透射电子显微镜技术.docx

1、透射电子显微镜技术透射电子显微镜技术作者：电子显微镜组 陶忠芬电子显微镜是20世纪30年代以来发展起来的，用于亚显微组织结构研究的一种电子光学仪器的总称，包括透射电镜、扫描电镜、高压电镜、分析电镜等。现在的电镜不仅能观察样品的二维平面结构，还可得到三维结构的信息；不仅能观察样品的形态结构，还可同时对样品的化学元素成分进行定性定量分析。透射电镜（Transmission Electron Microscope， 简称TEM）是应用最广泛的一种电子显微镜，主要利用透射电子成像，因而要求样品较薄（样品厚度不超过100nm）。新型的透射电镜分辨率已达到0.07nm，性能不断提高。在生物医学方面，透射电

2、镜主要用于观察组织细胞内部的超微结构。现对透射电镜的基本结构、成像原理、透射电镜样品制备及在临床诊断中的应用作简要介绍。一、透射电镜的基本结构透射电镜主要由电子光学系统(镜筒)、真空系统、电器系统三大主要部分组成。下面是透射电镜的电子光学系统示意图：（一）电子光学系统1.照明系统照明系统位于电子光学系统的顶部，主要有电子枪、聚光镜及相应的平移对中、倾斜调节装置组成。电子枪是电镜的电子源，即电子发射。常采用的是热电子发射。阴极采用钨丝，形状是“V”字型的，叫“发叉式”阴极。除发射电子的阴极外，还需有加速电极(即阳极)和控制电极(即栅极)来共同组成产生电子束的装置，这种装置叫做电子枪。聚光镜由电磁

3、透镜、光阑、消像散器组成。是用来会聚电子枪发射的电子束，调节照明强度、孔径角和束斑大小。2、成像系统成像系统是电镜最核心的部件之一，高放大倍数、高分辨率就是通过成像系统获得的，主要由样品室、物镜、中间镜、投影镜、物镜光阑及相应的平移对中、消像散装置等组成。样品室用于安放载有样品的铜网，配有气锁装置，便于换样时仍保证镜筒的高真空状态。物镜是电镜中最为核心的部件，它的性能对分辨率影响极大。3、观察记录系统观察记录系统位于电子光学系统的底部，从观察室到照相机构。4、电磁偏转及消像散系统合轴与消像散：从电子枪到各透镜、直到荧光屏、各光学部件的轴彼此重合在同一轴线上。通过改变X或Y线圈的电流方向和大小，

4、以改变透镜的磁场强度，使电子束移动或恢复磁场轴对称。主要调节照明系统和成像系统。照明系统:电子枪对中、聚光镜合轴与消像散成像系统:物镜和中间镜消像散、投影镜合轴（二）真空系统真空系统由机械泵、油扩散泵、离子泵、真空管道、阀门、真空度测量仪等组成。（三）电器系统高压发生器：为发射电子提供加速能量灯丝加热电源：电镜的光源透镜稳流电路：提供稳定电流安全自控电路：保护装置计算机控制电路：调试电镜、测量数据二、透射电镜的成像原理电子枪产生电子束，经聚光镜会聚后打在样品上。当入射电子束穿过样品时，与样品中的原子发生相互作用，产生弹性散射和非弹性散射等一系列的电子，使穿过样品的电子束密度发生改变，从而使电子

5、束带有了样品的信息，再经成像系统的放大，投射到观察荧光屏上或底片上，形成高分辨、高清晰度的图像。由于电子束的波长相同，所以电镜的图像是一副黑白的图像。三、透射电镜样品制备生物标本常用的是超薄切片技术，其要求：超微结构保存良好，切片厚度500-700，厚度均匀、无皱褶、刀痕、颤痕、污染等，有一定的硬度和韧性，耐受电子束的强烈照射，反差好。（一）取材动物要活体取材，用锋利的剪刀剪下一小块组织，迅速置于滴有固定液的蜡板上，双面刀片修块1mm3，入瓶固定。定向包埋组织修成长条状1x1x2mm3，如：皮肤、肌肉等。空腔性组织：气管、肠道、血管等，需先剖开冲洗、再固定。肺组织需抽气或纱布条包裹浸没。取材要

6、求:快、小、冷、准、狠。（二）固定与清洗2.5%戊二醛4固定24h，磷酸盐缓冲液充分清洗，1%锇酸4固定2h，再漂洗。（三）脱水与块染丙酮梯度脱水，5-10分钟/次，70%丙酮配制饱和醋酸铀块染，4染35h或过夜。（四）浸透与包埋丙酮和环氧树脂1:1 2h，纯包埋剂(不加加速剂)2h，包埋剂(加加速剂)浸透2-3h。包埋：号码放模板尾部注包埋剂放组织块40过夜次日60聚合48h硬化后归档（五）超薄切片与电子染色1、制膜：Formvar膜、火棉胶膜、碳膜2、修块：暴露组织3、制刀：玻璃刀、钻石刀4、半薄切片：1-2um，美蓝-天青染色5、定位：镜下选目标6、切片、捞片：500-700（金黄色）7、电子染色：醋酸铀、铅（六）镜下观察针对不同的样品，电镜下能观察到亚细胞的形态结构，从细胞膜、细胞质、各种细胞器到生物大分子结构。根据形态结构的病理变化揭示其发病机理、功能变化。电镜操作中常见的问题：电子光学的放大倍数、样品污染、样品漂移、样品热辐射损伤。四、透射电镜在临床诊断中的应用有些光镜无法确诊的疾病电镜可以辅助诊断、分型，如肾病、肌病、肝病、肿瘤等。