气道上皮细胞屏障对免疫应答的调控.docx
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气道上皮细胞屏障对免疫应答的调控
气道上皮细胞屏障对免疫应答的调控
翻译：
冼明海广东医科大学附属高州市人民医院
郝星首都医科大学附属北京安贞医院
审校：
郝星首都医科大学附属北京安贞医院
周荣华四川大学华西医院
摘要
气道内的细胞群落在维持肺部免疫稳态方面起着协同作用，并使我们在呼吸时免受空气中病原体和污染物的侵害。
气道上皮细胞除了具有结构特性，可以有效地清除下呼吸道的粘膜纤毛外，还具有免疫活性，可以感知气道环境的变化并与免疫细胞发生相互作用。
单细胞RNA测序揭示了气道壁中存在的细胞异质性，并鉴定出具有独特分子特征，分化轨迹和在健康与疾病中具有多种功能的新型细胞群。
在这篇综述中，我们讨论了随着细胞表型转录组学方法的发展，我们对气道上皮结构功能的看法是如何演变的，并重点关注上皮与局部神经元和免疫系统的相互作用。
前言
目前，公认的是，气道内的细胞不仅仅是构成外部环境与下层间充质之间的屏障。
这些特殊的上皮细胞集合对克服粘膜纤毛屏障的微生物和有害刺激做出反应，是宿主防御的重要组成部分，与免疫系统细胞相互作用，以维持稳态，并在必要时促进免疫反应。
呼吸道上皮细胞还必须对吸入环境中所含的多种毒素做出反应，并且越来越多的证据表明上皮功能障碍是影响多种肺部慢性疾病的驱动因素。
传统观点认为，上皮细胞由基底细胞与分泌细胞和纤毛细胞紧密结合而成，形成一个紧密的单元，既维持物理屏障，又能通过免疫系统的细胞和分子对吸入的环境作出反应。
但是，随着先进测序技术的出现，这种观点已转变为一种动态细胞结构，其中包含了多种高度专业化的细胞，这些细胞能够对环境变化做出反应，与常驻微生物群落相互作用，并与其他多种专业化细胞系统合作，例如免疫系统和神经系统。
呼吸道是一个复杂的器官系统，分为上呼吸道，包括鼻腔，咽，喉；下呼吸道包括传导气道（气管，支气管和细支气管）和呼吸区（呼吸性细支气管和肺泡）（图1）。
每个区域都有特定的功能，细胞组成的区域差异反映了这一点。
从鼻腔到肺泡的整个呼吸道都有特定的上皮细胞群。
精细的电子显微镜研究为人类气道中主要上皮细胞类型的形态和超微结构提供了早期的认识。
除了使用经典的电子显微镜定义的形态学特征外，细胞类型特异性标记物的标准免疫组织化学染色已经用于表型和量化整个呼吸道中的上皮细胞群，从而确定解剖位置对细胞组成的影响。
呼吸道由纤毛和分泌细胞排列组成，主要用于促进黏膜纤毛清除空气中的颗粒物和感染源。
像其他粘膜表面一样，气道上皮与环境直接接触，因此对宿主防御至关重要。
尽管与肠道粘膜具有相同的胚胎起源，但气道粘膜表面的免疫学活性必然是独特的，并受环境条件（温度梯度、双向气流），常驻微生物群落和空气中抗原差异的影响。
尽管不是本综述的重点，但位于肺远端肺泡区域的上皮细胞在表型和功能上也是不同的。
肺泡上皮1型（AT1）细胞为气体交换提供了特定的表面，而2型（AT2）细胞分泌了肺表面活性物质，以防止呼气时肺泡塌陷。
在每个解剖部位中，都有祖细胞群，例如气道中的基底细胞和肺泡中的AT2细胞，这些细胞群可维持稳态条件和损伤后上皮细胞的再生。
