新疆杏褪绿卷叶病病原鉴定园艺学报版浅论.docx

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新疆杏褪绿卷叶病病原鉴定园艺学报版浅论

新疆杏褪绿卷叶病植原体的分子检测与鉴定

韩冰1,何天明1,*,吴玉霞1，李文慧2

（1新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐，830052；新疆农科院轮台国家果树资源圃,轮台823000）

摘要：

褪绿卷叶病是一种潜在影响新疆杏产业的严重病害。

利用植原体通用引物R16mF2/R16mR1、P1/P7对新疆呈现褪绿卷叶症状的杏树总DNA样品进行PCR扩增，用R16F2n/R16Rn引物对进行Nest-PCR扩增并测序对引起新疆杏褪绿卷叶的病原进行了分子检测。

结果表明，经首轮PCR扩增，采自新疆的褪绿卷叶杏树样品并未扩增出目的片段；经巢式PCR扩增（Nest-PCR），新疆杏褪绿卷叶样品扩增出长1044bp的片段，经BLAST比对，为植原体16SrDNA基因片段，与引起枣疯病植原体的同源性最高，为99%以上。

经聚类分析，将其初步归入植原体16SrV组。

本研究首次从分子水平确定了引起新疆杏褪绿卷叶病症状的病原为植原体，初步明确了其分类地位，为该病害的流行病学研究和防治提供了理论依据。

关键词：

杏;褪绿卷叶病；植原体；16SrDNA

MolecularDetectionandIdentificationofaPhytoplasmaAssociatedwithApricotChloroticLeafrollDiseaseinXinjiang

HANBing1,HETian-ming1,＊,WUYu-xia,LIWen-hui2

（1CollegeofForestry＆Horticure,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,830052,China;2LuntaiNationalPomologyGermplasmGarden,AcademyofAgriculturalScienceofXinjiang,Luntai,823300,China）

Abstract:

Apricotchloroticleafroll（ACLR）isadangerousdiseasetoXinjiangapricotindustry.Nest-PCRassaywasperformedtodetectthepathogenofthediseasewithuniversalprimersR16mF2/R16mR1andP1/P7andR16F2n/R16Rn.Theresultshowednosegmentwasobtainedfromthediseasedsamplesbyfirstamplification.The16SrDNAof1044bpwasamplifiedbynest-PCRwithR16F2n/R16Rnforphytoplasma.ByBlastcomparison,themosthomologywasabove99%withthememebersofjujubewitches’-broom.Aphylogenetidtreewasconductedbasedonsequencesof16SrDNA.Ourresultssuggestedthatthephytoplasmasamplebelongedto16SrⅤgroup.AprioctchloroticleafrollphytoplasmawasfirstlyidentifiedbymolecularbiotechnologyandconfirmeditstaxonomicstatusinXinjiang,itprovidedatheoreticalbasisforresearchontheepidemiologyandcontrolofthedisease.

Keywords:

Apricot;Apricotchloroticleafroll;Phytoplasma;16SrDNA;

新疆是我国重要的杏产区，其栽培面积和产量均居全国首位（张大海，2010）近年来，在新疆个别杏园中出现了叶片褪绿卷曲症状，轻者在树冠下部或中部出现卷叶，重者全株叶片卷成筒状，直至整株萎蔫死亡，为新疆杏产业的发展带来极大的威胁（韩冰等，2011）。

类似症状在华北杏中也有报道（赵京民，1993）。

田间调查发现，发生在新疆杏产区的杏树褪绿卷叶性状与国际上报道的杏褪绿卷叶病（Apricotchloroticleafroll,ACLR）病症相似（韩冰　等，2011）。

ACLR是由植原体引起的一类植物病害，二十年来，有多位学者对于该病原体进行了流行病学和分子生物学研究（Bertaccinietal.,1997;Jarauschetal.,2007;Seemülleretal.,2004）。

