植物组织培养母液的配制与保存.docx
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植物组织培养母液的配制与保存
植物组织培养母液的配制与保存
植物组织培养母液的配制与保存
目的
熟练掌握植物组织培养中各种成分或成分组的母液（比需要量大若干倍）的配制方法。
实验仪器
电子天平（感量为O.OOOIg）、一般天平（感量为0.1g）、烧杯100mL50mL25mL）、量筒（1000mL100mL50mL）、容量瓶200mL100mL50mL25mL）、细口瓶（500mL200mL100mL50mL）、药勺、玻棒、电炉等。
实验试剂
按培养基配方准备
实验原理
一）培养基的组成
培养基是植物组织培养中的血液”,血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。
自然状态下生长的绿色植物由于自身能进行光合作用，并且能合成植物生长发育所需的几乎所有有机成分，加上土壤中含有较全面的无机和有机营养成分，所以只需在适当的时候施加少量的无机和有机肥（复合成分），植物就可良好的生长。
目前所使用的培养基有10余种之多，大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的。
例如，White培养基是Uspenski和Uspenskaia（1925）的藻类培养基演化的结果，被广泛用于根的培养；Cautheret培养基是建立在Knop营养液（1865）基础上的。
以后的培养基大部分是在White和Cautheret培养基的基础上改进而成。
就目前所使用的各种培养基而言，可将它们的成分划分为几大类，常用的有MS、B5、和White
1.水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。
配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确
性，防止储藏过程发霉变质。
大规模生产时可用自来水。
但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
2.无机营养成分：
大量元素，主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六
种
微量元素：
培养基的微量元素主要包括铁（Fe）、锰（Mn）、铜（Cu）、锌（Zn）、氯（CI）、硼（B）和钼（Mo）等。
这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节。
3.有机营养成分（包括维生素，氨基酸及其它有机物质等）
维生素：
硫氨素（维生素B1）盐酸吡哆醇（维生素B6）和烟酸在部分培养基中还添加维生素BX（氨酰苯甲酸）、维生素C（抗坏血酸）、维生素E（生育酚）、维生素H（生物素）、维生素B12（氰钻胺酸）、维生素BC（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙和氯化胆碱等维生素。
氨基酸：
甘氨酸（氨基乙酸）和肌醇（环己六醇）也是一些培养基的添加成分。
其他：
在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁和酵母浸出物等。
这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用，如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参
与由Ca介导的信号转导
4.碳水化合物所有的植物组织培养基都需要有碳水化合物作为能源，用作碳源的碳水化合物通常为蔗糖或D-葡萄糖，用量通常为2%-4%，高者可达5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般应增加用量，而且最好用比较固定的厂家生产的产品，以保证实验的稳定性。
5.植物生长调节物质（常称为激素）：
生长素类有：
NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸），P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸），2,4，5-T（2,4，5-三氯苯氧乙酸）等；细胞分裂素类主要有：
从甜玉米未成熟种子或其他植物中分离到的玉米素［6-（4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基）嘌吟］。
人工合成的细胞分裂素主要有激动素（KT,6-呋喃氨基嘌吟）、6-
苄基腺嘌吟（6-BA）、2IP（异戊烯氨基嘌吟）和TDZ（thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。
细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成；赤霉素：
主要是GA3，虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的；乙烯等。
6.琼脂或其他支持物