图1|修订后的scRNA-seq捕获的人气道上皮细胞库。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）改变了人们对呼吸道上皮细胞的传统观点，包括上呼吸道和下呼吸道的上皮细胞。
修订后的具有新鉴定的细胞类型，例如离子细胞和不同的细胞状态。
气道内的细胞组成和细胞状态是根据解剖位置（近－远轴）和疾病存在有否而变化的。
根据肺段的不同，用于获取人体样本进行测序的方法也有所不同。
采集人气道上皮细胞的主要方法是在支气管镜检查期间进行支气管灌洗和支气管内活检，这与通过手术活检或外植体获得的肺实质组织采集肺泡区域相反。
BAL，支气管肺泡灌洗。
新型测序技术的出现不仅促进了新型细胞类型的鉴定，而且揭示了先前命名但知之甚少的细胞类型（例如簇/刷细胞）的潜在功能。
也有迹象表明存在异质细胞类型和状态，并且其细微变化将受到环境变化的影响，例如，吸烟或暴露于过敏原或污染物。
现在清楚的是，气道壁代表着一个动态的上皮细胞“群落”，与常驻的免疫细胞和神经元细胞紧密结合，形成一个整体的单元，在维持粘膜免疫稳态以及促进宿主防御吸入病原体方面发挥关键作用。
在这篇综述中，我们概述了如何使用单细胞转录组技术来绘制气道上皮的特征，以及其如何突出了新型特异上皮细胞的功能，以及它们如何与免疫和神经元系统细胞相互作用来调节气道免疫。
绘制气道上皮特征
单细胞RNA测序（scRNA-seq）改变了我们对气道上皮的认识，揭示了一定程度的细胞多样性，而这种多样性在显微镜观察下尚未证实。
这项技术可描述单个细胞的转录组，因此有助于对异质细胞群中不同细胞亚群的无偏特性进行描述，推动对既往未鉴定的细胞类型和状态的新发现。
人类细胞图谱协会的目标是通过整合空间数据，以单细胞分辨率全面绘制健康和疾病状态下的肺细胞组成和分子表型变化。
此外，利用已知的配体-受体相互作用，也可以计算出气道壁中上皮-免疫的相互作用。
利用单细胞转录组学研究人类上皮细胞生物学依赖于肺组织的可获取性。
一项针对人体的最早研究分析了特发性肺纤维化（IPF）患者的病变外植体实质肺组织和不适合移植的供体的肺叶作为对照组织。
对于人类气道上皮的研究，可以通过在常规临床护理的范围内进行纤维支气管镜检查来获取疾病状态下的支气管刷和支气管内活检样本。
值得注意的是，细胞含量因所使用的采样方法而异，这将影响通过scRNA-seq所获得的细胞簇（图2）。
获取年龄匹配的健康对照样本更具挑战性，因为这需要研究志愿者接受侵入性手术。
只有通过临床医生和科学家之间的密切合作以及通过人体组织生物库，才能获得合适的人体肺组织。
重要的是，需要仔细考虑样本运输的实际情况，因为组织的低温保存和从诊所中采集新鲜样本到实验室处理的最短的时间延迟对于确保高质量的scRNA-seq数据至关重要。
冷缺血72h后，多种类型的肺细胞由于细胞应激或死亡，导致线粒体计数增加，且CD4+和CD8+细胞毒性T细胞的细胞特异性比例下降。
组织用胶原酶的酶解作用被广泛用于分离用于scRNA-seq研究的细胞，但需要注意的是，它可以诱导早期基因的表达，包括Fos和Jun以及热休克蛋白（HSP）基因的亚群。
因此也可能在单细胞数据库中引入一些重要的人为因素和潜在偏差。
在scRNA-seq分析过程中，共享相似基因表达谱的细胞聚集在一起，并可根据已知的标记基因进行注释（表1）。
在第一个对哺乳动物气道的单细胞研究中，发现了一种新的细胞簇，它不与任何先前已知的上皮细胞类型相对应，根据其基因表达特征，被称为“肺离子细胞”。