我国学者李文慧等（2007）在田间调查的基础上，通过透射电镜在杏树叶脉切片中观察到了类似植原体病原体的存在。

仅靠上述田间症状调查和解剖学证据不足以确定新疆杏类似病症的病原为欧洲ACLR的病原ESFY，进一步通过分子生物学手段提供证据十分必要。

为此，本研究采用PCR分子检测的方法，采用植原体16SrDNA通用引物，对发病植株叶片总DNA的特异性片段进行扩增和序列分析，旨在从分子水平上对导致新疆杏褪绿卷叶的病原体进行鉴定。

1材料与方法

1.1材料

本研究于2010-2011年在新疆农科院轮台国家果树资源圃和新疆农业大学新疆特色果树研究中心完成。

供试的4个健康杏植株叶片样品和4个表现褪绿卷叶症状的杏叶片样品采自新疆轮台哈尔巴克乡和新疆农科院轮台国家果树资源圃，每株从东南西北中5个方位各采叶片10片，采后用自封袋迅速加硅胶干燥剂处理并长期保存备用。

阳性对照枣疯病（Jujubewitches-broom）叶片样品分别来自山东泰安及河北保定。

1.2方法

1.2.1杏树叶片和枣树叶总DNA提取

参照漆艳香等（2004）改良的植原体DNA提取方法，提取杏树叶片总DNA，用0.8%琼脂糖电泳检测。

提取好的DNA样品保存于-20℃冰箱中备用。

1.2.2PCR扩增及序列测定

根据Lee（1993）报道的16SrDNA引物对R16mF2/R16mR1及P1/P7扩增病原体的16SrDNA基因片段。

引物序列如下：

R16mF2:

5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′;

R16mR1:

5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′。

扩增片段长度约为1.5kb。

P1:

5′-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3′;

P7：

5′-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3′。

扩增片段长度约为1.8kb。

引物均由北京华大基因公司合成。

PCR反应均以杏树植株总DNA为模板，以具典型褪绿卷叶症状的杏单株作为处理，健康植株总DNA作为阴性对照，无菌双蒸水作为空白对照，以采自河北及山东的枣疯病样品作为阳性对照。

反应体系20μL，含有10×PCRBuffer2μL、10μmol/L上、下游引物各0.5μL、10mmol/LdNTP0.5μL、0.5μLTaqDNA聚合酶2.5U/μL（Tiangen公司）、1μL模板DNA、无菌水15μL。

R16mF2/R16mR1引物对PCR反应条件为：

94℃预变性6min，94℃变性1min，52℃复性45s，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸10min。

P1/P7引物对反应条件：

除退火温度改为56℃退火1min外，其余条件均相同。

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，经EB染色，用Alpha凝胶成像系统观察、拍照。

1.2.316SrDNA的Nest-PCR扩增

根据Lee（1993）等报道的Nested-PCR引物序列合成引物R16F2n（5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′）/R16R2n（5′-TGACGGGCGGTGTGTA-3′）。

利用此引物对，并以首轮PCR产物作为巢式PCR的DNA模板进行Nest-PCR扩增。

反应条件：

95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃复性45s，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸10min。

委托北京华大基因公司对未经纯化的PCR扩增产物进行测序。

1.2.4序列分析和系统进化树构建

利用国际基因数据库GenBank中的BLAST程序和BioEditor软件对测序结果进行同源性比对。

在NCBI数据库中选取有代表性植原体16SrDNA序列，采用CluxtalX1.8对所有序列进行完全比对，利用MEGA3.1软件，采用N-J法构建系统进化树。

2结果与分析

2.1杏树样品DNA的PCR检测

图1供试样品总DNA电泳图谱

bz1-bz7：

采自轮台国家果树资源圃的杏树卷叶样品；zc，小白杏正常样品；Lzf1、Lzf2：

采自山东的枣疯病样品；采自河北的枣疯病样品

Fig.1TotalDNAelectropheroticpattern

Bz1-bz7:

Apricotchloroticleafrollsamples;zc:

Negativecontrolsfromhealthyapricotplant;Lzf1、Lzf2:

Jujubewitches-broomsamplesfromShandong;Jzf3:

Jujubewitches-broomsamplesfromHebei

图2R16mF2/R16mR1与P1/P7两对引物扩增的PCR产物电泳图谱

1-11：

R16mF2/R16mR1引物对扩增产物；1-4：

新疆杏卷叶样品；5-6：

新疆杏健康样品；7-9：

采自山东及河北的枣疯病病株样品（阳性对照）；10：

采自山东的枣健康植株叶片样品；11：

灭菌双蒸水（阴性对照）；12-22：

P1/P7引物对扩增产物；12-15：

新疆杏卷叶样品；16-17：

新疆杏健康样品；18-20：

采自山东及河北的枣疯病样品（阳性对照）；21：

采自山东的枣正常样品；22：

灭菌双蒸水（阴性对照）;M：

DL2000Marker

Fig.2PCRamplificationof16SrDNAusingprimerpairsR16mF2/R16mR1andP1/P7

1-11：

AmplificationproductsofR16mF2/R16mR1；1-4:

Apricotchloroticleafrollsamples;5-6:

Negativecontrolsfromhealthyapricotplant;7-9:

Jujubewitches-broomsamplesfromShandongandHebei（Positivecontrol）;10:

HealthyJujubesamplefromShandong;11:

ddH2O;12-22：

AmplificationproductsofP1/P7；12-15:

Apricotchloroticleafrollsamples;16-17:

Negativecontrolsfromhealthyapricotplant;18-20:

Jujubewitches-broomsamplesfromShandongandHebei（Positivecontrol）;21:

HealthyjujubesamplefromShandong;22:

ddH2O;M:

DL2000

表现典型卷叶症状的杏树样品、枣疯病发病植株、健康枣树植株和健康杏树样品的总DNA提取液琼脂糖凝胶电泳结果均出现一条明显的亮带，小分子量的DNA和RNA弥散带极少，说明DNA提取液纯度较高（图1）。

PCR直接扩增结果如图2所示，两对引物R16mF2/R16mR1和P1/P7对上述供试材料扩增出相似的结果：

3个阳性对照均扩增出长度分别为1370bp（R16mF2/R16mR1）和1760bp（P1/P7）的基因片段，而表现卷叶症状的杏树植株与健康植株均未扩增出特异性条带。

2.2杏树DNA样品的Nested-PCR检测

图3用引物R16F2n/R16R2nNest-PCR扩增结果

bz7:

发病杏样品（品种：

亚布拉克佳娜丽）;LZF1andLZF2:

采自山东的枣疯病叶片样品;JZF3:

采自河北的患枣疯病叶片样品;ck:

灭菌双蒸水;M:

200bpDNAladder

Fig.3Nested-PCRamplificationusingprimerpairsR16F2n/R16R2n

bz7:

Diseasedapricotplant;LZF1andLZF2:

Jujubewitches-broomplantfromShandong;JZF3:

Jujubewitches-broomplantfromHebei;ck:

超纯水;M:

200bpDNAladder

由于用直接PCR方法未能在供试杏病株组织和健康组织样品中扩增出特异条带,所以改用R16F2n/R16R2n嵌套引物进行Nested-PCR。

参照黄云等（2009）的方法，将阳性对照枣疯病的首轮PCR产物稀释30倍，杏卷叶样品和正常健康样品的首轮PCR产物不稀释，用R16F2n/R16R2n引物进行Nested-PCR扩增。

结果如图3所示：

只有采自轮台国家果树资源圃的亚布拉克佳娜丽杏树卷叶样品与三个枣树阳性对照均扩增出了约1200bp的目的片段。

正常健康杏树对照、空白对照及其他卷叶杏树样品均未扩增出特异性条带。

2.3新疆杏植原体16SrDNA核苷酸序列同源性比较

将新疆杏亚布拉克佳娜丽卷叶样品以及山东及河北枣疯病样品通过Nested-PCR扩增获得目的片段进行序列测定，亚布拉克佳娜丽杏获得了1044个核苷酸序列，三个枣疯病样品分别获得了1034、1040和1001个核苷酸序列。

