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水产毕业论文定稿

海南大学

毕业论文（设计）

题目：

黄鳝肠道益生乳酸菌的筛选与鉴定

学号：

姓名：

年级：

2009级

学院：

海洋学院

系别：

水产系

专业：

水产养殖学

指导教师：

完成日期：

2013

年

5

月

18

日

摘要

黄鳝（Mponopterusalbus）隶属合鳃目、合鳃科、黄鳝亚科，为亚热带淡水鱼类，主要分布在亚洲的中国、朝鲜、泰国、日本、印度尼西亚等国家，具有良好的药用保健功能，有很高的经济和营养价值。

本文以黄鳝为研究对象，通过对其肠道菌群采用“先筛选后分离”的方法，旨在获得黄鳝肠道益生乳酸菌。

结果获得3株菌株，命名为LB-1，LB-2，和LB-3，初步确定为乳酸菌。

随后对三株乳酸菌进行抗逆性分析，结果如下：

三株乳酸菌均可以在酸性和碱性条件下存活；胰蛋白酶对三株菌的存活率没有影响；在70℃的高温中三株菌均有一定的耐受性。

本文从黄鳝肠道中筛选出具有耐高温、抗酸和抗碱能力强的益生乳酸菌，以其作为黄鳝饲料添加剂应用于生产，以提高黄鳝机体的健康水平和机体的抗病力，从而为促进黄鳝养殖产业的健康发展奠定基础。

关键词：

黄鳝；肠道益生乳酸菌；筛选

Abstract

Therice-fieldEel（Monopterusalbus）amemberofthesynbranchiformes,synbranchidae,ricefieldeelsubfamily,isasubtropicalfreshwaterfishthatoccursmainlyinAsia,includingChina,Japan,Korea,Thailand,Indonesiaandothercountries.Thisfishhascertainpropertiesusefulformedicalpurposesandisalsoofveryhigheconomicandnutritionalvalue.Basedoneelastheresearchobject,throughtheintestinalflorawiththemethodof"separation"afterfirstscreening,aimstoobtaineelslivelacticacidbacteriainthegut.theresultsobtainedfromthreestrains,andnamedtheLB-1,LB-2,andLB-3,initiallyidentifiedaslactobacillus.thenanalysisofthreestrainsoflacticacidbacteriaforStressresistance.Thisstudyyieldedthefollowingresults:

（1）AcidityResistance:

The3strainsoflacticacidbacteriawereabletosurviveinacidicandalkalineconditions;

（2）ParenzymeResistance:

variationsinparenzymeshadnoeffectonthe3strainsofbacteria;（3）TemperatureResistance:

The3strainsofbacteriawereabletotolerateupto70℃.Thepurposeofthisstudyistostudyisstudystrategiesofbuildingtherice-fieldeelsresistancetodiseasethroughnutritionaladditives.Thisstudywillstudysamplesofprobioticlacticacidbacteriaresistanttohightemperature,acidandalkalithatcommonlyoccurintheeel’sintestinaltract,inordertoifcertainfeedadditivescancombatbacterialgrowthandpromotehealthyeelgrowth.

Keywords：

Monopterusalbus;theintestinalprobioticlacticacidbacteria;selecte

黄鳝肠道益生乳酸菌的筛选与鉴定

前言

黄鳝（Mponopterusalbus）隶属合鳃目、合鳃科、黄鳝亚科，为亚热带淡水鱼类，主要分布在亚洲的中国、朝鲜、泰国、日本、印度尼西亚等国家，具有良好的药用保健功能，有很高的经济和营养价值。

但随着养殖密度的加大，黄鳝的发病率越来越高，抗生素药物的使用日益增多。

抗生素作为饲料添加剂使用以来，其饲用效果已被证实，尽管在一定程度上可以预防疾病，甚至提高养殖动物生长速度，但随之带来的一系列诸如耐药性、环境污染等问题也日益受到人们的重视。