这个新细胞类型的发现凸显了scRNA-seq的强大作用（表1,2）。
集群下的亚群可用于识别特定细胞类型簇内的不同细胞状态。
在气-液平面培养物中分化的人鼻上皮细胞进行的单细胞分析显示，表达FOXJ1的多纤毛细胞前体亚群称为“体细胞”，其表达特定基因，包括DEUP1（也称为CCDC67），FOXN4和CDC20B，这些对于中心粒细胞扩增和纤毛生成至关重要。
还可通过scRNA-seq在健康的人类呼吸道中鉴定出氘核细胞。
在人类气道中，通过差异标记基因表达的基底细胞、杯状细胞和纤毛细胞之间细微但不同的分子状态已经被描述。
杯状细胞根据其独特表达的基因可分为两个亚群；例如，鼻上皮中的“杯状2”细胞具有与免疫细胞募集有关基因的较高表达，例如CXCL10，IL19和CSF3。
呼吸道细胞群的解剖学起源在控制其转录特征和细胞状态中起着重要作用。
一项对取自健康受试者四个不同解剖部位的毛刷和活组织切片的单细胞研究，显示了鼻腔和气管支气管腔室之间上基底细胞、分泌细胞和纤毛细胞的区域特定亚群。
同一类型细胞之间基因表达谱的空间变化部分与特定气道位置所需的生物学功能有关。
鼻上皮细胞中的分泌细胞富含与细胞运动、分化和感觉通路相关的基因集，而在支气管树中，它们富含与先天免疫和伤口愈合应答通路相关的基因。
值得注意的是，由于基因表达特征的重叠性，在单细胞研究中对分泌细胞类型（包括球状细胞和杯状细胞）的注释不一致。
图2|气道的单细胞转录组学研究。
对于下呼吸道的人类单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究，采用支气管镜获得支气管肺泡灌洗液（BAL）、气道壁刷检和支气管内活检。
起始物质决定被测序的气道免疫细胞，上皮细胞和基底细胞的相对贡献。
通过灌洗和活检的酶解获得可行的单细胞悬液。
生物信息学管道通过降维和可视化技术（例如统一流形近似和投影（UMAP））生成独特的细胞簇，并有助于基于细胞标记基因的簇群注释。
在健康和疾病中可以确定新的细胞簇和细胞状态，并且可以使用轨迹分析来研究动态的、分化的细胞类型。
通过收集比较健康志愿者的细胞与呼吸系统疾病患者的细胞，进一步揭示了气道上皮细胞状态的决定因素。
对轻中度哮喘患者的气道壁进行活检分析后，发现了健康气道中未发现的几种细胞状态。
共同表达纤毛细胞的基因标记物，包括FOXJ1和杯状细胞基因（如MUC5AC），被称为“粘液纤毛细胞”，并被认为代表哮喘中IL-4/IL-13信号驱动的新型过渡细胞状态。
一项对IPF（一种进行性疤痕形成性肺病）患者的实质肺组织的单细胞分析在纤维化远端肺组织发现了以前未知的、转录独特的细胞簇，这些细胞表达出部分的气道基底细胞标志物。
这些有趣的“异常基底”细胞，即KRT5-KRT17+，共同表达编码间质标志物的基因，如胶原1型α1链（COL1A1），转录因子SOX9（在远端气道发育中起作用）和与IPF发病相关的基因，包括编码基质溶素的MMP7。
肺上皮细胞是一个动态的细胞群落，单细胞转录组学在连续的分化过程中捕获了处于不同阶段的细胞的独特功能。
这一特征首次被用来阐明小鼠肺泡发育四个不同阶段的上皮谱系层次。
随着scRNA-seq生物信息学方法的改进，研究人类样品中的细胞命运并揭示人类气道上皮细胞分化的微妙之处已成为可能。
