植物实验指导书.docx

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植物实验指导书

《环境生理学》实验指导书 实验一、植物气孔分布的观察

1.基础知识

气孔（Stomata）是由植物叶片表皮上成对的保卫细胞以及之间的孔隙组成的结构，是植物与外界进行气体交换的门户和控制蒸腾的结构。

气孔在碳同化、呼吸、蒸腾作用等代谢活动中，成为空气和水蒸汽的通路，其通过量由保卫细胞的开闭作用来调节，在植物环境生理上具有重要意义。

一般来说，气孔在白天开放，晚上关闭（景天科的植物除外）。

与表皮细胞不同，保卫细胞在结构中含有叶绿体，只是体积较小，数目也较少，片层结构发育不良，但能进行光合作用合成糖类物质。

有时也伴有与保卫细胞相邻的2-4个副卫细胞。

把这些细胞包括在内是广义的气孔器。

紧接气孔下面有宽的细胞间隙（气室）。

浮水植物的气孔只在上表皮分布，陆生植物叶片的气孔在上下表皮都可能有，一般阳生植物的气孔分布在叶下表皮较多。

花序、果实、尚未木质化的茎、叶柄和卷须上也有气孔存在。

气孔的大小随植物种类和器官而异，一般长约20-40μm，宽约5-10μm。

每平方厘米叶面上约有气孔2000-4000个。

气孔的开闭机理：

当肾形保卫细胞吸水膨胀时，细胞向外弯曲，气孔张开，而保卫细胞失水体积缩小时，壁拉直，气孔关闭；哑铃形保卫细胞吸水时两头膨胀而中间彼此离开，气孔张开，失水时两头体积缩小中间部分合拢，气孔关闭。

2.实验材料与器具

植物叶片、培养皿、刀片、镊子、毛笔、清水、透明指甲油

3.仪器设备

显微镜（BX51,OlympusCO.,Japan）

4.操作步骤

4.1徒手制片

（1）徒手临时切片法

在培养皿中放入清水，将欲切材料断面沾水，以左手拇指、食指、中指捏住材料，拇指略低于食指和中指，材料切面应稍高于食指，其余手指略低于食指，以免切片时损伤手指。

右手执刀，将刀平放在左手食指上，刀口朝内指向材料切割面饼与材料断面平行，然后以均匀快捷的动作自左前方向右后方以臂力带动刀片水平切割移动（手腕不必用力）。

切片时动作要迅速，材料一次切下，切忌停顿或拉锯式切割。

连续切数片后，用湿毛笔将切下的薄片轻轻移动到盛水的培养皿中备用。

用毛笔或镊子挑选最薄而透明的切片置于载玻片上，盖上盖玻片作为临时切片，置于显微镜下即可观察气孔。

注意：

1）整个切片过程中均用清水润湿材料和刀面；

2）切片时应注意要连续切片，不要切一片看一片，否则切不出好的薄切片且费时；

3）切片过程中有时因用力不均或刀不锋利而出现切片倾斜的现象，要及时修正；

（2）指甲油涂抹撕取制片法

将植物叶片展开，清除表面灰尘，若表面有水，用吸水纸吸干。

将指甲油均匀涂抹于取材部位上，使其自然晾干3-8min（受光照、风等影响，晾干所需时间不一），待指甲油涂抹层接端稍稍与叶片出现离口时，用镊子夹住离口处撕下已干的指甲油涂抹层，然后将其放至加有一小滴水的载玻片上，借水的表面张力，将薄膜自然展开。

