重组质粒的构建解析.docx

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重组质粒的构建解析

实验流程2

实验操作3

1.LB液体培养基的配置3

2.质粒的提取4

3.琼脂糖凝胶电泳5

4.PCR6

5.DNA片段的回收纯化...................................................................7

6.目的片段与载体连接及转化...........................................................8

7.菌种保藏…………………………………………………………...9

8.双酶切反应..10

实验流程——质粒构建

基因提取——1、2、3

PCR反应扩增目的基因——4、3

DNA片段回收——5、3

目的片段与载体连接及转化——6

菌种保藏——7

重组质粒提取——2、3

重组质粒检测：

（1）PCR

（2）双酶切——8、5

测序

实验操作

1．LB液体培养基的配置

【器材】

锥形瓶，烧杯，量筒，分析天平，药匙，高压蒸汽灭菌锅，棉花，报纸，记号笔，麻绳，纱布等。

【试剂】

酵母提取物（YeastExtract，胰蛋白胨（Tryptone，NaCl

【实验步骤】

1.LB液体培养基配方（配置1L培养基）：

胰蛋白胨（Tryptone10g

酵母提取物（YeastExtract5g

NaCl10g

若配置50ml培养基，按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物：

0.25g、胰蛋白胨：

0.5g、NaCl:

0.5g放入烧杯中。

蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。

另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。

2．溶化

在上述烧杯中可先加入少于所需要的单蒸水，用药匙搅匀。

待药品完全溶解后，倒入50ml量筒中，补充水分到50ml，倒入锥形瓶中。

3.包扎

用棉塞或纱布封住瓶口，再在棉塞外包一层报纸，用绳子以活结形式捆扎好。

用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

4.灭菌

将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4°冰箱内暂存。

灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干。

烘干后，4°保存。

【注】1.烧杯、量筒、锥形瓶应先用洗涤精洗干净，再用单蒸水润洗。

2.灭菌后应立即放入烘箱烘干。

3.培养基存放时间不宜过长。

2．质粒的提取

【器材】

加样枪、灭菌的Tip头、灭菌的Ep管、离心机

【试剂】

灭菌水、TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0

【实验步骤】

第一次使用本试剂盒时，请将RNaseA1混浊液全部加入到SolutionⅠ中，均匀混合后4℃保存。

实验操作前请将SolutionⅢ置于4℃（或冰上）预冷后使用。

1.大肠杆菌的培养。

从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4ml的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养。

注）培养液不宜过量，培养液过量时，会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。

2.取菌液，12,000rpm离心2分钟，弃上清。

3.用250μl的SolutionⅠ（含RNaseA1）充分悬浮细菌沉淀。

注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。

4.加入250μl的SolutionⅡ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。

注）此步骤不宜超过5分钟。

5.加入400μl的4℃预冷的SolutionⅢ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置5分钟。

6.室温12,000rpm离心10分钟，取上清。

注）此时4℃离心不利于沉淀沉降。

7.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。

8.将上述操作6的上清液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

9.将500μl的RinseA加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。

10.将700μl的RinseB加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。

注）请确认RinseB中已经加入了指定体积的100%乙醇。

11.重复操作步骤10。

12.将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心1分钟。

13.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。

注）把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。

14.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。

15.DNA经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

【注】提好的质粒需标明时间、名称等。

-20℃保存。

3.琼脂糖凝胶电泳

【器材】

分析天平，锥形瓶，量筒，微波炉，凝胶板，梳子，加样枪，Tip头，电泳槽，电泳仪，紫外投射仪

【试剂】

琼脂糖（Agarose），TAE电泳缓冲液，EB，Marker

【实验步骤】

1.称取1g琼脂糖（Agarose）粉末于锥形瓶中，加入100mlTAE。

保鲜膜封口，扎孔。

2.在微波炉中加热，沸腾两次，直到看不出油滴，形成均一的溶液。

3.倒入污染区的锥形瓶中，待冷却至60℃时加2ulEB，混匀。

4.插入梳子，倒入制胶槽中。

5.室温静置20min.

6.待凝胶全部凝结后，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加缓冲液直到没过凝胶为止。

7.按下表加样：

适用于检测DNA（小孔）：

Marker（DL2000样品1样品2

3ul1ul（6×buffer）＋3ul1ul＋3ul

适用于回收DNA（大孔）:

Marker（DL2000样品1

5ul17ul（6×buffer＋100ul（质粒）

6.电泳15分钟左右。

【注】

1.当加入的样品量小于5ul时，6×buffer均加1ul。

2.电泳时的加样孔宽度小于6mm时，每次取5μl制品电泳便可得到清晰条带。

如果加样孔增宽，须适当增加Marker制品的加样量。

3.对DNA电泳而言，Agarose的纯度对DNA条带的清晰度影响很大。

4.进行Agarose电泳时，Agarose的浓度与DNA片段的分离性能关系密切。

Agarose浓度越大，对短片段DNA分离性能越好；反之，Agarose浓度越小，越有利于长片段DNA的分离。

5.当电泳后片段需回收时，选用大孔胶，当电泳只起检测作用时，选用小孔胶。

6.若电泳产物需要回收，则需换新的缓冲液。

7.本实验室有两种常用Marker,分别为DL2,000DNAMarker和λ-EcoT14ⅠdigestDNAMarker。

Agarose电泳图像示意图如下:

4.PCR

【器材】

加样枪、灭菌PCR管、灭菌Tip头、PCR扩增仪、冰袋

【试剂】

DNA模板、引物、灭菌水、buffer、dNTP（mix、Taq酶

【操作步骤】

加样前应先打开PCR仪，预热。

1.在0.5mlPCR管中加入下列试剂：

50ul体系：

灭菌水：

38ul

10×buffer（LA）：

5ul

dNTP:

4ul

质粒：

0.5ul

F：

1ul

R：

1ul

LA（冰上）:

0.5ul

总体积50.0ul

20ul体系：

灭菌水：

13.35ul

10×buffer（EX：

2ul

dNTP（Mix:

2ul

质粒：

0.5ul

P1:

1ul

P2:

1ul

EX（冰上）:

0.15ul

总体积20.0ul

2.将上述PCR反应混合物混匀放入PCR仪中。

3.设定程序进行扩增：

94℃----------5min

94℃----------30s

55℃（退火温度不固定，根据引物进行调整）-----------1min

72℃----------30s（延伸时间根据目的片段的长度进行调整）

72℃----------7min

共30个循环

4.PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

【注】

1.当PCR反应后的产物目的片段还需进行后续操作时，选用LATaq酶；当PCR反应用于检测时选用EXTaq酶.

2.buffer的选择应与酶的选择相对应。

例如：

LATaq酶对应的buffer为10×LAPCRBuffer.

3.在PCR小管中加样时，应先将各试剂加到管壁上，最后混匀。

这样既节省时间，又节省枪头。

5．DNA片段的回收纯化

【器材】

加样枪、灭菌的Tip头、灭菌的Ep管、水浴锅、离心机

【试剂】

TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0、灭菌水

【操作步骤】

1.实验前将水浴锅调到75度；将灭菌水放入烘箱中加热；空管去皮。

2.使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

3.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。

此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。

注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。

先切后验证。

4.切碎胶块。

胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。

5.称量胶块重量，计算胶块体积。

计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计算。

6.向胶块中加入胶块融化液DR-IBuffer，DR-IBuffer的加量如下表：

凝胶浓度DR-IBuffer使用量

1.0％3个凝胶体积量

7.均匀混合后75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热）。

此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6～10分钟）。

注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。

8.向上述胶块融化液中加入DR-IBuffer量的1/2体积量的DR-IIBuffer，均匀混合。

当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。

9.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。

10.将上述操作7的溶液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

注）如将滤液再加入SpinColumn中离心一次，可以提高DNA的回收率。

11.将500μl的RinseA加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。

12.将700μl的RinseB加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。

注）请确认RinseB中已经加入了指定体积的100%乙醇。

13.重复操作步骤11。

14.将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心1分钟。

15.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入12.5μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。

16.重复操作步骤15。

注）把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。

17.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。

6.目的片段与载体连接及转化

【器材】

超净台：

酒精灯、打火机、加样枪、灭菌PCR管、灭菌Tip头、摇床、冰袋、水浴锅

【试剂】

PMD-18载体、目的片段、SolutionⅠ、感受态细胞、LB培养基（加Amp、含AMP的琼脂培养基

【实验步骤】

1.实验前水浴准备。

2.在PCR管中加入：

PMD-18载体：

1ul

目的片段：

4ul

总体积5ul

3.再加入5ulSolutionⅠ

4.16℃，连接90min

5.全量10ul加入至感受态细胞中，冰上放置30min.

6.42℃，热激45s.

7.冰上，1min.

8.加890ulLB培养基（不加Amp，37℃摇床培养60min。

9.涂布在含AMP的琼脂培养基上，过夜培养。

（3ml培养基中加入3ulAMP）

10.第二天晚上五点挑菌,在3mlLB培养基（加Amp中培养,37℃过夜。

7.菌种保藏

【器材】

超净台：

酒精灯、打火机、1ml加样枪、灭菌Tip头

【试剂】50％的甘油

【实验步骤】

1.实验前超净台灭菌。

2.将500ul50％的甘油与500ul菌液混合，-80℃保存。

8.双酶切反应

【器材】

水浴锅、灭菌Tip头、0.5mlPCR管、加样枪

【试剂】

Buffer、限制酶1、限制酶2、重组质粒、灭菌水

【实验步骤】、

1.实验前水浴准备。

2.在0.5mlPCR管中加入下列试剂：

体系：

灭菌水：

5ul

Buffer：

1ul

质粒：

3ul

限制酶10.5

限制酶20.5

总体积10.0ul

3.37℃水浴，1.5小时以上。

4.琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物。

【注】

1.酶的选择：

载体上有酶切位点，但目的片段上没有该酶的酶切位点，且所选择的酶为常用酶。

2.Buffer的选择：

需要参考所选择的酶，必须同时适用于两种酶。

相关资料请查询双酶切通用缓冲液使用表。

例：

若选用BamHI、HindIII，则buffer选用10×K。

3.反应温度的选择：

需要参考所选择的酶，必须同时适用于两种酶。

相关资料请查询TaKaRa中文目录。