可以通过轨迹推断算法在计算上利用伴随着每个细胞分化的转录变化，该算法根据细胞沿其各自轨迹的进展对细胞进行排序，并以“伪时间”进行量化。
气液界面培养中鼻气道上皮细胞的伪时间分析表明，杯状细胞可以作为纤毛细胞的前体，并且在这种分化轨迹的背景下可以发现FOXJ1+MUC5AC+细胞。
此外，利用每个基因的未剪接和剪接的mRNA的相对丰度，有可能估计基因表达变化的速率，称为“RNA速度”，并预测未来的细胞状态。
利用扩散图方法对细胞进行伪时间排序，在小鼠气道中发现了一种有趣的表达krt13的细胞群，它们是球状细胞分化的基础。
移行细胞排列成离散的、分层的、高周转率的结构，称为“小丘”，表达与鳞状上皮分化、细胞粘附和免疫调节相关的基因。
scRNA-seq在细胞水平上绘制的全面转录组学信息提高了我们对稳定状态下气道上皮的认识。
该技术也已被用于研究COVID19重症患者的气道样本，以便更全面的了解急性呼吸系统冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染的发病机制。
从人类细胞图谱协会整理的数据集中研究多种组织类型中的单细胞基因表达，与SARSCoV2细胞进入相关的基因，即编码病毒进入受体的ACE2和TMPRSS2，显著富集于鼻分泌和纤毛上皮细胞中。
值得注意的是，包括角膜、结膜、小肠和结肠在内的其他粘膜表面细胞中ACE2的高表达可能与鼻腔的高表达相结合，解释了SARS-CoV-2的高传播性。
这说明了如何利用现有数据来进一步了解新出现疾病的发病机制。
罕见上皮细胞类型的功能
基底细胞是多能干细胞，占所有气道上皮细胞的三分之一，并在上皮屏障的稳态维持和损伤应答的再生过程中产生其他主要亚群，例如分泌细胞和纤毛细胞。
基底细胞锚定在传导气道的基底膜上，并表达角蛋白5（KRT5）和转录因子肿瘤蛋白p63（TP63）。
谱系追踪和单细胞转录研究表明，气道中存在不同功能的基础细胞亚群。
上呼吸道和下呼吸道存在两种离散的基底细胞状态，但在上呼吸道的基底细胞频率较低。
这些细胞状态反映了基底细胞不同的分化阶段，与未成熟的基底细胞相比，成熟的基底细胞（位于更顶端的区域）表达的TP63和NPPC水平更低。
Deprez等人将TP63表达较低、KRT19和NOTCH3表达较高的基底细胞注释为“基底上”细胞。
除这些主要细胞类型外，通过详细的单细胞转录组学分析，还发现了一些罕见的细胞群，它们的数量少于人类气道上皮细胞总数的1％。
尽管不常见，但这些细胞似乎具有非常独特的表型，并执行特定的作业，对上皮结构和功能的有效运作和维护至关重要。
表1：
未回答的问题
单细胞转录组学领域为人类气道中存在的细胞群落提供了一种变革性的高清视图，但也为研究界带来了许多未解决的问题。
•当代单细胞景观中的细胞如何反映传统显微镜检测到的细胞？
从单细胞scRNA测序获得到的数据完善了我们对既往描述的气道细胞类型（例如簇细胞）的表征，并导致发现了一个先前未描述的细胞—“离子细胞”。
1994年的电子显微镜研究报告了“不确定类型的细胞”，并且在最近的单细胞数据集中仍然存在未定义的细胞簇。
因此，未来的工作必须集中于更好地研究这些细胞类型，以及确定它们在健康和疾病期间在气道壁内的空间关系。
•我们应该在多大程度上重视发现丰度低的细胞簇或特定细胞类型的亚簇?
