CB945500组织干细胞识别谱系重编程和示踪研究.docx
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CB945500组织干细胞识别谱系重编程和示踪研究
2010CB945500-组织干细胞识别、谱系重编程和示踪研究
项目名称：
首席科学家：
起止年限：
依托部门：
一、研究内容围绕本申请项目拟解决的关键科学问题：
1）如何识别不同组织干细胞分化启动关键因子，实现细胞分化命运的操控和谱系重编程；2）如何示踪干细胞在不同组织器官移植后的去向和功能，追踪干细胞在体内的命运转化，整个项目将围绕识别和示踪这两个核心问题，从分子、细胞和整体三个层面进行深入系统的整合性研究。
主要研究内容如下：
1.用模式生物小鼠和小鼠基因修饰技术，对分裂细胞、各种信号通路、细胞表面分子进行遗传标记，并建立细胞谱系标记技术，跟踪组织干细胞分化过程，阐明组织干细胞的分化网络。
分离特定阶段标记细胞进行基因和蛋白质的分析，筛选分化启动的关键因子、鉴定特定组织干细胞的分子指纹图谱、寻找组织干细胞发育分化特定阶段的谱系标志物。
2.研究细胞外基质成分对肝干细胞分化的调控作用，建立部分肝脏切除动物模型、肝细胞凋亡模型以及嵌合肝小鼠模型，分析由肝脏干细胞介导的肝再生的机制；尝试探索通过表观遗传学调控直接进行肝脏细胞谱系重编程为胰腺细胞的方法。
3.针对发育中各种组织干细胞的全基因组表达分析、DNA甲基化及组蛋白乙酰化等分析，揭示不同类型先驱细胞专一性表达的转录因子群体，鉴定到数个在决定分化和转变细胞谱系中起关键作用的主调控基因，阐明其中的表观遗传调控机制。
4.基于干细胞用于临床治疗应用的安全性及有效性，研究四个问题：
1.移植后的干细胞在哪里？
2.移植的干细胞是否能在体内存活？
3.移植的干细胞是否能和宿主整合发挥生理功能？
4.局部注射和静脉系统给予等不同的移植途径对干细胞组织功能重建有什么影响？
具体内容包括：
探索干细胞体外标记的新方法，研究不同移植途径对干细胞标记示踪的影响，核磁共振影像学结合波谱技术检测脑神经干细胞的研究，活体示踪移植干细胞功能；伦理法规政策允许下，选择符合研究标准的患者入选本研究进行功能恢复评价和安全性评价；开展推广用于其它组织干细胞的示踪研究，初步探索其它组织干细胞的示踪技术体系。
上述主要研究内容仅仅围绕关键科学问题，重点集中在组织干细胞发育分化的关键因子识别、细胞谱系示踪的特异性标志物、以及示踪技术的灵敏性、无创性和技术的扩展应用上。
二、预期目标总体目标：
针对国家健康领域对干细胞治疗的重大需求，以组织干细胞识别和示踪两个核心问题为切入点，从分子、细胞和整体三个层面进行整合性研究，鉴定出特定组织干细胞分化启动关键因子以及细胞谱系特异标志物；通过核磁共振影像和波谱开创新颖的干细胞标记和功能示踪技术，建立促进再生修复、功能重建的移植技术和无创性示踪干细胞迁徙和功能的分子影像平台，获得一批有自主知识产权的重要成果，为干细胞移植及再生医学的应用奠定基础，使我国的干细胞治疗应用研究整体达到国际先进或领先水平，成为国际上该领域的领军研究力量之一。
1.建立示踪干细胞发育分化的模式动物平台，建立不同胚层中具代表性的组织干细胞向前体细胞和功能细胞诱导分化模型，结合生物芯片、基因诱捕技术、生物信息学等相关技术手段，鉴定3～5个组织干细胞分子指纹图谱、阐明3～5个组织干细胞的分化调控网络、筛选出3～5个组织干细胞分化调控的关键因子、获得3～5个组织干细胞在每个特定分化阶段的细胞谱系特异标志物。