盖上盖玻片后作为临时切片，置于显微镜下即可观察气孔。

4.2显微镜观察

（1）对光。

先将低倍物镜转到载物台中央，正对通光孔。

用左眼接近目镜观察，同时用手调节反光镜和集光器，使镜内光亮度适宜。

镜内所看到的范围叫视野。

（2）放片。

把切片放到载物台上，被观察的部位对准物镜，用压片夹固定切片。

（3）观察。

转动粗准焦螺旋，使镜筒缓慢下降，至物镜接近切片时为止。

然后左眼从目镜向内观察，并转动粗准焦螺旋使镜筒缓慢上升，直至看到物象为止（显微镜内的物像是倒像），再转动细准焦螺旋，将物像调至最清晰。

需要CCD拍照时将观察筒右侧的光路切换拉杆拉出一档（拍摄同时可以镜下观察）或两档（只能拍摄）即可。

（4）还镜。

使用完毕应先将物镜移开，再取下切片。

把显微镜擦拭干净，各部分恢复原位。

注意：

1）先用软的擦镜纸或吸耳球去除光学元件上明显的灰尘；用镜头纸蘸取少量擦镜液（乙醚:

无水乙醇=7:

3（V/V）配置），轻轻擦去镜头上的油污。

（2）使用显微调焦系统时切忌快速大力的拧调节旋钮，及左右相反方向拧调节旋钮，以免损伤齿。

（3）关闭显微镜光源后，将亮度旋钮轻轻拧到最小位置；注意每次使用后等灯室冷却后再盖上防尘罩，以免发生火灾。

图1显微镜下洋兰叶片的气孔状况    图2显微镜下铁皮石斛的气孔状况

《环境生理学》实验指导书 实验二、植物叶绿素含量的测量

1.基础知识

叶绿素（Chlorophyll）作为绝大多数绿色植物叶绿体中含量最多的色素，是光合作用中捕获光的主要成分，其含量与光合速率、作物营养状况密切相关。

叶绿素通常被当作评估农作物生长发育阶段的氮素胁迫和光合作用能力的指示器，也是评价植物生理状况的一项重要指标。

植物叶绿素含量的测定大致可分为基于比色原理的分光光度法和基于光透过原理的活体测量法两大类。

分光光度法是一种破坏型的测量方法，需把叶绿素溶解到有机溶剂中进行测量；活体测量法是一种非破坏型的测量方法，可以使用新鲜而活体的叶片直接进行测量。

1.1叶绿素的分光光度法的测量原理

叶绿素不溶于水，易溶于有机溶剂，通常利用丙酮、酒精等有机溶剂对其浸提后进行分光光度测量。

根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，当一束单色通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液温度等条件不改变的情况下，溶液对光的吸收度与溶液浓度及液层厚度的乘积成正比。

该方法的数学表达式为：

A=ECL，式中A为吸收度，也叫光密度；E为比例常数，数值等于液层厚度为1cm，溶液浓度为1%（1g100ml-1）时的吸收度值；C为溶液浓度，单位为g100ml-1；L为液层厚度，一般为1cm。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。

欲测定叶绿体色素的混合提取液中的叶绿素a和叶绿素b的含量，只需测定该提取液在特定波长下的光密度D值，并根据叶绿素a、b在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。

已知叶绿素a和叶绿素b在80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663和645nm，又知在该溶液中，叶绿素a和叶绿素b在波长663nm下的系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下的系数分别为16.75和45.60，根据加和性原则列出以下关系式：

D663=82.04Ca+9.27Cb           

（1）

D645=16.75Ca+45.60Cb           

（2）

式

（1）和式

（2）中的D663和D645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的光密度，Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度，以mgm-3为单位。

解上述方程组即得Ca和Cb，将Ca与Cb相加即得叶绿素总含量CT。

1.2叶绿素的活体测量法的测量原理

基于植物叶片对光的反射、吸收和透过光谱特性而研制的便携式仪器即可进行植物叶片的叶绿素活体测量。

日本Minolta公司基于650nm和940nm的光透过植物叶片后的光学密度差原理开发的SPAD（Soil&plantanalysisdevelopment）叶绿素计（SPAD-502,Minolta,Japan）已被广泛应用于各种植物叶片的叶绿素测量和植物氮素营养快速诊断。

2.实验材料与器具

植物叶片、体积比为80%的丙酮溶液（现用现配）、15ml带盖或带塞试管、剪刀

3.仪器设备

便携式叶绿素计（SPAD-502,Minolta,Japan）、分光光度计（UV2100，上海尤尼柯公司，中国），万分之一天平（FA1204B，上海精密科学仪器有限公司）