目前，各国政府已纷纷出台措施，严格控制抗生素作为饲料添加剂的使用，因此出现了开发抗生素替代品的研究热潮。

动物微生态理论认为，动物及体内所寄生的微生物相互作用、相互影响；在环境因素的影响下，动物与微生物保持动态的微生态平衡；正常微生物群的组成存在种属和个体特异性；特定的环境条件可造成动物微生态失调，使生态系统丧失功能；动物和微生物群之间存在共生关系，互相提供营养等生存条件等[1]。

益生菌剂是利用宿主的正常菌群制成的，以达到调整宿主微生态平衡为目的[2]。

乳酸菌作为一类能利用碳水化合物发酵并产生大量乳酸的细菌，是动物肠道内正常菌群不可缺少的组成部分，对维持肠道正常菌群的微生态平衡和提升宿主免疫力等均具有重要作用。

乳酸菌不仅能够分泌丰富的酶源，促进宿主肠道对营养物质的吸收和利用，而且可通过加强宿主机体肠道微生物的屏障作用，间接提高宿主对病原抵抗力，从而提高宿主动物的健康水平和抗病力，进而提高养殖动物的成活率[3]。

近年来，筛选益生菌，研究其与动物肠道菌群和生长的相互关系，是益生菌研究的一个重要方面。

本研究以黄鳝为研究对象，旨在从其肠道中筛选出具有耐高温、抗酸和抗碱能力强的益生乳酸菌，以其作为黄鳝饲料添加剂应用于生产，以提高黄鳝机体的健康水平和机体的抗病力，从而为促进黄鳝养殖产业的健康发展奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物

试验用健康黄鳝，重量200±20g/尾，采自海口某黄鳝养殖场。

1.1.2培养基

表1.培养基配方

培养基

成分

MRS培养基

蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖10g，吐温-800.5mL，磷酸氢二钾1.0g，含水醋酸钠2.5g，柠檬酸氨1.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.025g，琼脂粉7.5g，蒸馏水加至500mL，调pH值6.2-6.6，12l℃15min高压灭菌。

MRS肉汤培养基

蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖10.0g，吐温-800.5mL，磷酸氢二钾1.0g，柠檬酸铵1.0g，硫酸镁0.1g，蒸馏水加至500mL，调pH值6.2-6.6，121oC15min高压灭菌。

酸化胆盐MRS培养基

在MRS培养基的基础上加0.2%乳糖胆盐，调pH值至5.6，12l℃，15min高压灭菌。

1.1.3试剂

无菌PBS（两份）：

0.1mol/L磷酸氢二钠46.3mL与0.1mol/L磷酸二氢钠53.7mL混合，调pH为6.2；

草酸铵结晶紫：

溶液A（结晶紫1.0g，95%酒精20mL），溶液B（草酸铵0.8g蒸馏水80mL），混合过滤使用；

卢戈氏碘液：

碘片1.0g，碘化钾2.0g，蒸馏水300mL（提前24h配制），5%番红复染液，3%过氧化氢（现配现用），95%酒精，50%甘油（灭菌）；

溴甲酚紫指示剂：

0.04g溴甲酚紫，2mL乙醇；

其他试剂及药品均为分析纯。

1.1.4主要仪器设备

酸度计：

上海大普仪器有限公司PHS-29A

高速冷冻离心机：

德国eppendorfCENTRIFUGE5810R

电子天平：

梅特勒托利多仪器（上海）有限公司AL104

电热恒温干燥箱：

上海跃进医疗仪器厂GZX-DH-30X35-BS

蒸汽灭菌器：

日本SANYOMLS-3780

恒温恒湿培养箱：

重庆市永生实验仪器厂XMT-9017

净化工作台：

上海苏净实业有限公司BCM-1000

光源显微镜：

江南光电集团有限公司XS-213-201

厌氧培养箱：

上海新苗医疗器械制造有限公司YQx-11

电子恒温水浴锅：

天津泰斯特有限公司CWCA

碎花制冰机：

日本SANYOSIM-F140

恒温震荡摇床：

日本SANYOORBI-SAFE

1.2方法

1.2.1样本的采集

参考于文媛，王世锋等[8]无菌提取合浦珠母贝抗菌肽粗提液制备方法，加以修改如下：

将健康的黄鳝置清水池暂养。

取样时，将黄鳝置于冰浴中麻醉后，用酒精棉消毒鱼体表面，无菌打开腹腔，消毒肠管外壁，并用无菌PBS冲洗数遍，取肠道，加入适量PBS后匀浆，制成原液，置于4℃冰箱中密封保存备用。