2.通过核磁共振影像和波谱开创新颖的干细胞标记和功能示踪技术，建立促进再生修复、功能重建和无创性示踪干细胞迁徙和功能的分子影像平台，获得干细胞标记和功能示踪技术灵敏性、功能恢复评价和安全性评价三方面的具体技术参数。
3.在学术刊物上发表50～100篇研究论文，获得一批有自主知识产权的重要成果，申请专利6～10项。
培养博士后6～12人，博士研究生20～40人。
培养5～10名从事临床和基础研究相结合的优秀人才。
三、研究方案本项目围绕国家重大需求的关键科学问题，从不同胚层中选取具代表性的组织干细胞为研究对象，从分子、细胞和整体三个层面开展系统的研究，采用转基因、分子生物学、细胞生物学，结合高通量基因组、蛋白质组及表观遗传组学和生物信息学分析技术，运用体内分化与体外分化研究、基础与临床研究相结合的技术路径，力图通过对不同组织干细胞谱系分化网络路径的认识寻找到干细胞发育和分化的关键节点，从而发现启动干细胞分化的关键因子，以实现对干细胞分化命运的操控，通过细胞谱系重编程策略将成体细胞转变成新的功能细胞以供修复患病的和受损伤的功能组织。
观察干细胞移植后在人体内的分布以及疾病时的变化，追踪干细胞移植于人体内后的运动情况和细胞命运转化，在体内修复进程中的迁徙和功能整合，建立干细胞示踪分子影像平台。
项目实施过程中，注重利用我国在模式动物技术平台和干细胞移植示踪技术方面的优势。
在项目专家组的指导下，发挥首席科学家和课题组长的组织协调作用，加强课题组间的协作、交叉及融合。
实施过程中，还将根据国内外的研究动态和进展，不断调整研究策略，集中力量重点突破。
识别示踪本课题是在目前项目组学术骨干主要研究工作的基础上，经过分析该领域国内外研究现状后提出的，具有扎实的工作基础和理论基础，有较强的目的性和可行性。
组织干细胞在个体发育中起到承上启下的枢纽作用。
目前组织干细胞研究在如何识别组织干细胞的分化启动关键因子，从而诱导组织干细胞定向分化为高度专一的功能细胞，以及如何示踪干细胞移植后的去向和功能等前沿领域都存在许多取得重大突破的机会。
项目组在过去的研究中已经取得突破性进展，搭建了日益成熟的干细胞研究技术平台。
项目组首席科学家复旦大学长江学者朱剑虹教授带领他的研究小组，凭借他多年来在干细胞移植示踪研究上的积累，利用华山医院的临床优势，成功地建立了干细胞临床移植治疗无创性示踪技术，开创了临床移植神经干细胞示踪的国际首例。
项目组承担单位之一的上海南方模式生物研究中心是目前国内最具规模的模式生物研究基地之一。
项目组成员费俭教授是国内转基因动物研究领域的骨干人物，在国内较早地开展了转基因和基因剔除小鼠的研究，并组织建立了国内第一个小鼠转基因和基因剔除的公共技术服务平台，上海南方模式生物研究中心，建立了多种可以示踪不同基因表达的报告小鼠系统。
其他参与本课题的研究单位和学术骨干多年来一直从事干细胞基础和临床研究，目前均取得了较大的进展，已经在各国际期刊发表了原创性成果，具有很坚实的前期工作基础；他们精通分子生物学、细胞生物学等方面的研究技术。
课题组本身或所在单位业已建立了相关的研究体系和技术平台，技术方法全面，主要仪器设备齐全，这些研究体系和技术平台还在不断发展和完善中，会对本项目的开展起积极推动作用。
参与本项目的研究单位和学术队伍是有机自然组成的整体，包括国家重点实验室1个，国家级研究院1个，研究型医院3个，国家级技术平台2个，发育生物学基地1个等多个优势单位，拥有丰富的科研经验。
参加本项目的研究骨干组成结构合理，搭配得当，他们多是精力充沛的中青年研究工作者，是我国在本领域中的中坚力量；他们对科学研究充满热情，注重创新，能在本项目研究中取得进展和成绩。