4.操作步骤

4.1叶绿素的活体测量

打开SPAD502的电源，当屏幕显示“CAL”时，空按一下叶室进行校准，听到叮一声响后屏幕显示“NO1---”即可测量。

测量时应注意将叶片夹在测量窗口，且同一个叶片应测量不同位置后进行平均后方可作为该叶片的叶绿素浓度的相对评价。

注意：

测量时不取叶片边缘的部位，也不取叶脉中央与叶柄处。

4.2叶绿素的分光光度法测量

（1）浸提。

称量叶片0.05g/0.1g/0.2g（叶片较小时，可称量0.05g或0.1g；叶片较大或较厚时，可称量0.2g），剪碎后加入装满10mL的80%丙酮溶液的试管中，加盖或塞后放置在阴凉暗黑条件或4℃冰箱内浸提12-16小时。

待叶片完全变白后作为叶绿素的提取液待用。

注意：

1）80%丙酮溶液使用纯的丙酮溶液与超纯水按照体积比8：

2进行配制；

2）叶片较厚时可适当延长浸提时间。

（2）测量。

将提取液摇匀，倒入干净的比色皿中，以80%丙酮溶液做参比，使用分光光度计分别测量其在663nm和645nm的吸光度值D663、D645，按照Arnon法的修正公式计算。

如下所示：

Ca=12.72D663-2.59D645

Cb=22.88D645-4.67D663

CT=Ca+Cb=20.29D645+8.05D663

叶绿素a（Chla，mgg-1）=Ca×V/W

叶绿素b（Chlb，mgg-1）=Cb×V/W

总叶绿素含量（ChlT，mgg-1）=CT×V/W

其中，V：

提取液的体积（L）；W：

浸提时称取的叶片重量（g）。

注意：

1）丙酮为有刺激性气味的挥发性有机溶剂，实验过程中请戴手套和口罩；

2）比色测量时，如果提取液中的叶绿素含量太高而超过吸光光度计的吸光度正常范围时，需先用背景溶液（80%丙酮）稀释后，再使用分光光度计进行测量；

3）测量完成后，将分光光度计正确关机；

4）试验结束后将实验台面清洁干净、试管和比色皿及时清洗；

5）注意将比色皿先用酒精冲洗2次，再用清水反复冲洗干净。

《环境生理学》实验指导书   实验三、叶片分光光谱特性的测量

1.基础知识

1.1植物叶片的光谱响应

叶绿素b

叶绿素a

高等绿色植物对光的吸收是有选择性的，主要集中在400～460nm的蓝紫区和600～700nm的橙红区。

植物叶片的各种色素是支配植物光谱响应的主要因素，其中叶绿素所起的作用最为重要。

叶绿素对光的吸收的中心波长分别为450nm（蓝色）和650nm（红色）。

在这两个叶绿素吸收带之间的吸收作用较小，故在540nm（绿色）附近形成一个反射峰，因此许多植物看起来是绿色的。

此外，叶红素和叶黄素在450nm（蓝色）附近有一个吸收带，但是由于叶绿素的吸收带也在这个区域内，所以这两种色素在植物叶片的光谱响应模式中起主导作用。

在光谱的近红外波段，植物叶片的光谱特性主要受植物叶子内部构造的控制。

健康的绿色植物在近红外波段的光谱特征是反射率高（45-50%），透过率高（45-50%），吸收率低（<5%）。

在可见光波段与近红外波段之间，即大约760nm附近，反射率急剧上升，形成“红边”现象，这是植物反射光谱曲线的最为明显的特征，是今年来植物营养诊断研究的重点光谱区域。

许多种类的植物在可见光波段的光谱响应的差异小，但近红外波段的反射率差异明显。

同时，与单片叶子相比，多片叶子能够在光谱的近红外波段产生更高的反射率（高达85%），这是因为附加反射率的原因，因为辐射能量透过最上层的叶子后，将被第二层的叶子反射，结果在形式上增强了第一层叶子的反射能量。