利用BioEditor软件对上述四份材料的序列进行同源比对，结果表明：

亚布拉克佳娜丽杏褪绿卷叶植原体（ACLR-XJ）扩增序列与枣疯病（JWB）植原体的同源性达到99%以上，而与所选取的阳性对照山东枣疯病样品的同源性达100%，二者与河北枣疯病样品仅有一个碱基的差异（图4）。

重复实验，结果一致。

图4供试材料通过巢式PCR扩增目的片段的比对

MCLR-XJ发病杏样品（品种：

亚布拉克胡安娜）;JZF1andJZF2:

采自山东的枣疯病叶片样品;JZF3:

采自河北的患枣疯病叶片样品

Fig6　16SrDNAsequencecomparisonamongXinjiangdiseasedapricotplantandjujubewitches-broomplants

MCLR-XJ:

bz7:

DiseasedapricotplantfromXinjiang;JZF1andJZF2:

Jujubewitches-broomplantfromShandong;JZF3:

Jujubewitches-broomplantfromHebei

2.4新疆杏植原体16SrDNA的序列分析及系统进化树的构建

图5基于16SrDNA片段碱基序列分析构建的植原体系统进化树

分支上数值为自举支持率

Fig．5Phytogenetictreeaccordingtosequencesanalysisofphytoplasmas16SrDNA

Bootstrapvaluesareshownonbranches

在NCBI数据库中选取有代表性植原体16SrDNA序列，采用CluxtalX1.8对所有序列进行进行核苷酸序列同源性比较和亲缘关系分析，利用MEGA3.1软件，采用N-J法构建系统进化树（图5）。

结果表明，新疆杏褪绿卷叶植原体（ACLR-XJ）与山东（JWB-Shandong）及河北枣疯病（JWB-Hebai）高度同源，与NCBI中登录的桃黄化植原体（NCBI登录号：

AY197660）及枣疯病植原体（NCBI登录号：

GU184180）均只有两个碱基的差异，同源性达99%以上，均属于植原体的同一组（16SrV）。

这些病害间的关系以及是否具有相互传染性，还需要进一步的试验研究。

图5中每一分支上自举支持率较小的原因可能是序列太短，但不影响结果可靠性。

3讨论

3.1新疆杏褪绿卷叶（ACLR-XJ）植原体的分类地位

本研究通过PCR扩增技术获得了新疆杏褪绿卷叶病的16SrDNA序列片段，并进行了序列测定和同源性分析，首次从分子水平上证明了导致新疆杏亚布拉克佳娜丽褪绿卷叶病的病原为植原体。

关于杏褪绿卷叶植原体的分类在国际上是一个颇有争议的问题。

Seemüller等（2004）依据分子分类学方面的证据，认为导致杏褪绿卷叶病（ACLR）的病原ESFY与苹果丛枝病（AP，AppleProlification）、梨衰退病（PD，Peardecline）和翠菊黄化病（AY，Asteryellow）植原体具有相似的DNA序列，序列相似度为98.6-99.1%，差异发生的部位在16rDNA16-19的核苷酸位置。

故建议将此三种植原体归为一个种“Candidatus”，并且倾向于将ESFY在分类上归于苹果丛枝病植原体类群（AP）。

而本研究发现新疆杏亚布拉克佳娜丽褪绿卷叶病的植原体在系统分类上应归于16SrV组，而梨衰退病植原体PD-Taiwan（NCBI登录号：

EF193157）则应归于16SrII组，紫菀褪绿病植原体AY-PaWB（NCBI登录号：

AY265206）则归于16SrI组。

我们研究也发现，新疆杏亚不拉克佳娜丽褪绿卷叶病的植原体与与发生在北美大陆核果类同类病变的植原体WX（NCBI登录号：

L04682）遗传距离较远，这一结论与Seemülle等（1998）的研究结果一致。

Kirkpatrick等（1994）则发现在加利福利亚桃树上的黄化卷叶的植原体在遗传上与ESFY要近于X-病类群。

由于16SrDNA具有高度保守性，各组之间的变异率低，基于此序列研究的植原体分类也受到了局限。

随着植原体研究的深入，人们发现不同植原体间的核糖体蛋白（rp）基因、延伸因子（tuf）基因及运转蛋白（SecY）基因等相较之16SrDNA具有更高的变异性，可以为植原体在亚组水平上的分类研究提供更多依据（Leeetal,2000）。