基于上述多种因素综合考量，本项目具备了取得重大突破的可行性。
综上所述，本项目无论从学术思路、研究基础、技术平台以及研究团队而言，都具有独特的优势，项目组整合多个前沿学科的研究力量，本项目的实施将使项目组多年的积累酝酿成科学发现和技术的突破。
通过大家的共同努力，我们有理由相信中国这一领域的研究将不断处于国际同类研究的前沿水平。
本项目在研究方法方面体现多学科综合和学科交叉，强调基础研究和临床研究的结合，使基础研究和临床应用成为一个有机的整体，实现了在理论、技术方法及临床应用等多方面的创新：
1.利用建立组织干细胞模式动物平台，通过转基因及细胞谱系标记的方法，在整体水平建立识别和示踪组织干细胞体内分化的网络调控模型;2.利用多重转基因小鼠对特定的组织干细胞的发育分化进行示踪研究3.体外培养诱导系统与体内发育分化研究系统结合4.尝试通过细胞谱系重编程策略将肝脏细胞转变为胰-细胞腺，脂肪细胞转变为肌肉细胞，为再生医学寻找一条获取功能细胞的新途径。
5.探索新型的磁颗粒和优化的MRI矩阵分析程序，提高标记示踪效率；6.探索一种代谢性生物标记物用于检测和量化神经组织干细胞；7.利用Mn2+的化学性质及离子半径与Ca2+的相似性，探索在活体水平同时观察移植神经干细胞定位和电生理功能的可能性;8.通过核磁共振影像和质子波谱技术开创新颖的干细胞标记和功能示踪技术，建立无创性示踪干细胞迁徙和功能的分子影像平台，推动形成再生医学一个新的分支学科临床干细胞移植示踪学。
本项目围绕关键科学问题，根据项目的总体设计方案，使各课题间形成互补和有机联系，解决组织干细胞研究中的核心科学问题，将项目设置为四个课题：
1.组织干细胞发育分化的模式生物研究及其分子指纹图谱的鉴定；2.肝脏细胞再生的关键启动因子和调控网络的研究；3.组织干细胞的表观遗传调控机制和特定阶段细胞谱系标记物研究；4.干细胞移植后在体迁移及功能示踪的研究。
1.建立组织干细胞及其分化过程细胞谱系跟踪的模式生物技术方法，实现在活体内研究组织干细胞的起源、维持和分化，并在这一过程中研究组织干细胞的分子指纹图谱，为有效地掌握组织干细胞的形成和维持、为实现对细胞再编程的控制奠定理论基础，同时本课题也将成为支撑其他几个课题研究的一个通用平台。
建立成熟的可在活体内示踪组织干细胞增殖分裂、迁移、分化和功能的各种转基因小鼠模型制备平台，获得组织干细胞的分子指纹图谱。
同济大学：
费俭教授彭鲁英、杨桦、陈建泉、复旦大学孙珊、郑云、陈彤15.24%2.研究肝干细胞龛中细胞外基质成分对干细胞发育分化的调控，建立嵌合肝小鼠模型，分析由肝脏干细胞介导的肝再生的机制。
通过特定转录因子诱导肝脏细胞经历细胞谱系重编程为-细胞。
揭示微环境中影响肝脏干细胞定向分化为肝、胰岛细胞的重要分子及其受体的结构及功能；自肝脏细胞谱系重编程后获得-细胞样细胞。
解放军458医院/中科院孔祥平教授易学瑞中国科学院徐刚、汪玉12%3.：
利用模式动物及分子生物学、细胞生物学，结合高通量基因组、蛋白质组及表观遗传组学和生物信息学分析技术，运用体内分化与体外分化研究相结合策略，探索心肾、内耳、脂肪等组织干细胞发育分化的表观遗传调控机制，寻找分化特定阶段的细胞谱系标记物，开展脂肪细胞谱系重编程为肌肉细胞的研究。
阐明调控心、肾、内耳和脂肪组织干细胞分化的表观遗传调控机制，获得组织干细胞发育分化特定阶段的细胞谱系标记物，用以示踪干细胞移植的分化命运示踪，初步建立脂肪细胞重编程为肌肉细胞的技术路线。
中国科学院：
吴东海研究员夏海蓉、张丽、王东业：
复旦大学李华伟、陈靖、郝传明、周播江28.8%4.：
