香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的阻碍.docx

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香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的阻碍

香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的阻碍

韦继南,吴小涛,陈晓刚,王斌

【摘要】目的：

观看香豆雌酚对大鼠成骨细胞（OBs）增殖分化的阻碍，初步探讨香豆雌酚对OBs的作用机制。

方式：

用不同浓度香豆雌酚干与OBs，依照不同时刻别离用酶消化法测碱性磷酸酶活性和羟脯氨酸含量、放免法测骨钙素含量及半定量RTPCR法检测OBs内OPG/RANKL基因的表达。

结果:

香豆雌酚呈浓度和时刻依托性增进大鼠OBs增殖及碱性磷酸酶表达;干与12h，各浓度组羟脯氨酸含量呈浓度依托性增高，其中10-8mol·L-1作用最大（P=；培育12h，OBs表达骨钙素呈浓度依托性，24h达顶峰，其中10-8mol·L-1有显著性不同（P=，48h有所下降；不同浓度、时刻组香豆雌酚均能促使OBs增加表达OPGmRNA，同时有抑制RANKLmRNA表达的作用，其在24h10-8mol·L-1浓度作用强度最大（P=，10-5mol·L-1那么呈现抑制作用。

结论:

香豆雌酚能增进OBs的增殖分化，其作用呈浓度和时刻依托性，且至少部份有OPG/RANKL途径的参与。

【关键词】香豆雌酚；成骨细胞；护骨素；骨质疏松；大鼠

雌激素在绝经后骨质疏松的发生进展中起着十分重要的作用，绝经后雌激素替代疗法（hormonereplacementtherapy,HRT）曾被以为是绝经后骨质疏松医治的金标准，但随着HRT所带来的阴道出血、乳腺癌、子宫内膜癌等风险大大限制了其临床推行应用[1]。

最近几年来植物雌激素（phytoestrogen,PE）备受关注，它们的结构类似于17β雌二醇，能预防和医治绝经后骨质疏松，但对子宫和乳腺无刺激作用[2]。

动物实验说明，PE香豆雌酚能减少去卵巢大鼠骨丢失和骨吸收，增加骨密度[3],有研究报导香豆雌酚能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化成熟及骨吸收活性[4]，但其具体机制尚不清楚，对成骨细胞的作用也未见报导。

为观看香豆雌酚对成骨细胞的直接作用，本实验拟用香豆雌酚干与体外培育的新生大鼠成骨细胞，观看其对成骨指标的阻碍，初步探讨其对骨代谢的作用及其机制。

　　1材料和方式

　　要紧材料新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供）,LGDMEM（GibcoBRL）,FBS（杭州四季青）,ALP染色试剂盒（南京建成生物研究所）,骨钙素试剂盒（北京科美东雅公司）,TRIzol（KataraLtd.）,RTPCRkit（MBILtd.）,Ⅰ型胶原酶、胰酶、MTT、DMSO、Coumestrol、Estradiol（Sigma,其余试剂均为国产分析纯。

　　细胞培育

新生大鼠颅骨成骨细胞培育参照文献[5]将新生<24h的SD大鼠放入75%酒精中浸泡5min,无菌掏出颅盖骨，清除血管结缔组织,PBS洗涤。

将颅盖骨剪成1mm3大小,％胰蛋白酶37℃消化30min,弃去消化液,加入5ml%Ⅰ型胶原酶消化60min,以200目筛网滤去骨渣，滤液1000r·min-1离心10min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM培育液并调整细胞密度，按1×105ml-1接种细胞于一次性无菌培育瓶中,置于37℃、5%CO2饱和湿度培育箱中培育。

成骨细胞鉴定

形态学观看细胞培育后每日用倒置相差显微镜观看细胞形态转变及生长状况，药物干与前行台盼蓝染色观看细胞存活率。

碱性磷酸酶染色（改良Kaplow法）细胞消化后将5mm×5mm大小无菌盖玻片置于培育瓶中，细胞贴壁后掏出盖玻片，按试剂盒说明书进行碱性磷酸酶染色。

　　观看指标

MTT细胞传代后按×104ml-1接种于96孔板，2d后改成无血清培育液，24h后别离换为含0mol·L-1，10-10~10-5mol·L-1香豆雌酚的培育液,并设阳性对照组Estradiol（10-8mol·L-1）,每种浓度重复７孔。

