电泳纯度非还原型SDSPAGE测定标准操作规程.docx

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电泳纯度非还原型SDSPAGE测定标准操作规程

细胞因子电泳纯度（非还原型SDS-PAGE测定标准操作规程依据：

《中华人民共和国药典》2005年版第三部。

范围：

适用于细胞因子纯度的检测。

目的：

检测细胞因子蛋白质纯度。

原理：

蛋白质具有不同的电荷和分子量，在经过阴离子去污剂SDS处理后，蛋白质分子上的电荷被中和，在聚丙稀酰胺凝胶电泳时，不同的蛋白质按照其分子量大小进行分布，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量。

由于不连续的PH梯度作用，样品

被压缩成一条狭窄区带，采用染色液染色，经扫描仪扫描胶片可及时观察结果。

内

容：

1材料

1.1样品:

经二人复核批号无误后检测

1.2试剂

甲醇CH

3

OH分析纯

无水乙醇CH3CH

2

OH分析纯

浓盐酸HCI分析纯

甘油C3H

O

3

分析纯

硝酸银AgNO

3

分析纯

重铬酸钾K2Cr

2

O

7

分析纯

正丁醇C4H

9

OH分析纯

甲醛HCHO分析纯

丙烯酰胺CH2CHCONH

2

分析纯

甲叉双丙烯酰胺（CH2CHCONH

2

2

CH

2

分析纯

过硫酸铵（NH4

2

S

2

O

8

分析纯

TEMED（四甲基乙二胺（CH3

2

N（CH

2

2

N（CH

2

分析纯

甘氨酸C2H

5

NO

2

分析纯

SDS（十二烷基硫酸钠C12H

25

O

4

SNa分析纯

乙酸CH

3

COOH分析纯

碳酸钠Na2CO

3

分析纯

溴酚蓝C19H

10

Br

4

O

5

S分析纯

1.3注射用水：

符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。

1.4设备

1.4.1扭力天平上海第二天平仪器厂

1.4.2垂直板状电泳槽北京东方仪器厂

1.4.3恒温恒流电泳仪法玛西亚公司

1.4.4快速电泳槽BIORADUSA

1.4.5全自动扫描仪CS-930日本岛津

1.4.6TS-1型摇床

1.5器皿:

500ml瓶、100ul移液器、1ml吸管、10ml吸管3000ml三角瓶、平

皿、1000ml烧杯、80ml烧杯，以上器皿经本室洗刷组处理。

2方法

2.1准备工作

2.1.1工作环境：

控制区，确认场地清场合格，摘下清场合格”标志牌,挂上使用中”标志牌。

2.1.2调试仪器设备

2.1.2.1恒温恒流电泳仪工作状态良好，已经挂备用”标志牌。

2.1.2.2全自动扫描仪工作状态良好，已挂备用”标志牌。

2.1.2.3扭力天平工作状态良好，已挂备用”标志牌。

2.1.3摘下扭力天平备用”标志牌，挂运行中”标志牌。

2.1.4配液:

以下溶液的配制完成后，均需经二人复核无误后，在瓶外贴标签，注明溶液的名称、浓度、体积、批号及配制日期。

2.1.4.1聚丙烯酰胺凝胶母液100ml

用扭力天平准确称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g力卩50ml注射用水溶解后定容至100ml，过滤，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4C冰箱放置。

一般不超过1~2个月。

2.1.4.2分离胶缓冲液100ml

用扭力天平准确称取Tris18.15g溶于80ml注射用水中，溶解后,加浓盐酸调节pH8.8,补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液

的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4C冰箱放置。

2.1.4.3浓缩胶缓冲液100ml

用扭力天平准确称取Tris6.05g溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调pH6.8,补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4C冰箱放置。

2.1.4.41%SDS50ml

用扭力天平准确称取SDS0.5g溶于50ml注射用水中，溶解后,置于棕色瓶中，二人复核，贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温保存。

2.1.4.51%TEMED50ml

用吸管准确吸取TEMED0.5ml,溶于50ml注射用水中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4C冰箱放置。

2.1.4.61%过硫酸铵50ml

用扭力天平准确称取过硫酸铵0.5g溶于50ml注射用水中，二人复核，贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4C冰箱放置。

2.1.4.7电极缓冲液3000ml

用扭力天平准确称取Tris9g、甘氨酸43.2g、SDS3g,溶于2000ml注射用水中，补加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。

2.1.4.8固定液500ml

用量筒准确量取甲醇250ml，乙酸50ml，补加注射用水至500ml，置于500ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。

2.1.4.9洗液3000ml

用量筒准确量取无水乙醇300ml，乙酸150ml,补加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期,

常温贮存。

2.1.4.10重铬酸钾溶液200ml

用扭力天平准确称取重铬酸钾10g力卩注射用水至200ml;加浓HNO

2ml摇匀溶解,置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制

日期，常温保存。

2.1.4.11硝酸银溶液200ml

用扭力天平准确称取硝酸银0.4g加注射用水至200ml，置于棕色瓶中，避光保存二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，限当次试验使用。

2.1.4.12显色液3000ml

用扭力天平准确称取Na2CO

3

18g,加注射用水至3000ml,溶解后,加0.6ml甲醛,

置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。

2.1.4.13终止液500ml

用吸管准确吸取乙酸5ml，溶于500ml注射用水中，置于500ml瓶中,二人复核,贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。