探索新型的磁颗粒和优化的MRI矩阵分析程序，提高标记示踪效率；研究不同途径的干细胞移植后在人体内的发布以及不同病灶时的变化，追踪干细胞移植于人体内后的运动情况和细胞命运转化；探索利用代谢性生物标记物用于检测人脑神经组织干细胞的方法，以克服体外用放射性标记物或超顺磁性氧化铁粒子标记神经干细胞的缺陷；研究移植在脑内的干细胞能否和宿主整合发挥生理功能。
评估神经干细胞参与脑细胞电活动的功能重建。
探索在活体水平示踪移植神经干细胞定位和功能的可能性；开展临床干细胞移植的灵敏性、安全性和有效性评价研究；尝试在其他组织干细胞中开展干细胞的标记移植示踪研究：
建立新的安全高效的干细胞移植功能示踪技术，针对特定的干细胞，获得最佳移植途径，建立促进再生修复、功能重建和无创性示踪干细胞迁徙和功能的分子影像平台。
：
复旦大学：
朱剑虹教授应其龙、杨振纲、王晓梅、吴惺、沙红英、谢荣军事医学院野战输血研究所李艳华39.5%本项目四个课题之间具有密切联系，均是围绕关键科学问题设置的，力求达到彼此之间相互关联，以形成一个完整的研究体系。
四个部分既有分工又相互联系。
干细胞在体内的生物学行为和体外培养有很大差别。
因此建立有效的方法，跟踪发育和修复过程中特定细胞类型的变迁、细胞的迁移、细胞信号转导的激活和抑制、细胞基因组的表达变化等，是把握组织干细胞网络调控特征的关键，是对干细胞实施命运操控的第一步。
因此，第一部分研发的动物模型将为二、三部分提供最佳的研究体系；第二、三部分获得的在组织干细胞维持和分化的重要标志基因为第一部分提供了研究的切入点；第一、二、三个部分的研究为临床应用准备了基础。
干细胞应用于临床治疗须确保安全、可靠和有效，这就要求我们将干细胞用于临床移植治疗时，能够无创性示踪移植干细胞在体内的行为包括迁移和功能，因此，第四部分是整个研究的必经之路和应用出口，而其发展的新技术和新方法同样为其余研究提供方法学基础。
各课题研究内容围绕面向国家重大需求中的关键科学问题和实施的技术方法问题，在组织干细胞识别与分化调控基础理论研究（课题1、2、3）和组织干细胞临床应用研究（课题4）两个层次开展全面深入的系统研究。
课题1、2和3的实施将使我国在干细胞研究领域位于国际前沿水平；课题4面向国家健康领域重大需求，创建安全高效灵敏的活体无创性干细胞移植示踪技术体系，使我国能够在国际上引导该领域的方向，促进干细胞在再生医学的广泛应用，为广大的患者带来福音。
通过课题1、2、3的交叉融合和攻关，以模式动物和转基因修饰技术，建立独特的活体内的细胞、信号通路、表面分子以及细胞谱系的示踪技术体系，阐明组织干细胞复杂的分化调控网络，为课题4的研究提供完善的理论指导；而课题4的深入开展进一步为课题1、2、3提供符合临床治疗需求的研究方向和信息。
通过四个课题之间的共同协作攻关，五年内将获得具有指导意义的组织干细胞分化调控理论（课题1、2、3），建立有效的组织干细胞移植、治疗和示踪研究技术体系（课题1、4）。
拟提供模式动物为支撑的干细胞标记、示踪新方法2-3项（课题1），获得2-3个组织干细胞发育分化特定阶段的细胞谱系标志物（课题2、3），出台干细胞临床移植治疗示踪的新方法1-2项（课题4）。
发表有影响力的论文50-100篇（所有课题），包括高质量的论文5篇（国际公认一级学术刊物或IF10（所有课题），申请专利12项（所有课题）。
建成一支优秀的干细胞与再生医学研究队伍，培养博士后6～12人，博士研究生20～40人，培养5～10名从事临床和基础研究相结合的优秀人才。
四、年度计划研究内容预期目标第一年进行课题实施的前期准备工作，搭建技术平台，制备转基因模型小鼠、疾病模型小鼠。
