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拉曼光谱测量中的荧光抑制方法综述
拉曼光谱测量中的荧光抑制方法综述
第3z卷笫5期
2010年1O月
光学仪器
OPTICALINSTRUMENTS
Vo1.32,No.5
October,2010
文章编号:
1005—5630（2010）05—0089—06
拉曼光谱测量中的荧光抑制方法综述
邹文龙,蔡志坚,吴建宏
（苏州大学信息光学工程研究所,江苏苏州215006）
*
摘要:
拉曼光谱是物质的特征结构谱,但是在许多情况下,除了激发出拉曼散射光之外,还会激
发出强度远大于拉曼散射的荧光,从而限制了拉曼光谱的应用.因此在拉曼检测中对荧光采取
抑制措施是十分必要的.在过去的几十年里发展了多种荧光抑制方法,包括荧光淬灭剂法,光
漂白法,红外/紫外激发法,偏振调制法,移频激发法,高频调制法,门控法,数值处理法,非线性
效应法等.文中概括性地介绍了上述各种技术方法的原理,并扼要地分析比较了各自的性能
特点.
关键词:
拉曼光谱;荧光抑制;信噪比
中图分类号:
TH744.1文献标识码:
Adoi:
10.3969/j.issru1005—5630.2010.05.019
ReviewoffluorescencerejectioninRamanspectroscopymeasurement
ZOUWenlong,CAIZhijian,WUJianhong
（InformationOpticalEngineeringInstitute,SoochowUniversity,Suzhou215006,China）
Abstract:
Ramanspectroscopyprovidesafingerprintofthemolecules.However,inmany
casesthefluorescencewillalsobestimulatedapartfromtheRamanscattering.The
fluorescenceintensityisoftenseveralmagnitudesstrongerthanthatoftheRamansignal,
whichseverelyobstructsthenormalapplicationofRamanspectroscopy.ItSnecessarytotake
someproperfluorescencerejectionmeasuresinRamandetection.Manymethodsand
techniqueshadbeenproposedanddevelopedtosuppressthefluorescencedisturbanceinthe
pastdecades,includingfluorescencequenching,photo-bleaching,IR/UVexcitation,
polarizationmodulation,shiftedexcitationRamanspectroscopy,high-frequencymodulation,
time-gateddetection,numericalprocessingandnonlinearspectroscopictechniques.Thispaper
brieflyintroducedthesetechniquesandmadesomeanalysisontheircharacteristicsand
performances.
Keywords:
Ramanspectroscopy;fluorescencerejection;signaltonoiseratio
引言
拉曼散射现象是印度科学家拉曼在1928年发现的,从那以后拉曼光谱受到科学家的广泛重视,
是上世纪6O年代激光器的诞生,给拉曼光谱的应用带来了新的发展空间.拉曼光谱反映分子内部
特别
各种
简正振动频率及有关振动能级的情况,利用这些信息可以鉴定分子中存在的官能团以及相关的化学结
收稿日期:
2010-01—20
基金项目:
江苏省高技术研究计划资助项目（BF2009047）
作者简介:
邹文龙（1984一）,男,江苏苏州人,硕士研究生,主要从事拉曼光谱仪器方面的研究.
?
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构.目前,拉曼光谱在化学,生物医学,材料,环保等领域有着非常广泛的应用.在化工生产领域,拉曼检
测可以实时监控高分子聚合过程,Bauer等人利用拉曼光谱测定了苯乙烯单体在乳液聚合反应中的浓度
变化情况¨,Wenz等人用拉曼光谱分析技术来监测ABS塑料生产的接枝共聚过程【l2].在生物医学领
域,拉曼光谱可以对癌症进行早期诊断,Mahadevan-Jansen和Nicholas等人在利用拉曼光谱对脑癌,乳腺
癌,结肠癌,皮肤癌进行早期诊断的试验中取得了很好的效果_3].环境保护方面,拉曼检测可用于水质
分析,而且可以检测的物质范围非常广,现有的研究成果中包括氰化物,铁氰化物,硝酸盐和亚硝酸盐,硫
酸盐等各种无机物以及苯类,酚类,醛类,喹啉,吡啶,含氮芳香化合物等各种有机物的检测,可以用来获
取水环境的污染信息].随着激光技术和信号检测技术的发展,拉曼光谱技术在当代工农业生产和科学
研究中必将得到越来越广泛的应用.
