透射电子显微镜技术.docx

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透射电子显微镜技术

透射电子显微镜技术

作者：

电子显微镜组陶忠芬

　　电子显微镜是20世纪30年代以来发展起来的，用于亚显微组织结构研究的一种电子光学仪器的总称，包括透射电镜、扫描电镜、高压电镜、分析电镜等。

现在的电镜不仅能观察样品的二维平面结构，还可得到三维结构的信息；不仅能观察样品的形态结构，还可同时对样品的化学元素成分进行定性定量分析。

　　透射电镜（TransmissionElectronMicroscope，简称TEM）是应用最广泛的一种电子显微镜，主要利用透射电子成像，因而要求样品较薄（样品厚度不超过100nm）。

新型的透射电镜分辨率已达到0.07nm，性能不断提高。

在生物医学方面，透射电镜主要用于观察组织细胞内部的超微结构。

现对透射电镜的基本结构、成像原理、透射电镜样品制备及在临床诊断中的应用作简要介绍。

一、透射电镜的基本结构

　　透射电镜主要由电子光学系统（镜筒）、真空系统、电器系统三大主要部分组成。

下面是透射电镜的电子光学系统示意图：

（一）电子光学系统

1.照明系统

　　照明系统位于电子光学系统的顶部，主要有电子枪、聚光镜及相应的平移对中、倾斜调节装置组成。

　　电子枪是电镜的电子源，即电子发射。

常采用的是热电子发射。

阴极采用钨丝，形状是“V”字型的，叫“发叉式”阴极。

除发射电子的阴极外，还需有加速电极（即阳极）和控制电极（即栅极）来共同组成产生电子束的装置，这种装置叫做电子枪。

　　聚光镜由电磁透镜、光阑、消像散器组成。

是用来会聚电子枪发射的电子束，调节照明强度、孔径角和束斑大小。

2、成像系统

　　成像系统是电镜最核心的部件之一，高放大倍数、高分辨率就是通过成像系统获得的，主要由样品室、物镜、中间镜、投影镜、物镜光阑及相应的平移对中、消像散装置等组成。

　　样品室用于安放载有样品的铜网，配有气锁装置，便于换样时仍保证镜筒的高真空状态。

　　物镜是电镜中最为核心的部件，它的性能对分辨率影响极大。

3、观察记录系统

　　观察记录系统位于电子光学系统的底部，从观察室到照相机构。

4、电磁偏转及消像散系统

　　合轴与消像散：

从电子枪到各透镜、直到荧光屏、各光学部件的轴彼此重合在同一轴线上。

通过改变X或Y线圈的电流方向和大小，以改变透镜的磁场强度，使电子束移动或恢复磁场轴对称。

主要调节照明系统和成像系统。

　　照明系统:

电子枪对中、聚光镜合轴与消像散

　　成像系统:

物镜和中间镜消像散、投影镜合轴

（二）真空系统

　　真空系统由机械泵、油扩散泵、离子泵、真空管道、阀门、真空度测量仪等组成。

（三）电器系统

　　高压发生器：

为发射电子提供加速能量

　　灯丝加热电源：

电镜的光源

　　透镜稳流电路：

提供稳定电流

　　安全自控电路：

保护装置

　　计算机控制电路：

调试电镜、测量数据

二、透射电镜的成像原理

　　电子枪产生电子束，经聚光镜会聚后打在样品上。

当入射电子束穿过样品时，与样品中的原子发生相互作用，产生弹性散射和非弹性散射等一系列的电子，使穿过样品的电子束密度发生改变，从而使电子束带有了样品的信息，再经成像系统的放大，投射到观察荧光屏上或底片上，形成高分辨、高清晰度的图像。

　　由于电子束的波长相同，所以电镜的图像是一副黑白的图像。

三、透射电镜样品制备

　　生物标本常用的是超薄切片技术，其要求：

超微结构保存良好，切片厚度500-700Å，厚度均匀、无皱褶、刀痕、颤痕、污染等，有一定的硬度和韧性，耐受电子束的强烈照射，反差好。

（一）取材

　　动物要活体取材，用锋利的剪刀剪下一小块组织，迅速置于滴有固定液的蜡板上，双面刀片修块1mm3，入瓶固定。

定向包埋组织修成长条状1x1x2mm3，如：

皮肤、肌肉等。

空腔性组织：

气管、肠道、血管等，需先剖开冲洗、再固定。

肺组织需抽气或纱布条包裹浸没。

　　取材要求:

快、小、冷、准、狠。

（二）固定与清洗

　　2.5%戊二醛4℃固定2～4h，磷酸盐缓冲液充分清洗，1%锇酸4℃固定≤2h，再漂洗。

（三）脱水与块染

　　丙酮梯度脱水，5-10分钟/次，70%丙酮配制饱和醋酸铀块染，4℃染3～5h或过夜。

（四）浸透与包埋

　　丙酮和环氧树脂1:

12h，纯包埋剂（不加加速剂）2h，包埋剂（加加速剂）浸透2-3h。

　　包埋：

号码放模板尾部→注包埋剂→放组织块→40℃过夜→次日60℃聚合48h→硬化后归档

（五）超薄切片与电子染色

　　1、制膜：

Formvar膜、火棉胶膜、碳膜

　　2、修块：

暴露组织

　　3、制刀：

玻璃刀、钻石刀

　　4、半薄切片：

1-2um，美蓝-天青染色

　　5、定位：

镜下选目标

　　6、切片、捞片：

500-700Å（金黄色）

　　7、电子染色：

醋酸铀、铅

（六）镜下观察

　　针对不同的样品，电镜下能观察到亚细胞的形态结构，从细胞膜、细胞质、各种细胞器到生物大分子结构。

根据形态结构的病理变化揭示其发病机理、功能变化。

　　电镜操作中常见的问题：

电子光学的放大倍数、样品污染、样品漂移、样品热辐射损伤。

四、透射电镜在临床诊断中的应用

　　有些光镜无法确诊的疾病电镜可以辅助诊断、分型，如肾病、肌病、、肝病、肿瘤等。