探索建立一套稳定的分子指纹图谱鉴定技术方法。
分析神经干细胞与心脏干细胞的基因表达谱。
研究细胞外基质成分对肝干细胞分化的调控作用。
鉴定心肌细胞标志和干细胞标志，研究内耳毛细胞前体细胞在内耳中分化为毛细胞的能力；。
探索新型的磁颗粒和优化的MRI矩阵分析程序，提高标记示踪效率。
包括：
寻找新型的磁颗粒、分析SPIO标记细胞的生物物理特征、SPIO标记细胞的活力和增殖能力、SPIO标记细胞的凋亡率、SPIO标记细胞中反应氧的浓度等。
获得PCNA、PAL31报告小鼠和Cre小鼠、获得嵌合肝的模型、链唑霉素诱导糖尿病模型小鼠；获得稳定的分子指纹图谱鉴定技术方法；获得神经干细胞与心脏干细胞的基因表达谱；阐明Epimorphin，Laminins等细胞外基质成分对肝干细胞分化的作用；获得心脏干细胞标志，建立内耳细胞移植技术；获得一种新型的标记用磁颗粒、完善现有的干细胞移植示踪技术。
发表SCI论文4篇，核心期刊4篇。
申请专利2项。
研究内容预期目标第二年在第一年搭建的技术路线和平台的基础上，继续进行上一年的研究内容。
开展组织干细胞特异性标志基因的活体报告小鼠模型以及各自的Cre表达模型建立；分析神经干细胞与心脏干细胞的DNA甲基化图谱。
寻找Epimorphin的受体。
构建肝干细胞分化的报告载体，活体观察移植细胞成为主体细胞时内源肝脏组织细胞的变化。
制备HDAd-Ngn3病毒。
用心肌梗死动物模型观察移植细胞参与心肌再生的情况；寻找肾脏干细胞特有的标记物；继续研究内耳前体细胞在鼠内耳的分布、存活和分化情况；体外诱导全能干细胞成脂肪组织干细胞。
研究不同移植途径对干细胞标记示踪的影响。
比较不同途径移植的干细胞在人体内的分布、运动情况和细胞命运转化以及在体内修复进程中的迁徙和整合特点。
获得Nestin、Islet1，AFP、CD34等组织干细胞特异性标志基因的活体报告小鼠模型以及各自的Cre表达模型；获得神经干细胞与心脏干细胞的DNA甲基化图谱。
获得肝干细胞分化的报告载体；获得启动肝细胞再生的关键极性蛋白；获得Rosa26Stop-Lox-eGFP和Albumin-Cre两种转基因小鼠，获得Rosa26StopFlox小鼠模型。
阐明心脏干细胞的心肌再生能力以及内耳细胞的迁移分化能力，获得肾脏干细胞的鉴定标志，将诱导的全能干细胞诱导分化为脂肪干细胞。
获得神经干细胞、肝脏干细胞经不同移植途径移植后的命运转化特点，从中筛选出干细胞移植的最佳途径。
发表SCI论文4篇，核心期刊5篇。
申请专利2项。
准备课题和项目中期考核。
研究内容预期目标第三年利用上述模型，开展发育过程中和组织修复过程中标志基因的表达特性研究，以及相关的标记细胞的分布、迁移和谱系分化的研究；研究神经干细胞与心脏干细胞染色体的核小体分布或者特定核蛋白的分布。
研究移植肝脏干细胞的动物生存指数及时间，对移植后动物进行干细胞体内分化为肝细胞指标的鉴定。
探索将肝脏细胞谱系重编程为胰腺细胞。
研究GATA4调控CSPs向心肌细胞分化的作用；建立肾脏干细胞的移植技术；研究新生毛细胞与螺旋神经节神经元再连接状况；研究脂肪干细胞在体内的分化及迁移网络途径。
建立活体检测内源性人脑神经干细胞的方法，包括神经干细胞的分布、数量和活动。
尝试将神经干细胞标记移植示踪技术扩展应用于其它组织干细胞（主要针对肝脏和心脏干细胞）的示踪研究。
获得神经干细胞和心脏干细胞分布、迁移等数据；获得神经干细胞与心脏干细胞染色体的核小体分布或者特定核蛋白的分布图。
阐明移植细胞成为主体细胞时内源肝脏组织细胞的变化，建立肝脏移植的评分体系。