1.2.2菌种的分离及初筛

参考单晓枫[4]分离鲤鱼肠道乳酸菌的方法，将原液用无菌PBS进行倍比稀释，制成原液、10-1、10-2、10-3四个梯度稀释液。

取各稀释液0.1mL，分别涂布于酸化胆盐MRS培养基，封口膜封板后，30℃厌氧培养48h，至长出单菌落。

挑取不同单菌落接种于MRS肉汤培养基，，30℃，180rmp摇床震荡，厌氧培养18h。

1.2.2.1触酶试验

参考单晓枫[5]触酶试验的方法改进如下：

在超净工作台上，取MSR肉汤培养基培养的菌液少量置于洁净的玻片上，然后滴加3%过氧化氢一滴，观察结果，淘汰产生气泡，即触酶阳性的细菌。

对触酶阴性的菌液进行离心（4℃，4000转，15min），除去上清备用。

1.2.2.2革兰氏染色

参考周德庆等[6]编写的《微生物学实验教程》关于革兰氏染色的方法。

（1）涂片：

取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪枪头挑取少量待检样品（离心沉淀菌体）滴在载玻片的中央，将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

（2）干燥：

将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

（3）固定：

手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。

（4）初染：

在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色1min。

（5）水洗：

斜置载玻片，用胶头滴管吸取蒸馏水冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

（6）媒染：

用胶头滴管吸取卢戈氏碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色1min。

（7）脱色：

斜置载玻片，用胶头滴管吸取蒸馏水冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

（8）脱色：

斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不显紫色为止，大约需时20-30s，随即水洗。

（9）复染：

在涂片薄膜上滴加番红复染液1-2滴，使染色液完全覆盖涂片，染色1min。

（10）水洗：

斜置载玻片，用胶头滴管吸取蒸馏水冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

（11）干燥观察：

用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴松柏油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。

对分离出的触酶阴性菌进行革兰氏染色，镜检。

对触酶阴性、革兰氏阳性的球菌及杆菌，可暂定为乳酸菌，50%甘油：

菌悬液=1：

1，-20℃密封保存。

1.2.2.3葡萄糖产酸试验

参考卢晓莉[7]产酸试验方法修改如下：

在装有液体MRS培养基的试管中加入浓度为1.69g/100mL的溴甲酚紫作为指示剂，添加量为1.4mL/L。

接入菌株（1.2.2.2保种），30℃培养24h，180rmp摇床震荡培养。

若培养基的颜色由紫色变为黄色，则证明有酸产生。

将产生酸的对应的菌种暂定为乳酸菌，进行保种。

1.2.3乳酸菌的抗逆性试验

参考单晓枫[5]，卢晓莉[7]，贺中华[8]等进行乳酸菌抗逆性试验，具体操作的方法如下：

1.2.3.1乳酸菌的活化

将1.2.2.3分离到的乳酸菌接种于MRS肉汤中，30℃，18h，180rmp震荡培养，进行活化。

取培养液于4℃，4000rmp，离心15min后，用无菌PBS悬浮沉淀菌体，调菌体含量为一定浓度，备用。

1.2.3.2pH值对乳酸菌的影响

用1mol/LHCl、lmol/LNaOH调节PBS溶液中，使其pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、8.0、9.0和10.0，并将未调pH值的PBS溶液（pH6.2）设为对照。

灭菌。

取1.2.3.1保留的乳酸菌进行活化，按5%（v/v）接种于上述培养基中，30℃厌氧条件下培养，在接种0h、1h、2h、3h、4h后，取上述处理菌液0.lmL，分别涂布于酸化胆盐MRS培养基，封口膜封板后，30℃厌氧培养48h，至长出单菌落，用细菌计数板进行平板计数，观察其对酸碱的耐受情况。