在中红外光波段，绿色植物叶片的光谱响应主要表现为1400nm、1900nm和2700nm附近被水强烈吸收。

2700nm是一个最主要的水吸收带，它表示水分子的基本振动吸收带。

1900nm，1100nm，960nm的水吸收带均为倍频和合频带，故强度比水的基本吸收带弱，而且是依次减弱的。

1400nm和1900nm处的吸收带是影响叶子在中红外波段光谱响应的主要谱带。

1100nm和960nm处的水吸收带对叶子的反射率影响也很大，特别是在多层叶片的情况下。

研究表明，植物对入射光中的红外波段能量的吸收程度是叶子中总水分含量的函数，即是叶子水分百分含量和叶子厚度的函数。

随着叶子水分减少，植物中红外波段的反射率明显增大。

1.2叶片分光光谱特性的测量原理

任一物质对不同波长的光（电磁波）的吸收和反射都不同，物质的这种对不同波段光谱的响应特性叫光谱特性。

植物叶片的光谱特性检测原理是植物体生化组分的化学分子结构中的化学键在一定辐射水平的照射下发生振动，引起某些特征波长的光谱反射和吸收差异，从而产生了不同的透过光谱或反射光谱。

影响叶片的光谱特性的主要物质有叶绿素、蛋白质、水分和含碳化合物。

积分球是漫反射测量中的常用附件之一，是具有高反射性内表面的空心球体。

用来对处于球内或放在球外并靠近某个窗口处的试样对光的散射或发射进行收集的一种高效率器件。

积分球内壁涂白色漫反射层，且球内壁各点漫射均匀。

入射光透过样品后经过积分球上的小窗口进入积分球内部，在积分球内经过多次漫反射后到达检测器。

2.实验材料与仪器设备

材料：

植物叶片的活体样本

仪器：

紫外可见近红外分光光度计（UV3150，岛津制作所，日本）

3.操作流程

（1）仪器自检与校准

打开电源后进行仪器自检，然后进行空白扫描作为基线校正。

然后设定测量条件进行测量。

（2）植物测量部位的选择

叶片的测定位置应选择其光谱响应有代表性的部位，注意不取叶片边缘和叶柄与叶脉处，一般取叶片中部距离叶基部约为55%的位置。

（3）叶片的透过光谱特性的检测

点击菜单栏上的M键，在［仪器参数］标签，选择测定种类为透过率（Transmission），设定测量波长范围300-1100nm或300-3200nm，扫描速度为快速，扫描步长为Auto；狭逢带宽（Slit）为20nm；S/RExchange设定为Normal；氘灯和钨灯的光源波长切换点设置在360nm处，光栅的波长切换点设置在820nm处。

首先在参比位置放如标准硫酸钡白板，进行基线校准，将TOW?

设置到500nm后再点击调零。

然后，将样本叶片放置到指定位置，点击Star开始测量即可。

（4）叶片的反射光谱特性的检测

①绝对反射率的测定。

点击菜单栏上的M键，在［仪器参数］标签，选择测定种类为反射率（Reflectance），设定测量波长范围300-1100nm或300-3200nm，扫描速度为中速，狭逢带宽（Slit）为20nm；S/RExchange设定为Normal。

在参比光路的指定位置放入标准硫酸钡白板作为参比物进行基线校准，然后自动调零；然后在样品光路中放入测试样本，点击Star开始测量。

②相对反射率的测定。

点击菜单栏上的M键，在［仪器参数］标签，选择测定种类为反射率（Reflectance），设定测量波长范围300-1100nm或300-3200nm，扫描速度为中速，狭逢带宽（Slit）为20nm；S/RExchange设定为Inverse。

然后在指定位置放入反光镜作参比物，进行基线校准然后自动调零；取下参比物，放入样本叶片点击Star开始测量。

测试时入射光的角度为8o。

（5）叶片的吸收光谱特性的检测

将植物叶片置于分光光度计的大样品室中，并选好测量部位，利用积分球扫描叶片在190-3200nm范围的分光光谱透过特性，利用漫发射装置扫描叶片在190-3200nm范围的分光光谱反射特性。