在拉曼检测中,用激光照射样品时除了激发出拉曼散射光外同时还经常会激发出荧光.样品分子的
特征振动频率与激光频率相同并且荧光效率较高时,它就会吸收激发光子而发射出荧光6].另外样品不
纯（含有染料分子,生物分子等一些强荧光分子）也容易导致荧光的发射.通常情况下,荧光的强度远大
于拉曼光,使得拉曼信号完全淹没在荧光背景噪声中,导致得到的光谱数据难以正常利用.特别是当被
测样品中含有生物蛋白分子,有机染料分子的时候,荧光效应更加突出.因此,在拉曼光谱检测中对荧光
采取一定的抑制措施是十分必要的.
在过去的几十年内,各国学者提出并实现了多种荧光抑制方法和技术.这些方法利用了拉曼散射光
和荧光在诸多方面的特性差异,如偏振特性,时间/寿命特性,对激发波长的依赖性等.不仅有通过软件
算法实现消除荧光干扰的方法,而且也有通过改变拉曼光谱测试系统的硬件结构来实现荧光抑制的方
法.文中在以下章节中介绍其中一些典型方法的原理,并分析各自的特点和性能,然后对这些方法进行
比较和总结.
1荧光抑制方法及其原理
在拉曼光谱检测中,常用的荧光抑制方法主要有荧光淬灭剂法,光漂白法,红外/紫外激发法,偏振调
制法,移频激发法,高频调制法,门控法,数值处理法以及非线性效应法等,下面分别介绍它们的原理和
特点:
1.1荧光淬灭剂法
荧光淬灭剂法是最传统的一种方法,该方法需要向样品中添加一定的荧光淬灭剂,利用淬灭剂分子
与样品分子之间发生物理化学反应来降低样品分子的荧光发射强度,达到抑制荧光的目的.Friedman和
Hochstasser在检测荧光黄时发现,没有添加荧光淬灭剂（碘化钾）时观察不到拉曼峰,添加淬灭剂后可以
清楚地观察到拉曼特征谱].该方法成本低,操作简便,但是加入淬灭剂可能影响待测样品的拉曼谱,因
而应用范围受到较大的限制.
1.2光漂白法
光漂白法也是一种常用的方法,它需要用激光对样品预先照射一段时间,使荧光分子发生光化学变
化,从而降低荧光发射强度,然后再对感兴趣的分子结构进行拉曼检测.MacDonald和Wyeth等人采用
这种方法对红丹颜料进行检测时发现荧光背景噪声与预先照射的时间近似成指数衰减关系,光漂白后可
以清楚地观察到一些小的拉曼峰[8].Dennis等人对油墨进行检测时发现光漂白前得到的谱线中拉曼主
峰很弱,光漂白后荧光背景噪声明显下降,一些弱的拉曼峰也可以清楚观察到l_g].该方法不需要添加任
何设备,但是检测时间相对较长,长时间照射样品还有可能破坏感兴趣的样品的分子结构.
1.3红外/紫外光激发法
由于近红外波段的光子很少能被样品分子吸收,基态电子很难被激发,因此产生荧光的可能性较小.
但是由于拉曼散射光的强度与波长的四次方成反比,所以这种方法得到的拉曼散射强度很弱_1...为了增
加散射强度,Hirschfeld和Chase等人采用傅里叶变换拉曼光谱仪（1064nm激光激发）检测聚对二甲苯酰
粉末时几乎没有荧光背景噪声干扰,信噪比非常高,若采用532nm激光激发同样的样品则会有很强的荧
第5期邹文龙,等:
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光口.然而,傅里叶变换光谱仪扫描时间长,实时性相对较差,使其应用受到一定的限制.785nm激光也
能有效避免荧光的产生,且该波段CCD量子效率比较高,因而用785nm作为拉曼激发光源越来越受到研
究人员的青睐.
紫外光激发方法是用波长小于250nm的激光激发样品,由于荧光的斯托克斯位移比拉曼位移大得
多,因此即使有荧光物质存在,也可以充分区别荧光与拉曼光[].紫外激发方法的一个较大的局限性在
于紫外光能量太高,可能导致样品分解.