1.2.3.4蛋白酶对乳酸菌存活率的影响

取活化好的乳酸菌，按5%（v/v）接种于浓度为1%的胰蛋白酶的PBS溶液中，以未加蛋白酶的PBS溶液作为对照，于30℃厌氧培养，分别在0h、lh、2h、3h、4h时取处理样进行平板计数，观察蛋白酶对乳酸菌存活率的影响。

1.2.3.5耐高温能力的测定

通过上述试验所筛出的乳酸菌进行活化，按5%（v/v）接种于PBS溶液中，30℃厌氧条件培养4h后，取菌液进行高温处理：

50℃、70℃、90℃各2min、5min、10min，以未经热处理的菌液作为对照。

用平板计数估算菌液浓度，观察其耐高温的能力。

2结果

2.1乳酸菌筛选结果

在酸化胆盐MRS培养基上培养出5种不同的菌落，分别为橘黄色、不透明、圆形、直径0.8-1.0mm、边缘整齐、表面光滑湿润；乳白色、不透明、圆形、直径2.0-2.2mm、边缘整齐、表面光滑湿润；乳白色、不透明、圆形、直径0.5mm、边缘整齐、表面光滑湿润；乳白色、不透明、圆形、直径3.0-3.2mm、边缘整齐、表面光滑湿润；淡黄色、不透明、圆形、直径0.5mm、边缘整齐、表面光滑湿润。

从5种不同的菌落中挑取50株菌种接种在MRS培养基中，按1-50编号。

将进行活化的50株菌株进行触酶实验，其中26株菌种触酶阴性，编号分别为9，11，12，13，14，15，16，18，25，26，28，29，31，32，33，34，35，37，38，39，40，42，43，44，45，48，具体结果见表2。

在此基础上对26株菌株进行革兰氏染色观察，其中革兰氏阳性的有16株，编号为9，11，12，13，14，25，26，28，29，31，35，37，38，39，40，45，48，结果见表2。

将16株菌株接种在加入浓度为1.69g/100mL的溴甲酚紫液体MRS培养基中进行葡萄糖产酸试验的筛选，结果表明共有3个培养基变为黄色，编号分别为11，16，26，依次命名为LB-1，LB-2，LB-3，初步确定为乳酸菌[5]，其他为紫色，体结果见表4。

表2.触酶试验结果

编号

结果

编号

结果

编号

结果

编号

结果

编号

结果

1

+

11

-

21

+

31

-

41

+

2

+

12

-

22

+

32

-

42

-

3

+

13

-

23

+

33

-

43

-

4

+

14

-

24

+

34

-

44

-

5

+

15

-

25

-

35

-

45

-

6

+

16

-

26

-

36

+

46

+

7

+

17

+

27

+

37

-

47

+

8

+

18

-

28

-

38

-

48

-

9

-

19

+

29

-

39

-

49

+

10

+

20

+

30

+

40

-

50

+

标注：

阳性+；阴性-

表3.革兰氏染色镜检结果

编号

结果

编号

结果

编号

结果

编号

结果

9

+

18

-

33

-

42

+

11

+

25

-

34

-

43

+

12

+

26

+

35

-

44

+

13

+

28

-

37

-

45

+

14

+

29

+

38

+

48

+

15

+

31

-

39

-

16

+

32

-

40

+

标注：

阳性+；阴性-

表4.葡萄糖产酸试验结果

编号

结果

编号

结果

编号

结果

编号

结果

9

×

14

×

29

×

43

×

11

√

15

×

38

×

44

×

12

×

16

√

40

×

45

×

13

×

26

√

42

×

48

×

标注：

紫色×；黄色√

2.2乳酸菌抗逆性实验结果

2.2.1pH值对乳酸菌的影响

通过对三株菌在不同pH值条件下的生长情况分析如下：

由表5可知，乳酸菌LB-1在pH=2时，随着培养时间的延长存活率下降；pH从3.0到9.0，乳酸菌LB-1在随着培养时间的延长，存活率在上升；在pH=10.0时，存活率成负增长。