除了通过免疫荧光显微镜确认特定细胞类型的存在外，为了真正带来重力和生物学意义，还需要通过实验证明功能上的差异。
接下来的挑战是在人类健康和疾病的背景下解释这些发现。
•我们如何解释少数研究对象中，人类样本与细胞团簇之间固有的生物学变异性？
一种提供更大透明度的方法是显示单个受试者的细胞组成和集群，以及那些被疾病整合的细胞。
•我们如何调整细胞识别分配的差异？
在定义特定细胞类型的特定阳性和阴性标记基因上必须达成共识，因为在细胞类型和亚群的注释上存在差异。
任何新的分类方案都应考虑到气道细胞解剖来源的一致性和确定性。
•细胞图谱绘制传统上依赖于实验小鼠的使用，但目前各种计算工具允许从人类单细胞数据推断细胞轨迹。
据报道，基底细胞与罕见细胞类型（簇细胞，肺神经内分泌细胞和离子细胞）之间的谱系关系存在差异，这可能反映了所研究的物种（小鼠与人类），使用的模型和/或轨迹算法，但也强调了在人类样本中进一步验证的必要性。
丘样细胞（Hillockcells）
scRNA-seq的出现使研究人员能够研究细胞发育的轨迹。
除了基底细胞，棒状细胞和纤毛细胞之间的联系外，Montoro等人还定义了一种独特的轨迹，通过特异表达Krt13和Krt4的新型过渡细胞将气管基底细胞和棒状细胞连接起来。
通过观察这些细胞在肺部中的位置以及在小鼠体内中的谱系追踪，作者注意到Krt13+细胞位于不包含管腔纤毛细胞的连续分层细胞群中。
他们将这些分组称为“小丘”，一种由位于Trp63+Krt13+基底细胞顶部的管腔Scgb1a1+Krt13+细胞组成的结构，其中Trp63的表达沿着基底细胞上的梯度分布。
重要的是，小丘包含大量的循环细胞，并表达了细胞粘附和上皮分化的标志物，以及与屏障功能和免疫调节有关的基因。
Plasschaert等人的研究证实鼠气管和离体分化的人基底上皮细胞中存在着一个独特的Krt13+Krt4+细胞群体，尽管他们得出的结论是，这个群体代表之间的一个中间人口基底干细胞和分化细胞腔的分泌细胞。
此外，Krt13+Krt4+表达细胞在多酚诱导的小鼠气管上皮损伤后1天出现。
在人类中，KRT13通过“循环”基底细胞亚群在气道上皮中表达，其特征是表达与细胞增殖相关的基因，包括MKI67（编码Ki67）。
需要进一步的分析来确认小丘是否代表了一个真正独特的生态位而不是过渡中的化生带，并确定它们的起源和目的。
实际上，尚不清楚这些结构是否存在于整个气道中或局限于气管。
为了证明它们的存在，Deprez等人描述了一群KRT13+细胞，其中很大一部分在鼻甲中循环，这表明丘样细胞可能存在于人类呼吸道的其他区域。
表2：
小鼠气道上皮的生态模型
本综述的重点是人类气道的上皮特征。
然而，我们对上皮细胞功能及其与免疫细胞相互作用的大部分认识是来自实验室小鼠的实验研究。
正因如此，我们强调了小鼠和人类气道之间细胞组成和结构的近-远端变化以及差异。
在小鼠中，基底细胞主要局限于气管和近端支气管，而在人类中，基底细胞则遍布整个气道。
在人类中，分泌粘液的杯状细胞是近端气道中最丰富的分泌细胞类型，但在成年小鼠中，这些细胞相对较少，而棒状细胞占主导地位。
粘膜下腺位于管腔表面下方，并分泌粘液和其他抗菌因子到气道中，但也充当含有肌上皮基底细胞的干细胞环境。
在小鼠中，粘膜下腺位于喉和气道近端，但在人类中，它们分布在整个软骨气道。
小鼠气管的假复层纤毛上皮类似于整个人气道中发现的纤毛。
因此，有人认为这可能是研究可翻译人类气道上皮细胞生物学的一个相关的领域。
为了支持这一概念，在人类气道的研究中已经概括了小鼠气管上皮细胞的一些单细胞发现，包括肺离子细胞的发现。
