积雪草酸对糖尿病大鼠心脏及其线粒体的保护作用.docx

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积雪草酸对糖尿病大鼠心脏及其线粒体的保护作用

积雪草酸对糖尿病大鼠心脏及其线粒体的保护作用

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

作者：

方春钱,高静,周军,陈艳,王丽,吴晨光【摘要】目的：

探讨积雪草酸（asiaticacid,AA）对糖尿病（diabetesmellitus,DM）大鼠心脏保护作用及其可能机制。

方法:

用65mg/kg链脲佐菌素（streptozocin,STZ）腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,分为DM组,10mg/kgAA（DM+AA1）组和40mg/kgAA（DM+AA2）组。

灌胃给药8周后心脏彩超检测心脏功能,检测心肌组织及其线粒体的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）和ATP酶（ATPase）含量或活力,检测心肌线粒体膜电位（Δψm）,HE染色观察心肌形态。

不同浓度AA预处理线粒体,检测其对羟自由基（·OH）引起线粒体损伤的影响。

结果:

DM组左室射血分数和左室缩短分数显著升高,心肌出现肌浆凝集、间质水肿等病理情况;DM组大鼠心脏组织SOD活性显著下降、MDA含量显著升高;心肌线粒体Δψm、ATPase、SOD、CAT活性显著下降。

AA能够一定程度上抑制以上指标的变化。

此外,AA还能阻止Fe2++VitC诱导的线粒体脂质过氧化作用。

结论:

AA对DM大鼠心脏损伤的改善作用可能与保护线粒体、抑制线粒体脂质过氧化,调节心脏氧化还原平衡有关。

【关键词】积雪草酸;糖尿病;心肌;线粒体;氧化还原　　[Abstract]Objective:

Toobservetheprotectiveeffectofasiaticacid（AA）onheartsandrelativemitochondriainstreptozotocin（STZ）induceddiabeticrats.Methods:

DiabetesgroupinducedbySTZ（65mg/kg）andtherapeuticgroupfollowingwithAA（10and40mg/kg）treatmentfor8weeks.Wedetectedtheircardiacfunction,isolatedheart,detectedSOD,MDA,CATandATPasecontentorvigorofmyocardialtissueandtheirmitochondrial,detectedmitochondrialmembranepotential,HEstainedandobservedcardiacmorphology.AfterdifferentconcentrationsofAApretreatment,wedetectedtheireffectsonmitochondriainjurycausedbyhydroxylradical（·OH）.Results:

Itwasfoundthattheleftventricularejectionfractionandleftventricularfractionalshorteningincreasedsignificantly.Somepathologicalphenomenonoccuredsuchascardiacsarcoplasmiccondensation,interstitialedemaobviouslyinheartofdiabeticrats.AndasignificantincreaseofMDAanddecreaseofSODactivitiesinheartwereobservedindiabeticrats.Meanwhile,ATPase,SOD,CATactivitiesandthecollapseofmitochondrialtransmembranepotential（Δψm）weredecreasedinthemitochondrial.However,treatmentwithAAinhibitedsomechangesoftheaboveindicators.Ontheotherhand,AAcouldblocktheratmitochondriainjuryinducedbyoxygenfreeradical.Conclusion:

AAprotectedtheheartofSTZinduceddiabeticrats.Themechanismofprotectionmayberelatedtotheprotectionofheartmitochondria,agonisticoflipidperoxidationandregulatingthebalancebetweenoxidationandreductionofhearts.　　[Keywords]asiaticacid;diabetesmellitus;cardiacmuscle;mitochondria;oxidationreduction　　积雪草酸（asiaticacid,AA）,又名亚细亚酸,是积雪草提取物中的五环三萜烯类组分。