2.1.4.14样品处理液（非还原型10ml

用扭力天平准确称取Tris0.303g、SDS0.8g、溴酚蓝0.189g溶于2ml注射用水中，加入甘油4ml,浓HCl0.189ml,加注射用水定容至10ml，二人复核，贴签,标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4C冰箱放置。

4C贮存。

2.1.5样品准备:

将样品自冰箱内拿出，放置室温融化后，将样品与样品处理液按

3:

1（V/V的比例混匀，沸水处理3~5分钟,待用。

2.2操作过程

2.2.1.1分离胶（13.5%制备

聚丙烯酰胺胶母液14.4ml,分离胶缓冲液8ml,1%SDS3.2ml，注射用水3.2ml,

1%过硫酸铵1.6ml,1%TEMED1.6ml,制成胶量32ml。

2.2.1.2浓缩胶（4.5%的制备

聚丙烯酰胺凝胶母液2.4ml,,浓缩胶缓冲液4ml,注射用水4.8ml,1%SDS1.6ml,

1%过硫酸铵1.6ml,1%TEMED1.6ml,pH6.8,成胶量16ml。

2.2.1.3灌胶

灌胶时先将电泳槽阳极侧用透析纸包上，在电泳槽内加满水，靠水压封住阳极侧缝隙，以免胶溶液漏出；在两玻璃板间加分离胶，加胶完毕后，用注射器沿玻璃板在液面上覆盖一层（约0.3cm高正丁醇;待胶凝固后，将电泳槽内注射用水及

胶表面的正丁醇倒掉，并用滤纸吸干；向电泳槽内加入电极缓冲液、在浓缩胶位置插上梳子,在分离胶上加浓缩胶，待胶凝固后抽去梳子。

2.2.2加样：

将处理后样品按每孔不少于5ug的蛋白量,加入样品槽内.2.2.3电泳：

打开电泳仪，摘下备用”标志牌，挂运行”标志牌，调定电流，起始电流15mA,待指示线跑至分离胶处，改电流为25mA，电泳时间约为2.5小时，待指示剂至底线处，停止电泳，关闭电泳仪，摘下运行”标志牌，挂备用”标志牌。

2.2.4染色

电泳完毕后取下胶片，置于5倍胶体积的固定液内12h（或室温振荡30分钟；洗液洗三次，每次10分钟，37E摇床内振荡；取5ml重铬酸钾母液加入200ml注射用水中,将胶片置其中，避光，振荡10分钟;用注射用水洗数次至黄色本底变白；加入新配制的0.2%AgNO

3

溶液白炽灯下照射30分钟;水洗五次；显色液500ml中加甲醛0.35ml，待样品蛋白带及分子量蛋白带清晰后弃去显色液加入终止液。

2.2.5扫描

2.2.5.1打开扫描仪，摘下备用”标志牌，挂上运行”标志牌。

2.2.5.2对胶片进行扫描，同时记录下扫描结果。

2.2.5.3关闭扫描仪，摘下运行”标志牌，挂备用”标志牌。

2.2.6摘下场地使用中”标志牌，挂待处理”标志牌。

3结果判定

3.1判定标准：

染色后胶片经扫描仪扫描，样品蛋白带含量应在95%以上,二聚体量不超过

5%。

3.2判定结果填写记录。

4清场

4.1需要低温贮存的液体放入冰箱，避光的液体放入阴暗处。

4.2称药之后将药品瓶盖盖紧，放回药品柜

4.3关闭扭力天平，清洁干净后放回原处，挂备用”标志牌

4.4清洁工作台面，用专用抹布擦净，地面用专用拖布拖净。

4.5用过的玻璃器皿用纯化水冲洗干净后返回洗刷组。

4.6填写清场记录。

4.7清场后由车间工序负责人或质量监督员检查合格后，摘下待处理”标志牌,挂清场合格”标志牌。

5注意事项5.1本实验所用SDS需高纯度SDS,如不纯需重结晶。

5.2样品必须经沸水处理3-5分钟，以免有亚稳聚合物存在。

附:

SDS-

PAGE（快速电泳准备工作同前。

1制胶1.1分离胶制备：

（13.5%）聚丙烯酰胺凝胶母液7.2ml,分离胶缓冲液4ml,1%SDS3.2ml,注射用水1.6ml,1%过硫酸铵0.8ml,1%TEMED0.8ml，制成胶量16ml。

1.2浓缩胶的制备（4.5%聚丙烯酰胺凝胶母液1.2ml,浓缩胶缓冲液2ml,注射用水2.4ml,1%SDS0.8ml,1%过硫酸铵0.8ml,1%TEMED0.8ml,pH6.8，成胶量8ml。

1.3灌胶：

先将分离胶液加入制胶器内，上面加一薄层正丁醇，待胶凝固后，在浓缩胶位置上插梳子，在分离胶

上加浓缩胶，待胶凝固后抽去梳子。

2预电泳：

打开电泳仪，摘掉备用”标志牌，

挂上运行”标志牌。

恒定电压200V，时间30分钟。

3上样将处理后样品按每孔不少于5ug的蛋白量，加入样品槽。

4电泳恒定电流40mA，电泳时间1h。

指示剂至底线处，停止电泳。

关闭电泳仪，摘下运行”标志牌，挂备用”标志牌。

其

余步骤同前。