在加药后1二、24和48h别离掏出1块培育板,每孔加入20μlMTT（5mg·ml-1）37℃继续培育4h，弃培育液,每孔加入200μlDMSO，5min后在酶标仪上490nm波优势测各孔吸光度值,结果用A490nm表示。

碱性磷酸酶细胞接种于6孔板，分组同上，干与1二、24和48h后弃培育液，PBS清洗2次，每孔加入1ml％TritonX100，反复吹打后1000r·min-1离心3min，酶消化法测上清液中碱性磷酸酶的含量。

羟脯氨酸细胞接种于6孔板，分组同上，干与1二、24和48h后用酶消化法测上清液中羟脯氨酸的含量（委托南京建成生物研究所检测）。

骨钙素细胞接种于6孔板，分组同上，干与12和24h后去掉培育上清，PBS清洗2次，加入1ml％TritonX100，反复吹打后1000r·min-1离心3min，放免法测上清液中骨钙素的含量。

基因表达细胞接种于6孔板，分组同上，干与1二、24和48h后弃上清，PBS清洗3次，TRIzol提抽细胞内总RNA，取2μg总RNA逆转录扩增OPG、RANKL和βactin基因，引物序列及扩增条件见表1（引物由上海生工生物工程合成）。

PCR扩增产物于％琼脂糖进行凝胶电泳、EB染色和拍照，并用ImagemasterVDS成像系统行条带光密度分析。

表1各基因引物序列及扩增条件扩增基因

　　2结果

　　成骨细胞鉴定

成骨细胞活体观看倒置相差显微镜下可见成骨细胞呈三角形、多边形和椭圆形等不规那么形态,有较多突起，1～3个核仁（图1）。

台盼蓝拒染显示活细胞率大于92%。

培育10d的成骨细胞，形态不规那么，多呈三角形、多边形、椭圆形等，有较多突起

碱性磷酸酶染色光镜下可见绝大部份成骨细胞呈阳性,细胞染色深浅不一，呈棱形、多边形和椭圆形等，形状各异，大小不等，细胞核呈淡绿紫色，细胞浆中充满红棕色碱性磷酸酶阳性颗粒（图2）。

可见染色深浅不一，细胞核呈淡绿紫色，胞浆充满红棕色碱性磷酸酶颗香豆雌酚对成骨细胞增殖和分化的阻碍

香豆雌酚对大鼠成骨细胞增殖的阻碍MTT结果显示，干与12h各浓度组香豆雌酚能增进成骨细胞增殖，24h作用最强，48h后有所减弱。

其中10-9mol·L-1和10-8mol·L-1干与24h时产生显著的增进增殖作用（P=、，但10-5mol·L-1香豆雌酚对成骨细胞增殖产生抑制作用。

香豆雌酚对大鼠成骨细胞分化的阻碍

香豆雌酚对大鼠成骨细胞内碱性磷酸酶的阻碍培育1二、24和48h,各浓度香豆雌酚呈时刻和浓度依托性轻度增进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶表达，但无统计学意义。

香豆雌酚对大鼠成骨细胞分泌羟脯氨酸的阻碍培育12h,各浓度香豆雌酚呈浓度依托性增进羟脯氨酸分泌,10-8mol·L-1有显著增进作用（P=;培育24和48h后仅有轻度增进作用,无统计学意义（P=。

香豆雌酚对大鼠成骨细胞骨钙素的阻碍培育12h，各浓度组细胞内骨钙素含量轻度增加，但无统计学意义（P=；培育24h，10-8mol·L-1香豆雌酚显著增加成骨细胞内骨钙素表达，有统计学意义（P=；培育48h，各浓度组细胞内骨钙素含量轻度增加，高浓度（10-5mol·L-1）组显现抑制作用。

香豆雌酚对大鼠成骨细胞OPG基因表达的阻碍RTPCR分析说明，香豆雌酚呈浓度和时刻依托性增进成骨细胞OPG/RANKL基因表达，10-8mol·L-1干与24h显著增加OPGmRNA表达（P=，抑制RANKL基因表达（P=，OPG/RANKL显著升高；高浓度（10-5mol·L-1）香豆雌酚对OPG基因表达有抑制作用（P<