如Marcone（2010）针对杏褪绿卷叶植原体tuf和rp因子的研究，引发德国杏褪绿卷叶病的植原体属于16SrX组，而Hodgetts等（2008）鉴定了杏褪绿卷叶植原体的secY基因，将其归为16SrI组。

由此可见，ESFY的系统分类是一个十分复杂的问题，一方面，病原体与不同寄主的关系仍需进一步明确，另一方面，选用基因或片段的保守性也是一个重要因子。

目前国际上普遍接受的植原体分类系统是根据16SrDNA限制性片段长度多态性分析（RFLP）和核糖体蛋白质基因序列分析而建立的。

我们在下游研究中将通过RFLP技术对本研究中的目的片段做进一步的分析，以期为新疆杏ACLR植原体亚组的分类提供依据。

3.2植原体分子检测的有效性

本研究利用植原体16SrDNA通用引物R16mF2/R16mR1和P1/P7对表现褪绿卷叶症状的新疆杏植株总DNA进行首轮PCR扩增，表现出卷叶症状的杏树样品并未获得目的DNA序列，但在阳性对照枣疯病样品中获得成功。

而通过嵌套式引物R16F2n/R16R2n以首轮扩增产物为底物进行Nested-PCR扩增，在新疆杏亚布拉克佳娜丽的发病样品中获得了一个1044bp的植原体片段，在其它发病株和健康株中均未曾获得扩增片段。

这一结果表明，将分子检测技术应用于新疆杏褪绿卷叶病常规检测还不成熟。

导致这一结果出现的原因可能是单一PCR反应的灵敏度容易受各种因素的影响，造成特征带不明显或混有杂带。

同时说明采用Nested-PCR进行两轮扩增，可提高植原体分子检测的灵敏度，对于感染植株体内植原体浓度较低的特性，也许通过此方法可以得到较好的解决。

对于这一现象，澳大利亚学者Schneider等（1997）在研究梨衰退病以及我国学者黄云等（2009）在研究桃黄化病时等也有类似的报道。

有趣的是，据JarauschW.（1998）和JarauschB.（2007）等人的报道，通过PCR扩增的方法，在表现典型发病症状的植株和部分未表现发病症状的植株总DNA中均扩增出了植原体的16SrDNA序列，证明了此病害的潜伏特性。

其实，在本研究中，我们前后选取的表现典型卷叶症状的杏树样品共有12个，但通过Nested-PCR的方法，只有一个样品扩增出了植原体的基因片段，说明虽然借助分子检测手段可以准确地确定植原体的存在，但检出效率并不理想，还有待于检测技术的进一步优化。

笔者正在开展新疆杏植原体荧光检测的相关研究，希望从多种检测手段的结合中找到提高检测植原体准确性和效率的突破口。

References

BertacciniA,PastoreM,VibioM,IzzoPP,GenoveseMR,SantonastasoM.1997.UseofmolecularmethodsforidentificationofphytoplasmasassociatedwithapricotchloroticleafrollinItaly.ItalusHortus,4

（2）:

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HanBing，HeTian-ming，WuYu-xia，MaYuan，LiWen-hui．2011．Effectofchloroticleafrollonthephotosyntheticcharacteristicsandanatomicalstructureofapricotleaves．JournalofXinjiangAgriculturalUniversity，34（4）：

（inChinses）

韩冰，何天明，吴玉霞，马媛，李文慧．褪绿卷叶病对杏叶片光合特性和解剖结构的影响[J]．新疆农业大学学报，2011，34（4）：

HodgettsJ,BoonhamN,MumfordR.2008.PhytoplasmaphylogeneticsbasedonanalysisofsecAand23SrRNAgenesequencesforimprovedresolutionofcandidatespeciesof'CandidatusPhytoplasma'.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,58:

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HuangYun,WangJing,ZhaoYan-qin,HeMiao．2009．Theidentificationandsequenceanalysisof16SR