然后利用（1-透过率-发射率）计算得到其分光光谱吸收特性。

此外，植物叶片的分光光谱吸收特性可以使用分光光度计本体的固体样本夹进行活体测量，测量波长范围也可以为300~3200nm，扫描速度为快速，扫描步长为1nm，氘灯和钨灯的光源波长切换点设置在360nm处，光栅的波长切换点设置在820nm处，狭缝宽度设置为20nm。

注意：

1）取叶片的不同部位分别扫描后取其均值作为该叶片的分光光谱特性；

2）UV3150分光光度计为精密光学仪器，一定要连接稳压电源使用。

3）检查分光光度计的干燥管。

图1紫外可见近红外分光光度计     图2 黄瓜叶片的反射与透过分光光谱分布

《环境生理学》实验指导书   实验四、叶片光合特性的活体测量

1.基础知识与测量原理

光合作用是绿色植物吸收光能将CO2和H2O合成为有机物质并释放O2的过程，光合速率是反映植物光合作用能力的重要指标。

光合速率一般可根据植物对CO2的吸收量来进行测定，其测量原理是：

在放有植物叶片的密闭式同化室中，由于叶片的光合作用，密闭式同化室中的CO2浓度不断下降，记录单位时间内同化室中CO2浓度的减少量或单位CO2浓度减少量所需的时间，再根据叶面积和同化室体积即可计算出叶片的净光合速率。

同样，植物叶片的蒸腾作用是水分从活的植物体表面（主要是叶子）以水蒸汽状态散失到大气中的过程。

蒸腾作用不仅受外界环境条件的影响，而且还受植物本身的调节和控制。

蒸腾速率也可以根据植物对H2O的吸收量或散失量来进行测定，其测量原理是：

在放有植物叶片的密闭式同化室中，由于叶片的蒸腾作用，密闭式同化室中的H2O浓度不断下降，记录单位时间内同化室中H2O浓度的减少量或单位H2O浓度减少量所需的时间，再根据叶面积和同化室体积即可计算出叶片的蒸腾速率。

2.实验材料与仪器

材料：

植物叶片的活体样本

仪器：

便携式光合仪（LI-6400, LI-CORInc., USA）

3.操作步骤

（1）仪器连接好本体和叶室，并连接好进气缓冲瓶；确定连接无误后打开主机电源开关。

（2）仪器在启动后将显示“Is the IRGA connected?

（Y/N）”，选择Y。

（3）选择正确的叶室的驱动程序后回车。

（4）校准调零（什么情况下需要调零？

请参见LI6400操作手册或咨询指导老师）

调零步骤：

向SCRUB方向拧紧碱石灰管和干燥管上端的螺母。

关闭叶室，即压下黑色手柄并旋紧固定螺丝即可。

在主菜单按F3按钮选“Calib Menu”项：

1选择“FlowMeterZero”项（调气流量为零），回车。

等待流速的电压读数基本稳定，用F1、F2上下调节至读数基本稳定，且在-0.5V到+0.5V范围内，按Exit按钮退出。

2选择“IRGAZero”（红外线气体分析仪调零），回车。

等待CO2浓度和H2O浓度的下降，至读数基本稳定（一般需20分钟）后，按F3“AutoAll”键，结束后选择“Exit”退出。

3选“ViewStoreZerosSpans”，回车后按F1“Store”来保存，按“Y”来确定后按F5“Exit”退出。

调零完成后，按“Escape”，回到主菜单。

（5）测量条件的设定

打开仪器本体底部的各种测量条件设定，设定其合理的气流速率（Flow）、CO2浓度（mixer）、温度（Tbleak°C、Tleaf°C）、光照强度（ParIn_μm）、相对湿度（RH）等。