除气管外，小鼠气道上皮转变为由纤毛、分泌（球状）和肺神经内分泌细胞簇组成的简单柱状上皮，从而模拟了人类最远端气道的组成。
小鼠模型是生物医学研究必不可少的工具，彻底改变了我们对免疫学的认识。
但是，值得注意的是，小鼠和人类免疫系统之间存在重要差异。
小鼠生活环境的差异，特别是微生物接触史，对其免疫细胞库有深远的影响。
例如，与成年人类或宠物鼠相比，在特定的无病原体环境中饲养的实验室小鼠缺乏分化的记忆CD8+T细胞亚群。
这些关键的环境差异深刻影响了肺部免疫系统的发展，继而影响了与局部上皮组织的相互作用。
簇状细胞（Tuftcells）
呼吸道包含几组化学感觉上皮细胞，它们协调与外部环境的相互作——肠内分泌细胞和簇状细胞（也称为“刷状”细胞）。
这些化学感觉上皮细胞与味觉细胞有相似性，预计会引起免疫细胞和神经元细胞的阳性和阴性反应。
它们具有独特的形态，呈瓶状，顶端有微绒毛，并在肠道和呼吸道在内的多种器官中表达。
它们存在于肠道中，被认为是由饮食代谢产物如琥珀酸和细菌产物（例如，群体感应内酯或脱氢氨基酸）触发的。
相比之下，它们在肺中的作用还不确定，但已在鼻子，气管和近端气道中被发现，并与神经纤维紧密接触，介导神经元和免疫途径之间的通信。
但是，它们不是普遍可识别的。
实际上，VieiraBraga等人在使用支气管灌洗和支气管内活检对人类气道进行scRNA-seq分析时，无法识别出一种独特的簇状细胞群。
这可能反映了这些细胞的罕见性，也许反映了用于收集气道样本的方法。
簇状细胞表达一系列指示性标记物，包括POU结构，2类，转录因子3（POU2F3），它被认为是簇状细胞特异性的谱系定义转录因子，以及瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员5（TRPM5）。
目前，scRNA-seq已识别出两个终末分化阶段的Trpm5+簇状细胞群；一个对Gng13呈阳性，可能负责“味觉”的感知，另一个对Alox5ap呈阳性，表明它有助于白三烯的合成。
簇状细胞被认为可以通过ATP传感器P2Y2生成半胱氨酸白三烯。
尽管通常以少量存在，但通过激活半胱氨酰白三烯途径吸入常见的空气变应原后，气管中的簇状细胞会发生扩增。
内源性生成的白三烯E4通过CysLT3R感知，调节小鼠气道刷状细胞的数量和功能。
因此，簇状细胞能够通过不同受体的组合表达来响应多种信号。
簇状细胞被认为能促进保护性呼吸反射，例如打喷嚏，但也可导致呼吸暂停以及粘膜的局部神经源性炎症。
鉴于簇状细胞的分布和功能，也被称为“孤立的化学感觉细胞”，增强局部神经元系统提供的化学反应性保护。
scRNA-seq分析显示小鼠簇状细胞表达高水平的胆碱能和苦味信号转录物（Tas2r108,Gnat3,Trpm5）。
用2型苦味受体（TAS2R）配体地那铵或喹诺酮类假单胞菌群体感应分子刺激气管丛细胞释放乙酰胆碱，增加TRPM5和M3毒蕈碱乙酰胆碱介导的粘膜纤毛清除率及纤毛细胞的钙释放。
据推测，从革兰氏阴性致病菌中检测到这些群体感应分子可提供一种机制，通过该机制上皮细胞可触发辣椒素敏感性神经纤维，释放降钙素基因相关肽（CGRP）和P物质，从而促进先天免疫级联反应和微血管漏出，还可以抵抗细菌入侵，从而限制了能够形成破坏性生物膜的种群密度。
具有簇状细胞特性的孤立性化学感应细胞被发现是患有鼻息肉的慢性鼻窦炎患者中IL25的主要上皮来源，其有助于II型固有淋巴细胞（ILC2s）的活化和IL13的产生，从而维持上呼吸道II型环境。
簇状细胞一旦激活，便可以释放神经递质（例如乙酰胆碱），参与白三烯和前列腺素生物合成的二十烷类化合物和ATP，以及细胞因子，如IL-25和胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）。