获得注射HDAd-Ngn3病毒的糖尿病小鼠的代谢指标。
阐明GATA4在调控CSPs向心肌细胞分化的作用，建立肾脏干细胞移植技术，获得内耳前体细胞的迁移路径、脂肪干细胞在体内的分化及迁移路径。
建立一种检测人脑内源神经干细胞的方法，实现对大脑内源性神经干细胞在体内的定位、功能检测以及人脑疾病状态下的神经再生和神经干细胞作用的实时动态观察和分析。
发表SCI论文12篇，核心期刊16篇。
申请专利3项。
研究内容预期目标第四年利用上述小鼠模型，在发育或者组织修复过程中，跟踪组织干细胞的发生和分化的细胞谱系；分析比较前两年获得的神经干细胞与心脏干细胞的基因表达谱、DNA甲基化图谱、染色体的核小体或者特定核蛋白的分布图。
观察移植后动物肝功能恢复指标。
继续在RNA、蛋白水平研究注射HDAd-Ngn3病毒的糖尿病小鼠的肝脏和脾脏的相关分子的表达水平变化和细胞内定位。
分析GATA4表达后其它与心肌细胞分化有关下游基因，以探讨CSPs向心肌细胞分化的表观遗传调控机制；分离神经嵴干细胞Nestin+CD133+干细胞株，比较肾脏干细胞与神经嵴干细胞治疗肾小球肾病的效率；用脑干诱发电位和耳声发射技术研究内耳前体细胞移植后各阶段耳聋鼠听觉功能的修复情况；制备PRDM16和FOXC2-shRNA腺病毒载体诱导脂肪细胞向骨骼肌细胞转化。
探索在活体水平同时观察移植神经干细胞定位和电生理功能的可能性。
继续开展肝脏干细胞和心脏干细胞标记移植示踪的研究，比较不同移植途径对这两种干细胞存活、迁移和分化能力的影响。
获得神经和心脏组织干细胞分化过程的细胞谱系标志物；获得神经干细胞与心脏干细胞的分子指纹图谱。
获得移植后动物肝功能恢复及肝再生指标。
阐明注射HDAd-Ngn3病毒的糖尿病小鼠的肝脏和脾脏的相关分子的表达水平变化和细胞内定位。
完成Rosa26Stop肝脏特异性敲除小鼠的糖尿病模型小鼠的肝脏细胞的活体示踪。
阐明CSPs向心肌细胞分化的表观遗传调控机制、脂肪干细胞分化的表观遗传调控机制，获得PRDM16和FOXC2-shRNA腺病毒载体，初步建立脂肪细胞谱系重编程技术体系；获得肾小球肾病的最佳治疗方案、建立研究听觉恢复评价的技术。
使活体水平观察移植神经干细胞的功能成为可能，实现对神经细胞突触活动功能的评估，阐明脑功能活动依赖性空间分布模式、探索干细胞与宿主整合、干细胞参与脑细胞电活动的功能重建过程与机理。
建立核磁共振成像的结构功能分析体系。
获得合适的肝脏干细胞与心脏干细胞的移植途径。
发表SCI论文16篇，核心期刊15篇。
申请专利3项。
研究内容预期目标第五年分析移植后动物肝再生指标，分析肝脏细胞重编程为胰腺细胞的效率，继续开展PRDM16和FOXC2-shRNA腺病毒载体诱导脂肪细胞向骨骼肌细胞转化的研究。
继续验证心肌细胞分化有关的下游基因，研究肾脏干细胞分化的遗传与表观遗传学机制因素；研究干细胞从外淋巴进入内淋巴内环境变化对干细胞存活的影响；选择符合研究标准的患者入选本研究进行功能恢复评价和安全性评价。
分析、归纳和总结前四年的研究结果，提炼项目的重要成果及进一步的研究方向。
总结数据，撰写总结报告。
通过上述几年的研究，比较完善地建立起3-5种组织干细胞的特征性鉴定方法和指纹图谱的内容，基本完成对组织干细胞在分化过程中表观遗传模式重建的研究，提出相应的新理论和新的学术见解。
获得评价肝脏再生功能评价标准，初步建立肝脏细胞重编程为胰腺细胞、脂肪细胞重
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