1.4偏振调制法
偏振调制法是基于拉曼光与荧光的偏振特性不同提出
的,荧光大多是非偏振光,而拉曼光是部分偏振光,采用偏振
斩波器,将光分成两路,一路进入单色仪作为输入信号,另外
一
路作为参考信号,利用锁定放大器进行检测,可以充分区
分开荧光与拉曼光,如图1所示.Arguello和Mendes等人
采用偏振调制方法成功检测出乙醇溶液中浓度为lnM/L的
罗丹明的拉曼谱[1引.该方法采用锁相放大器进行检测,检测
灵敏度高,但是较难实现多通道检测;另外并不是所有的荧
偏振斩波器
光都是非偏振光,因此应用范围也受到一定的限制.Fig1
1.5移频激发法
图1偏振调制原理框图
Schematicdiagramofpolarizationrr~ulation
移频激发法是基于拉曼光谱与荧光光谱对激发光波长的依赖程度不同而提出的.在一定的范围内,
荧光光谱几乎不会随着激发波长的变化而变化,相反拉曼光谱却会紧密跟随激发波长的变化而发生移
动.若采用两个波长相近的激光分别激发样品,得到两组散射谱,如图2所示;再利用差分方法,得到两
个散射谱的差值谱,如图3所示,则在该差值谱中荧光的光谱信号几乎被完全消除,而拉曼信号却能够保
留下来.Shreve等人利用该方法对掺杂高浓度染料的三氯甲烷溶液进行了检测,即使荧光强度是拉曼光
的1O.倍,拉曼谱仍然有很高的分辨力[1.Stellman和Bucholtz等人利用声光调制器实现双波长拉曼激
发,对含有100pM/L的荧光染料的乙醇溶液进行拉曼检测,比采用单个激光激发的荧光背景噪声显着下
降,拉曼特征谱线可以清楚辨认[1.McCain和Willett等人使用了8个波长的激光激发样品,十分成功
地抑制了荧光,并且得出激发光波长个数越多,抑制效果越好的结论[1引.移频激发法适用于各种样品,荧
光抑制的效果很好,但是需要更复杂的激发光源.Mosier-Boss等人提出了一种相对简单的方法,即先固
定拉曼光谱仪中的色散光栅,得到一幅拉曼光谱,然后将光栅转动一个微小的角度,再测得第二幅拉曼光
谱,然后将两个光谱相减,同样可以得到具有微分特征的差值谱_1.虽然在该实验中荧光谱与拉曼谱都
会发生移动,但是考虑到荧光的谱线相对较平缓,微小的移动对其影响不大,所以在差值谱中荧光谱信号
大部分被消除,而拉曼谱会保留下来.该方法不需要复杂的激发光源,得到的结果与前述频移激发法的
结果比较接近,有一定的荧光抑制作用.
图2两组散射谱线
Fig.2Twoscatteringspectrum
图3谱线A与B的差值谱线
Fig.3DifferencecurveofcurveAandB
1.6高频调制法
高频调制法是基于荧光和拉曼光对高频信号响应的快慢不同而提出的.拉曼散射光几乎在激发光
照射到样品的同时产生,因而可以进行很高频率的调制;而荧光是在激发光照射样品一段时间之后发出,
?
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并且激发光熄灭后还能够维持一段时间（纳秒量级）才逐渐衰减熄灭,因此荧光跟不上高频信号的调制.
Bright和Heiftje等人对激发光进行328MHz的高频调制,并把散射光和调制信号送入微波分析仪进行
选频放大,对浓度为10pM/L的罗丹明水溶液进行检测,拉曼光谱信噪比明显得到提高,并且得出调制频
率越高越容易区分拉曼光与荧光的结论m].由于更高频率的调制和检测技术难度较大,因此该方法适用
于荧光寿命较长的情况.
1.7门控法
门控法是基于拉曼光与荧光的寿命不同提出的.拉曼光的寿命一般为10～10s,而荧光寿命一
般在纳秒量级.原理如图4所示:
利用了一个时间很短的门开关（白色矩形）,只在门开关打开瞬问探测
拉曼光（灰色矩形）,由于荧光寿命相对很长,因此几乎所有的荧光强度都被挡在门开关之外（弧线）.
Yaney提出利用Nd:
YAG脉冲激光器和门控计数器的方案,对单晶氟化锶进行检测,几乎没有荧光干
扰,并且得出激光脉冲越窄,荧光抑制效果越好的结论m;Tahara等人则提出一种采用皮秒脉冲激光器
和扫描摄影机的方案,成功检测出苯中的微量罗丹明染料分子[2.Matousek等人提出使用皮秒级克尔
开关来抑制荧光的方法],克尔开关门宽度3ps,在克尔开关通光瞬问拉曼光完全通过,而由于荧光寿命
比较长,因此大部分荧光被阻挡,该方法对于液体样品的测量具有良好的效果.对含有乙腈与激光染料
DCM溶液检测,发现使用克尔开关后几乎没有荧光干扰,谱
线分辨力大幅提高.Martyshkin等人采用钛宝石皮秒激光
器和增强型CCD（专为超快门控设计,门宽200ps）的方案.