所有这些介体均与过敏性炎症有关，能够通过表达特定受体诱导ILC2活化和累积。
离子细胞（Ionocytes）
对小鼠气管上皮细胞和分化的人类气管上皮细胞进行单细胞转录组学研究，发现了一个新的细胞簇，称为“肺离子细胞”，这是由于其基因表达谱与非洲爪蟾幼虫皮肤粘膜纤毛上皮的离子转运细胞相似。
与非洲爪蟾一样，离子细胞表达编码V-ATPase质子泵亚基基因，该亚基调节离子运输和pH值。
确定小鼠和人上皮细胞离子细胞谱系的关键因素是FOXI1，它属于转录因子的子家族。
在基因敲除小鼠和人类细胞培养物中的慢病毒研究表明，FOXI1调节CFTR基因的表达，该基因编码一种关键的氯离子转运体，在囊性纤维化中有缺陷或缺失。
囊性纤维化是一种致命性疾病，其特征是粘液粘度增加，粘膜纤毛清除能力受损，慢性感染和气道炎症，最终导致肺功能丧失。
离子细胞仅占人类气道上皮细胞的1-2％，但CFTRmRNA的富集程度高于其他任何类型的气道细胞。
将scRNA-seq与传统的在三个不同时间点的体内谱系追踪结合在一起的“脉冲序列”技术表明，基底细胞是离子细胞和其他罕见细胞类型的主要来源。
鉴于scRNA-seq数据集中的罕见细胞类型，Goldfarbmuren等人进一步研究了人类气管基底细胞中CRISPR-Cas9敲除系统中的罕见细胞谱系关系，以确定在分化过程中，离子细胞和肺神经内分泌细胞（PNECs）来自于POU2F3+簇状细胞。
肺神经内分泌细胞
PNECs是位于气管、支气管和细支气管表面上皮内的孤立细胞。
它们也可以在肺内气道中以神经内分泌体的形式存在。
PNEC作为气道的化学传感器，对氧气、拉伸和化学刺激的变化作出反应。
它们是引起免疫和生理效应的神经肽和神经递质的丰富来源。
PNECs是唯一受神经支配的跨物种保守的气道上皮细胞类型，仅占肺上皮细胞总数的1%。
据报道，它们是在发育过程中形成于肺上皮的最早的特殊细胞类型，并且被认为在早期生命中具有特别重要的功能，因为缺乏PNECs的新生小鼠可以免受过敏性炎症的影响。
体外分析预测PNECs在一系列活动中的作用，包括氧感应、维持支气管和血管平滑肌张力以及协调免疫反应。
然而，一系列突变小鼠的实验证实了PNECs的功能特性影响了一系列肺部疾病。
PNECs的一个决定性特征标记是基因Ascl1，它是PNECs形成所必需的转录因子。
缺乏Ascl1的小鼠在出生时死亡，但一种旨在使PNEC前体中的Ascl1失活的条件性敲除后可使完全缺乏PNEC的小鼠存活，表现为气道上皮细胞中缺乏CGRP+细胞。
这些Ascl1突变小鼠在基线检查时是正常的，但在围产期暴露于过敏原时，可以防止发生严重杯状细胞增生和II型炎症反应。
PNECs的缺失伴随着关键神经肽的减少，包括神经递质GABA。
基因roundaboud（ROBO）的表达对于PNECs聚集到神经内分泌体、限制免疫细胞浸润以及在出生后肺发育期间防止肺泡发育不良均至关重要。
尽管在Robo缺失的小鼠中PNEC在E15.5缺陷明显，但生理效应仅发生在出生后，这表明PNEC的效应依赖于第一次呼吸时对空气的物理暴露，从而进一步证实PNEC是吸入环境变化的传感器的观点。
相比之下，在成年小鼠中基因消融PNECs对气道内稳态或化学损伤后的修复没有影响。
在早期小鼠模型中，PNEC通过神经营养素4调节PNEC的神经支配和GABA的分泌促进Muc5ac的表达，从而促进过敏原暴露期间的粘液高分泌。
PNEC是灵长类动物肺和人类上皮细胞体外培养中GABA的唯一来源。
PNECs也与气道
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