（5）光合速率和蒸腾速率的测量

向Bypass方向拧紧干燥管和碱石灰管上端的螺母使空气进入叶室。

按F4“NewMeasurements”菜单进入测量菜单。

设定文件：

按F1“OpenLogfile”建立新文件。

回车后输入自己设定的文件名。

当显示屏出现提示“EnterRemark”时，输入需要的标记（输入植物种类、样品号等），回车，显示测量菜单界面。

夹入叶片前如果C行光合Photo值大于0.5或小于-0.5，那么应该按F5“Match”进行匹配。

光合与蒸腾测量：

夹上叶片（让叶片充满整个叶室，标准叶室的叶面积为6cm2），压下黑色手柄关闭叶室。

等待C行PHOTO读数稳定后即可记录（判断标准是小数点后最后一位数字的波动在±0.2左右）。

按F1“LOG”按钮即记录一组数据。

叶片装入叶室后，光合速率可能会有暂时下降现象，以后逐渐上升，一般经3-5min（视植物状况而定）后保持稳定。

测量过程中主要记录：

1）Photo（光合作用速率（μmolCO2m-2s-1））、Cond（气孔导度（molH2Om-2s-1）、3）Ci（胞间CO2浓度（μmolCO2mol-1））、4）Trmmol（蒸腾速率（mmolH2Om-2s-1）。

注意：

1）测量之前应将植物置于光下半小时以上，使气孔充分张开；

2）如测量叶片表面有水分灰尘，需小心擦拭掉；

3）测量过程中，请勿硬拉硬扯或插拔仪器连接线。

表1 便携式光合仪LI-6400的参数表

（主机显示屏测量菜单显示的参数说明，A-L是行号）

A

CO2R_μml

参比室CO2浓度（μmolCO2mol-1）

G

Prss_kPa

大气压力（kPa）

CO2S_μml

样本室CO2浓度（μmolCO2mol-1）

ParIn_μm

叶室内光合作用有效辐射（μmolm-2s-1）

H2OR_mml

参比室H2O浓度（mmolH2Omol-1）

ParOutμm

外界光合作用有效辐射（μmolm-2s-1）

H2OS_mml

样本室H2O浓度（mmolH2Omol-1）

BLC_mol

总叶片边缘层导度（molm-2s-1）

B

△CO2_μml

CO2变化量（样本-参比）

（μmolCO2mol-1）

H

Tblock°C

冷却器温度（℃）

△H2O_mml

H2O变化量（样本-参比）

（mmolH2Omol-1）

Tair°C

样本室温度（℃）

Flow_μml

样本室内气流速率（μmols-1）

Tleaf°C

叶片温度（℃）

RH_S_%

样本室内相对湿度（%）

C

Photo

光合作用速率（μmolCO2m-2s-1）

I

HH:

MM:

SS

实时时钟

Cond

气孔导度（molH2Om-2s-1）

Program

自动测量程序状态

Ci

胞间CO2浓度（μmolCO2mol-1）

CHPWMF

Statusword（summaryoflineJ）

Trmmol

蒸腾速率（mmolH2Om-2s-1）

Battery

电池电压（V）

D

Ci/Ca

胞间CO2/环境CO2

J

CO2

CO2IRGAs状态

VpdL

叶温下蒸气压亏缺（kPa）

H2O

IRGAs状态

VpdA

气温下蒸气压亏缺（kPa）

Pump

泵状态

Flow

流速控制器状态

Mixr

CO2混合器状态

Fan

叶室风扇状态

E

totalCV%

.CO2CV_%,.CV_%,及Flow_CV%总变异系数

K

Program

显示自动测量程序状态

△CO2CV_%

△CO2_μml（%）变异系数

ProgPrgs

AutoProgramstepcounter

△H2OCV_%

△H2O_mml（%）变异系数

FwMxCrLp

Numericalsummaryofthefourstabilityflags

Flow_CV%

Flow_μml（%）变异系数

totalCV%

SeetotalCV%underEabove

F

RH_R_%

参比室相对湿度（%）

L

CRagc_mv

ReferenceCO2AGC（automaticgaincontrol）signal,inmV

RH_S_%

样本室相对湿度（%）

CSagc_mv

SampleCO2AGCsignal

Td_R_%

参比室露点温度（C）

HRagc_mv

ReferenceH2OAGCsignal

Td_S_%

样本室