对芘/甲苯溶液进行检测,采用门控法后得到了高质量的拉
曼谱,一些很弱的倍频峰与和频峰也能分辨lI2.快速门控法
的适用范围很广,随着超快激光,探测器的进一步发展,信噪
比还有提升的空间,但是这类方法需要先进的设备支持,成
本颇高.
1.8数值处理法
图4门控法拉曼检测原理图
Fig.4Operationalprincipleoftime-gated
Ramandetection
数值拟合是常用的光谱数据处理方法,包括频域滤波,小波变换,曲线拟合等.频域滤波法是对拉曼
光谱测量数据进行傅里叶变换,然后在频域中设计合适的滤波器进行滤波处理的方法.由于荧光光谱与
拉曼光谱的谱线宽度不同,有着不同的傅里叶频谱特征,所以可以在频域中进行适当的滤波来区分拉曼
谱与荧光谱.Mosier—Boss等人利用快速傅里叶变换（FFT）和频域滤波方法对一种止痛药的拉曼光谱进
行处理],原始拉曼谱在小于1500cm一的谱线根本无法辨认,但是通过FFT和高通滤波后却可以清楚
地分辨出来,同时他们还采用了频域切趾算法来进一步提高信噪比.尽管频域滤波有一定的效果,但是
这种方法可能造成拉曼谱的人为扭曲.
当存在荧光干扰时,拉曼信号叠加在平缓的荧光谱上形成一些小的突出峰,利用小波分析的方法能
够检测出这种小突起.Cai等人对萘普生样品进行拉曼检测后利用小波变换进行处理得到了较好的结
果,一些被荧光背景噪声与随机噪声所淹没的弱拉曼峰可以分辨引.小波变换法快捷实用,但是选择不
同的小波多层分解方法和不同的阈值参数,得到的结果存在不一致的问题.
此外,由于荧光谱表现为较平缓的形状,因此可以采用曲线拟合的方法来逼近然后进行消除,得到剩
下的拉曼信号.这方面有许多学者提出了各种算法,如平方拟合,高斯拟合,高次多项式拟合,自校正拟
合甚至更复杂的算法设计[z4,z5J.曲线拟合法最大的优点是快捷与简便,而且能够很好地保持拉曼谱线的
轮廓,缺点是会引起谱线误差.虽然有些方法可以做到自校正,但是大部分数值方法只能使原本就较强
的拉曼峰变得更清晰,而原来微弱的拉曼峰没有很大的改观.
1.9非线性效应法
当激发光的功率很大时会在样品中产生一些非线性效应,如反转拉曼效应,反斯托克斯散射增强效
应,受激拉曼散射效应,拉曼感生克尔效应等.利用这些非线性效应可以大幅增大拉曼光强度,使得拉曼
光的强度比荧光更大,拉曼信号就容易探测了.但是非线性效应法的激发光功率很大,可能会对样品产
第5期邹文龙,等:
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生破坏作用.
2荧光抑制方法比较
综上所述,对于拉曼光谱测量中的荧光抑制问题人们提出了许多方法,这些方法各有特点,利用了拉
曼散射光与荧光的各种特性差异,具体性能比较如表1所示.可以根据软硬件配置情况将这些方法大致
分为三类:
（1）无需对拉曼光谱仪软硬件进行任何改变的方法:
如荧光淬灭剂法,光漂白法等;
（2）需要改
变拉曼光谱仪硬件结构的方法:
如移频激发法,门控法,非线性效应法等,这些方法均需要增加一定的硬
件设备,使整个拉曼光谱检测系统变得更复杂,成本相应也增加;（3）需要进行特殊软件处理的方法:
如频
域滤波法,小波变换法和曲线拟合法等,这些方法会引入一定的人为误差.
此外,也有学者提出采用两种或者两种以上的方法结合起来实现荧光抑制的思路,比如Matousek等
人提出克尔门控法与移频激发法结合,可以比克尔门控法或者移频激发法单独使用得到更高的信噪
比[2,PerkinElmer公司提出采用785nm激光,经过12min光漂白,然后采用自校正的曲线拟合滤除
荧光背景噪声,将红外激发法,光漂白法和数值法联合使用,发挥各自的优点.
表1几种主要的荧光抑制方法的比较
Tab.1Comparisonofseveralmajorfluorescencerejectionmethods
3结束语
总而言之,拉曼光谱应用范围越来越广泛,但是想要得到高质量的拉曼光谱信号,必须对荧光采取一
定的抑制措施.在生物,环保等应用领域荧光抑制技术已经成为拉曼光谱检测中的一项关键技术.对现
有的几种方法进行了归纳和分析,随着光电技术的不断进步,拉曼光谱检测中的荧光干扰问题必将得到
更好更方便的解决.
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