除液体悬浮培养外，就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物。
一般浓度0.4%-1%，质量越差的琼脂用量越大。
7.其他添加剂（含天然提取物、抗生素等）活性炭渗透调节剂抗生素抗氧化剂等
二）培养基的选择
选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。
选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑：
一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。
MS培养基适合于大多数双子叶植物，B5和N6培养基适合与许多单子叶植物，特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效，White培养基适合于根的培养。
实验内容与步骤
一）MS大量元素母液的配制
一般将大量元素分别配制成10倍的母液，使
用时再分别稀释10倍
依次分别称取:
NH4NO3
KN03
16.5g
19.0g
KH2PO4
1.70g
MgS047H2O
3.7g
CaCI22H2O
4.4g
共配成1L的母液。
倒入1L试剂瓶中，存放于
冰箱中。
二）MS微量兀素母液的配制
般将微量兀素配制成100倍母液。
依次称
取：
KI
0.083g
Na2MoO42H2O0.025g
H3BO3
0.62g
CuSO4-5H2O
0.0025g
MnSO4H2O
1.69g
CoCI26H2O
0.0025g
ZnSO4-7H2O
0.86g
配成1L母液，
倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱
中。
CuS04・5H2O和CoCI26H2O由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配
成调整液。
分别称取
CuSO4-5H2O0.05gCoCI26H2
O0.05g
各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有
0.0025g的量。
三）MS有机质母液的配制
一般配制成100倍MS有机母液。
依次称取
肌醇10g盐酸硫胺素（VB1）0.01g
烟酸0.05g甘氨酸0.2g
盐酸吡哆醇（VB6）0.05g
配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
四）MS铁盐母液的配制
一般配制成100倍MS铁盐母液。
依次称
取：
EDTA二钠3.73g和FeSO47H2O2.78g,配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，
共8种母液。
五）几种生长调节物质的配制
各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒
精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。
一般取100mg配成100ml母液。
母液的保存：
一般将以上配制好的各种母液保存在4C左右冰箱内。
注意事项
1.称量要精确
2.配制母液时要注意药品溶解的先后顺序，以免发生化学反应，使的产生沉淀。
附：
MS培养基母液的配制与保存
仪器与用具
1、仪器：
各类天平、磁力搅拌器、冰箱等。
2、用具：
烧杯、容量瓶、量筒、试剂瓶、标签等。
3、试剂:
95%酒精，0.1-1NaOH，0.1-1NHCI，配制MS培养基所需的各种无机物、有机物，蒸馏水。
方法步骤
（一）母液的配制
母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10—100倍的溶液。
优点：
（1）保证各物质成分的准确性。
（2）便于配置时快速移取。
（3）便于低温保藏。
1、MS大量元素母液（10X）
称10升量溶解在1升蒸馏水中。
配1升培养基
取母液100ml。
化学药品
1升量
10升量
①
NH4NO3
1650mg/L
16.5g
②
KNO3
1900mg/L
19.0g
③
CaCl2・2H2O
440mg/L
4.4g
④
MgSO47H2O
370mg/L
3.7g
⑤
KH2PO4
仃0mg/L
1.7g
2、MS微量元素母液（100X）
称10升量溶解在100ml蒸馏水中。
配1升培养基取母液10mlo
化学药品
1升量
10升量
①
MnSO44H2O
（MnSO4H2O）
22.3mg/L
（21.4
mg/L）
223mg
②
ZnSO4・7H2O
8.6mg/L
86mg
③
CoCl2・6H2O
0.025mg/L
0.25mg
④
CuSO45H2O
0.025mg/L
0.25mg
⑤
Na2MoO42H2O
0.25mg/L
2.5mg
⑥
KI
0.83mg/L
8.3mg
⑦
H3BO3
6.2mg/L
62mg
注意：
CoCI2・6H2O和CuSO45H2O可按10倍量（0.25mgX10=2.5mg）或100倍量（25mg）称取后，定容于100ml水中，每次取10ml或1ml,
（即含0.25mg的量），加入到母液中。
3、MS铁盐母液（100X）
称10升量溶解在100ml蒸馏水中。
