝聚胺法或抗球蛋白法。

12.2.理论上，凝聚胺法除不能检出扰-K外，其它红细胞血型抗体均可检出，但实际工作中许多红细胞血型弱抗体（包括IgM和IgG类）不能被凝聚胶法检出，对部分IgM类血型抗体的检测，凝聚胺法甚至没有盐水介质法敏感。

12.3.抗球蛋白法对有临床意义的I2G类抗体检测敏感，且可鉴别多数无临床意义的抗体，但本方法操作复杂、费时，目前尚不能实现自动化，不适合批量血标本的检测。

12.4.红细胞不规则抗体筛选试验检出自身抗体时，应采用自身吸收试验后，再检测血清（血浆）中是否还有同种不规则抗体。

12.5.用于红细胞不规则抗体筛选试验的筛选细胞，应尽可能多地表达有临床意义的抗体对应的抗原，而且纯合子基因所表达的抗原更有利于相应抗体的检出。

要求筛选细胞必

须表达D、C、E、c、e、M、N、S、s、P、Lea、Leb、K、k、Fya、Fyb、Jka和JKb18种抗原。

12.6.由于用于红细胞不规则抗体筛选试验的筛选细胞很难表达所有有临床意义的抗体对应的抗原，以往免疫所产生的抗体也可降至难以检出的水平，故无论采用何种方法进行红细胞不规则抗体筛选试验，都有漏检由临床意义抗体的可能。

12.7.自身抗体和同种抗体可同时存在，也可能有多种同种抗体同时存在，还可能有联合抗体存在，故实际工作中常会遇到难以鉴定红细胞不规则抗体特异性，可送有条件的实验室进行鉴定。