　　3讨论

　　PE分为异黄酮类（isoflavones）、木酚素类（lignans）和香豆素类（coumestans）。

香豆雌酚是香豆素类的一种，普遍存在于三叶草和卷心菜中。

流行病学资料说明，食用富含PE食物的亚洲人，乳腺癌、前列腺癌及骨质疏松症等疾病的发病率较白种人低[6]；Dodge等发觉香豆雌酚能有效地减缓切除卵巢大鼠的骨质减少，能使大鼠骨质密度恢复到与未切除卵巢大鼠相近的水平[7]；在器官培育中，香豆雌酚具有雌激素效能，可增加鸡胚股骨培育中钙含量[8]，有人研究发觉香豆雌酚类似物KCA098能增进成骨细胞的分化，提高碱性磷酸酶活性，增加钙磷含量[9]，但是，其对成骨细胞作用的机制仍然未明。

本实验中MTT结果说明，各浓度香豆雌酚对成骨细胞的增殖在培育1二、24和48h都有必然增进作用，其中又以10-8和10-9mol·L-1作用24h时最强，而高浓度（10-5mol·L-1）香豆雌酚反而显现了抑制作用（图3），由此可见高浓度香豆雌酚可能抑制细胞增殖。

另外，咱们从成骨细胞分化的指标碱性磷酸酶、骨钙素及羟脯氨酸来讲明香豆雌酚对成骨细胞分化的阻碍。

碱性磷酸酶、骨钙素别离是成骨细胞初期和晚期分化的指标。

本实验中各浓度香豆雌酚干与成骨细胞1二、24和48h均轻度增加碱性磷酸酶表达，但无统计学意义（P=0061）；10-8mol·L-1香豆雌酚作用24h能显著增加成骨细胞内骨钙素表达，有统计学意义（P=。

该结果提示香豆雌酚可能阻碍成骨细胞分化的晚期时期。

羟脯氨酸在Ⅰ型胶原中占有恒定的比例，本实验中咱们通过检测羟脯氨酸含量反映Ⅰ型胶原的表达情形。

结果说明，各浓度香豆雌酚干与12h，各组培育液上清羟脯氨酸含量呈浓度依托性增高,10-8mol·L-1显著增高，具有统计学意义（P=；干与24和48h，培育液上清羟脯氨酸含量仅轻度增高，无统计学意义。

最近几年来的分子生物学研究发觉，雌激素的作用还与成骨细胞和破骨细胞的分子间对话机制（crosstalk）有关[10]。

破骨细胞膜上存在一种跨膜蛋白RANK（receptoractivatorofnuclearfactorκβ），而成骨细胞膜上存在一种RANK的配体RANKL（receptoractivatorofnuclearfactorκβligand），它也是一种跨膜蛋白。

雌激素缺乏使得RANKL与RANK结合，就会产生RANKL/RANK/NFκβ信号级联反映，促使破骨细胞活化[11]。

另一方面，成骨细胞还能自分泌一种被称为骨爱惜素的蛋白质，它作用的靶分子确实是自身细胞膜上的RANKL，因此也被称为伪受体（decoyreceptor）[12]。

雌激素能增进骨髓基质细胞、成骨细胞OPGmRNA的表达，当OPG与RANKL结合后，即阻断RANKL与破骨细胞膜上的RANK结合，从而终止成骨细胞与破骨细胞之间的对话，使破骨细胞内NFκβ的信号下传中断，抑制破骨细胞的活化和溶骨进程。

本实验中RTPCR分析说明，各浓度香豆雌酚对成骨细胞OPG/RANKL基因表达呈浓度和时刻依托性，10-8mol·L-1干与24h能显著增加成骨细胞OPG基因表达（P=，与对照组17βEstradiol相当，同时显著抑制RANKL的表达（P=;OPG/RANKL显著升高。

低浓度（10-10~10-8mol·L-1）香豆雌酚对RANKL基因表达作用不大。

Bord等报导雌激素可有效刺激人成骨细胞OPG/RANKLmRNA和蛋白表达,且呈浓度和时刻依托关系[13]。

综上所述，本实验结果初步说明，PE香豆雌酚能增进成骨细胞增殖分化，其作用至少是部份通过OPG/RANKL途径而发挥的。

但是，目前对香豆雌酚的研究甚少，对其作用的机理研究尚缺乏充分的实验依据，这也是咱们尔后尽力的方向。

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