因此，可以判断乳酸菌LB-1在酸性和碱性条件下，以pH=6.2为对照，存活率都在50%以上，并且在pH=5.0时，最适宜生存。

由表6可知，乳酸菌LB-2在pH=2时，随着培养时间的延长存活率下降。

在pH从3.0到9.0，整体来说，乳酸菌LB-2在随着培养时间的延长，存活率在上升，在pH=10.0时，存活率成负增长。

因此，可以判断乳酸菌LB-2在酸性和碱性条件下，以pH=6.2为对照，存活率都在50%以上。

并且在pH=4.0时，最适宜生存。

由表7可知，乳酸菌LB-3在pH=2和pH=3时，随着培养时间的延长存活率下降，并且耐强酸能力差。

在pH从4.0到9.0，整体来说，乳酸菌LB-3在随着培养时间的延长，存活率在上升，在pH=10.0时，存活率成负增长。

因此，可以判断乳酸菌LB-3在酸性和碱性条件下，以pH=6.2为对照，存活率都在50%以上。

2.2.2蛋白酶对三株乳酸菌存活率的影响

由表8可知，在加有胰蛋白酶的培养基中，随着时间的推移，乳酸菌LB-1，LB-2，LB-3的存活率基本上无变化，因此，可以判断，胰蛋白酶对3菌株没有影响。

表5.不同pH值对LB-1菌存活率的影响单位：

CFU/mL

时间/h

pH

2.0

3.0

4.0

5.0

6.2（对照）

7.0

8.0

9.0

10.0

0h

1.09×106

4.36×107

5.12×107

1.04×108

1.65×108

2.23×108

1.44×108

1.31×108

1.02×108

1h

1.82×105

2.88×107

4.16×107

7.76×107

1.44×108

2.23×108

1.04×108

9.54×108

2.07×107

2h

9.12×103

3.31×107

3.63×107

1.31×108

1.94×108

2.39×108

1.41×108

1.38×108

3.54×107

3h

1.05×103

5.37×107

6.16×107

2.29×108

2.63×108

3.31×108

1.81×108

1.81×108

9.77×107

4h

489

6.45×107

7.41×107

3.63×108

3.09×108

4.89×108

1.73×108

1.73×108

2.18×106

表6.不同pH值对LB-2菌存活率的影响单位：

CFU/mL

时间/h

pH

2.0

3.0

4.0

5.0

6.2（对照）

7.0

8.0

9.0

10.0

0

1.09×106

1.95×106

4.17×107

1.05×108

2.29×108

3.02×108

1.15×108

1.15×108

1.02×108

1

3.31×103

7.76×105

2.82×107

7.24×107

1.79×108

2.29×108

1.00×108

9.77×107

6.92×107

2

1.02×103

4.27×105

3.31×107

9.55×107

1.95×108

2.69×108

1.51×108

1.45×108

3.31×107

3

4.37×103

1.05×106

7.24×107

1.45×108

2.69×108

3.89×108

1.86×108

1.41×108

8.91×106

4

4.90×103

1.62×106

7.76×107

1.78×108

4.68×108

5.75×108

2.82×108

1.82×108

2.09×106

表7.不同pH值对LB-3菌存活率的影响单位：

CFU/mL

时间/h

pH

2.0

3.0

4.0

5.0

6.2（对照）

7.0

8.0

9.0

10.0

0

1.26×106

1.41×106

3.47×107

4.68×107

2.29×108

1.05×108

1.55×108

1.41×108

1.00×108

1

1.23×105

1.05×106

2.24×107

2.88×107

1.78×108

9.12×107

1.05×108

1.15×108

5.62×107

2

9.55×103

9.12×105

2.88×107

3.31×107

2.63×108

1.02×108

1.45×108

1.41×108

2.04×107

3

389

1.02×106

4.07×107

7.08×107

3.39×108

1.74×108

1.66×108

1.58×108

6.17×106

4

63.0

9.77×105

4.90×107

8.13×107

4.90×108

2.14×108

2.45×108

2.29×108

1.05×106

2.2.3高温对乳酸菌存活的影响

由表9可知，乳酸菌LB-1，LB-2，LB-