配1升培养基取母液10mlo
化学药品
1升量
10升量
Na2EDTA
37.3mg/L
373mg
FeSO4・7H2O
27.8mg/L
278mg
注意配制时，应将两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热。
混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。
4、MS有机物母液（100X）
称10升量溶解在100ml蒸馏水中。
配1升培养基取母液10ml。
化学药品
1升量
10升量
①
烟酸
0.5mg/L
5mg
②
盐酸吡哆素
（VB6）
0.5mg/L
5mg
③
盐酸硫胺素
（VB1）
④
肌醇
100mg/L
1g
⑤
甘氨酸
2mg/L
20mg
5、生长调节剂
单独配制，浓度为1-5mg/ml（书中为0.5
-1mg/ml）,一般配成4mg/ml。
配制培养基母液时注意事项：
1一些离子易发生沉淀，可先用少量蒸馏水溶
解，在按配方顺序依次混合；
2配制母液时必须用蒸馏水或重蒸馏水；
3药品应用化学纯或分析纯；
4溶解生长素时，可用少量0.5-N的NaOH或95%酒精溶解，溶解分裂素类用0.5-N的HCl加热溶解。
（二）母液的保存
1、装瓶：
将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩倍数、日期。
注意将易分解、氧化的溶液，放入棕色瓶中保存。
2、贮藏：
4C冰箱。
附：
组织培养室操作程序
-.生产环境
1.工作人员进入组培室必须穿工作服，包括更换
拖鞋、穿白大褂，接种人员还要带帽、带口罩。
2.所有人员在组培室内不准高声喧哗、打闹3工作期间，各生产房间要关闭房门，尤其是接种间；工作人员出入要随手关门。
4各种生产用品要安固定的位置排放整齐，不可乱拿乱放。
5工作过程中所产生的垃圾要及时清理，尤其是接种间，其内垃圾停留时间不得超过4小时。
二.接种程序
1.准备工作：
接种人员在正式接种之前要做好准备工作，包括准备酒精灯、新洁尔灭、灭菌用脱脂棉以及准备接种工具、分取培养基、接种用苗和工作台灭菌等。
•酒精灯用工业酒精作燃料，而非75%酒精。
-工作台上用的新洁尔灭浓度是
0.1%，而非0.01%。
•工作台灭菌包括两步：
一是上台前用紫外灯照射30分钟，二是正式接种前再用新洁尔灭仔细擦一遍。
•培养皿的取放：
从布包里取培养皿时，一定要注意，手不能接触培养皿的边沿，同时要尽可能减少与培养皿的接触面，一般规定只能用双手的拇指和食指取放。
•接种工具灭菌也分两步，一是用灭菌布包裹好，在高压锅里灭一次，这一步由灭菌人员负责完成；二是在工作台上，从布包里取出后，先用酒精擦拭一下，再放在酒精灯火焰上灼烤一遍，其要求是工具的每一点在火焰上灼烤时间不得少于5秒钟。
在工具灭菌之前，工作人员的手部，包括手腕，都要用酒精仔细擦拭一遍。
2接（转）苗：
包括取苗、切苗和接苗三
•取苗：
先解开培养瓶的瓶盖（封口膜），如果不能一次取出其内的全部材料，要先把
封口膜（瓶盖）口对者风源放在酒精灯的左前方，然后把瓶口在酒精灯上烤7〜10秒；正式取苗时，瓶口不要斜向外；一次取苗不可太多，以免风干。
•切苗：
培养皿放在离风窗10〜20厘米处，不可太往外；镊子和手术刀都不可太热，最好是凉的，且在操作过程中，刀和镊都要培养皿斜上方操作，不可在其正上方操作；在切苗过程中产生的垃圾可堆放在培养皿内的一侧位置上，若非迫不得已，不可弄到培养皿外。
•接苗：
培养瓶盖（或封口膜）的放置方法和及瓶口灼烤方法与取苗时的相同，烤完瓶口后，要先倒掉瓶内多余的水分，然后在接苗；接苗时，镊子最好不要与瓶口接触，一瓶内一般接5〜6棵苗，不要放得太多；组培苗在瓶内要排放均匀、整齐、美观。
•封口、记录：
封口膜要及时捆绑，其松紧度以用手转不动为准；下台前要把品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期标示到瓶上。
离开之前还要把工作台收拾干净，把接种过程中产生的垃圾清理掉，台上的物品也要摆放整齐。
三组培苗的管理
1.瓶苗要整齐的摆放在自己的组培架上，不可乱放。
2.接种人员每天都要统计自己的接种数量，包括转前瓶数和转后瓶数。
3•值日人员要定时开灯、关灯，保证组培苗有足够的光照时间，但也不可过长，以每天14小时左右为宜。
四•接种用具的清洗
1.洗刷培养瓶、培养皿：
第一步：
把培养瓶培养皿放入洗洁净溶液里，先用毛刷清洗内部，再用钢丝球把外面的字清洗掉。
第二步：
把他们再用清水冲洗3-5遍。
第三步:
把瓶内的积水倒掉，倒放在准备台，准备台上要先放一层纱布。
这一步的清洁标准是：
凉干的瓶壁（器皿）内外无明显的斑点、污
2.洗涮镊子：
用洗洁精浸泡五分钟，用钢丝球打磨一下然后放入清水冲洗三遍。
五•灭菌
1.对污染苗灭菌：
一经发现就随即灭菌处理，大量的进行高压灭菌，少量的加入工业酒精在室外进行处理。
2.室内空气灭菌：
每四周用高锰酸钾和甲醛对室内空气灭一次菌。
3.室内地面：
每2—3天用新洁尔灭拖一遍地。
4.卧式和手提式高压灭菌锅使用程序：
严格按使用说明书操作。
简单讲就是培养基配制-培养基灭菌-接种-培养-出苗•
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