经研究证明,AA具有促进成纤维蛋白合成[1]、对抗CCl4和DGalN诱导的肝损伤[2,3]、抗肿瘤[4]、对抗神经细胞的氧化损伤等细胞保护作用。

但是对于AA治疗糖尿病性心肌病未见报道。

近年研究发现,自由基过多产生及其清除系统的异常在糖尿病微血管并发症的发生及发展中起重要作用[5]。

2007年有综述提出,线粒体可能成为神经退变性疾病、代谢性疾病及肿瘤等疾病治疗药物的重要靶标之一[6]。

因此,控制作为自由基重要成分活性氧簇（reactiveoxygenspecies,ROS）的主要来源,保护ROS的主要靶位——线粒体，对防治糖尿病慢性并发症具有非常重要的意义。

本研究主要观察AA对链脲佐菌素（streptozocin,STZ）诱导的糖尿病大鼠心脏和其线粒体是否有保护作用,并对其可能机制进行探讨。

　　1材料和方法　　1.1实验材料　　积雪草酸（广西昌洲天然产物有限公司）。

雄性SD大鼠36只,体质量170～210g,2～3月龄,由扬州大学比较医学中心提供[合格证号:

SCXK（苏）2007-0001]。

超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）和ATP酶（ATPase）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）,血糖试纸（雅培公司）,链脲佐菌素（Sigma公司）。

　　1.2动物分组及处理　　健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组（NC组,n=6）和糖尿病组（n=30）。

造模组给予腹腔注射STZ65mg/kg[7],NC组大鼠给予相同体积枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。

1周后测定血糖,以血糖大于16.8mmol/L的大鼠确定为糖尿病模型大鼠,成模率为70%。

　　将造模成功大鼠随机分为3组:

糖尿病模型组（DM组,n=7）和低剂量AA干预组（DM+AA1组,n=7）,高剂量AA干预组（DM+AA2组,n=7）。

DM+AA1组灌胃给予AA10mg/kg,DM+AA2组给予AA40mg/kg,AA溶于含10%乙醇的生理盐水,NC组和DM组大鼠给予等体积含10%乙醇的生理盐水,持续给药8周,8周后测血糖。

实验前禁食12h,麻醉,心脏超声检测;腹主动脉采血,分离血清,检测相关生化指标;迅速取出脏器,一部分固定做病理检测,另一部分用生理盐水制成10%组织匀浆,测定相关指标。

　　1.3心脏超声检测　　麻醉大鼠,褪去前胸部皮毛,取左室短轴观、胸骨旁左室长轴观、心尖四腔观及剑突下四腔观,在二维影像指导下以M型超声模式测量左室舒张末期内径（leftventricularenddiastolicdiameter,LVEDD）和左室收缩末期内径（leftventricularendsystolicdiameter,LVESD）,计算左室射血分数（leftventricularejectionfraction,LVEF）和左室缩短分数（leftventricularfractionalshortening,LVFS）。

　　1.4组织形态学检测　　取心肌组织,中性甲醛常规固定、脱水、石蜡包埋、切片（5μm）,常规行HE染色,光镜下观察组织切片,用LeicaQWIN3自动图像分析系统摄片。

　　1.5氧化抗氧化指标及ATPase活性检测　　MDA、SOD、CAT、ATPase按照试剂盒说明书操作方法进行测定。

　　1.6心肌线粒体的制备　　取各组大鼠心肌组织,以蔗糖为介质,采用差速离心法获取线粒体。

在预冷的分离液（含225mmol/LD甘露醇,75mmol/L蔗糖,0.05mmol/L乙二胺四乙酸,10mmol/LTrisHCl,pH7.4）中剪碎,冰浴匀浆;2500r/min离心5min,取上清液;12000r/min4℃离心10min,弃上清液,用预冷的分离液洗涤3次,所得沉淀即为纯化的线粒体,用考马斯亮蓝法测定线粒体蛋白浓度,调整线粒体蛋白浓度为0.5～1.0mg/ml。

　　1.7线粒体膜电位（Δψm）的测定　　采用荧光染料罗丹明123（Rhodamine123,Rh123）染色法测定线粒体的Δψm。

具体测定方法如下:

重悬各组大鼠心肌线粒体于测定缓冲液（含225mmol/LD甘露醇,70mmol/L蔗糖,5mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸,pH7.2）中;在25℃条件下分别与0.3μmol/LRh123共孵3min后,用测定液洗2次;离心后重悬于测定缓冲液,用BioRed荧光酶标仪测定40min内各组线粒体悬液Rh123的荧光强度,激发波长505nm,发射波长534nm。

　　1.8羟自由基（·OH）对线粒体的损伤　　·OH由Fe2++VitC系统产生[8],先用不同浓度的AA作用于线粒体,37℃振荡温浴30min。

再加入硫酸亚铁和VitC,使溶液含硫酸亚铁30μmol/L,VitC0.5mmol/L,空白管不加VitC,对照管不加AA。

AA的终浓度为25,50,100μmol/L。

检测线粒体的肿胀度和膜电位。

　　1.9统计方法　　所有数据用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析,计量资料数据以均数±标准差（±s）表示,P0.05为差异有统计学意义。

　　2结果　　2.1AA对糖尿病大鼠一般状况的影响　　实验过程中,DM、DM+AA1、DM+AA2组大鼠每组死亡1只。

动物实验前测定NC组大鼠血糖浓度为（5.6±0.52）mmol/L,DM、DM+AA1和DM+AA2组大鼠血糖值分别为（36.1±2.52）、（36.2±2.10）和（36.1±3.43）mmol/L。

　　2.2AA对DM大鼠心脏的作用　　2.2.1AA对糖尿病大鼠心脏功能的影响实验使用心脏彩超检测、评价心脏功能（图1）。

如表1所示,与NC组相比较,DM组大鼠LVEF和LVFS显著降低;AA治疗组LVEF和LVFS都显著升高,但仍低于正常组。

LVEDD和LVESD无明显变化。

表1AA对糖尿病大鼠心脏功能的影响±s　　2.2.2AA对糖尿病大鼠心脏组织病理学的影响结果表明,NC组大鼠心肌细胞结构纹理清晰,肌丝排列整齐;DM组大鼠心肌肌丝排列紊乱、扭曲、断裂,肌浆凝集,间质水肿;AA治疗组糖尿病大鼠心肌纹理一定程度上恢复正常,趋于清晰,间质水肿有所减轻。

见图2。

　　2.3AA对糖尿病大鼠SOD、CAT、MDA的作用　　2.3.1AA对DM大鼠SOD、CAT活性的影响见图3。

与NC组相比,DM组大鼠心脏组织中SOD、CAT活性显著下降;AA给药后DM大鼠心脏组织中SOD、CAT活性均有明显升高,DM+AA2组大鼠基本恢复至正常水平。

　　2.3.2AA对DM大鼠MDA含量的影响结果如图4所示。

与NC组相比,DM组大鼠心脏组织中MDA含量显著上升;AA给药的大鼠心肌中MDA含量较DM组大鼠相比显著下降,DM+AA2组基本恢复至正常水平。

　　2.4AA对糖尿病大鼠线粒体功能的影响　　2.4.1AA对糖尿病大鼠心肌线粒体膜电位的影响与NC组相比,DM组、DM+AA1、DM+AA2组糖尿病大鼠心肌膜电位显著下降;经不同剂量AA处理的糖尿病大鼠心肌线粒体膜电位有不同程度的恢复（图5）。

　　2.4.2AA对糖尿病大鼠心肌线粒体ATP酶功能的影响AA对糖尿病大鼠心肌线粒体ATP酶的作用如图6所示。

DM组大鼠线粒体Ca2+ATP,Na+K+ATP酶活性与NC组相比显著下降,AA给药组糖尿病大鼠的Ca2+ATP,Na+K+ATP酶活性与DM组比较都明显增加。

　　2.4.3AA对糖尿病大鼠心肌线粒体SOD酶活性的影响AA对糖尿病大鼠心肌线粒体SOD酶的作用如图7所示。

DM组大鼠线粒体SOD酶活性和NC组相比显著下降,给AA后糖尿病大鼠的SOD酶活性得到明显恢复。

　　2.5AA对氧自由基诱导线粒体脂质过氧化作用　　2.5.1AA对线粒体肿胀的影响线粒体悬液中加入Fe2+和VitC后,线粒体受到损伤而发生膨胀,在540nm处的光密度下降。

3个浓度AA预处理后能不同程度抑制上述肿胀,使线粒体的损伤程度减轻,浓度越高,抑制作用越明显,如图8a所示。

　　2.5.2AA对线粒体膜电位的影响线粒体经Rh123处理再用Fe2+和VitC诱导,测定线粒体的膜电位。

结果如图8b所示,3个浓度AA预处理都能明显抑制膜电位的下降。

　　3讨论　　导致糖尿病患者死亡的主要原因是其并发的心血管损伤[9]。

STZ诱导的大鼠糖尿病模型是国际上公认的糖尿病模型[7],成模8周后可出现一系列糖尿病慢性并发症[10]。

　　本研究中8周后大鼠心脏彩超表现出糖尿病性心脏功能病变。

病理检测结果也表明,长期的代谢紊乱已经使糖尿病组大鼠的心脏组织形态结构发生了严重的损伤。

近年研究发现,活性氧簇（ROS）产生过多是糖尿病并发症的统一机制,糖尿病患者MDA和ROS含量增加[11,12]。

正常生理情况下,体内存在清除自由基的抗氧化酶系统,维持自由基产生和清除的动态平衡。

在病理情况下,ROS的产生速率大于被清除的速率,ROS过度蓄积;同时,抗氧化防御能力下降,从而发生氧化应激,直接引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性、DNA损害,最后导致细胞死亡或凋亡、组织损伤乃至疾病发生。

MDA是ROS引发细胞膜脂质过氧化反应的毒性产物,它可损伤生物膜脂质双分子层结构[13]。

因此,MDA的含量常可反映体内脂质过氧化损伤的程度以及氧化应激水平,间接地反映出组织损伤的程度。

SOD是内源性抗氧化系统中重要抗氧化酶之一,其重要作用在于清除带电荷的氧自由基[14]。

积雪草酸通过恢复糖尿病大鼠SOD、CAT等抗氧化酶的活性,提高了机体的抗氧化能力,降低MDA的含量,减少自由基对脂肪、DNA和蛋白质等生物大分子的损伤。

　　心肌细胞线粒体是心肌能量代谢产生的重要场所,其功能状态直接反映了心肌活力和功能,在心肌细胞受到损伤时,线粒体的能量代谢是变化的,表现为跨膜电位的变化[15]。

线粒体膜电位的形成是维持线粒体内环境稳定,保证氧化磷酸化通畅的重要条件,膜电位对维持线粒体正常功能是必要的。

线粒体Na+K+ATP酶和Ca2+ATP酶位于线粒体内膜中,两者在维持线粒体容量、线粒体膜内外离子平衡、渗透压平衡方面起关键作用,是线粒体结构、功能变化的灵敏指标。

线粒体SOD酶位于线粒体基质中,可及时清除呼吸链上产生的过多ROS。

本实验研究结果显示,积雪草酸能抑制心肌线粒体膜电位、ATPase、SOD活性的下降,对于维持STZ诱导的糖尿病大鼠心肌线粒体正常的结构和功能具有重要作用。

本实验室过去的研究结果表明,积雪草酸可以直接清除自由基,对分离的线粒体[16]和体外培养的细胞[17]都有直接保护作用。

　　综上所述,在糖尿病慢性并发症发病过程中,由于自由基产生过多且无法及时清除,过氧化产物大量聚积。

积雪草酸可以清除自由基、抑制线粒体脂质过氧化,保护线粒体,维持心肌细胞氧化和抗氧化平衡,进而起到保护心脏的作用。

　　（本文图2见彩色插图）【参考文献】　[1]SooLeeY,JinDQ,BeakSM,etal.InhibitionofultravioletAmodulatedsignalingpathwaysbyasiaticacidandursolicacidinHaCaThumankeratinocytes[J].EurJPharmacol,2003,476（3）:

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