内容提要病理学园地.docx

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内容提要病理学园地

病理检验技术

江汉大学医学与生命科学学院

病理学与病理生理学教研室

2004年4月

内容提要

本书介绍组织病理学常用的多种技术。

包括常见的技术，即福尔马林固定、石蜡包埋、HE染色技术，同时也介绍了常用的特殊染色技术，免疫组织化学技术，并简明地介绍了分子生物学技术的基本理论以及在组织病理学中的应用。

全书理论与实践并重，经典与改良结合，内容丰富，通俗易懂，实用性强，为实验室工作的必备参考书。

适合从事病理学、组织学、生物学、法医学等的科研教学和临床工作的技术人员、教师、医师和研究生使用。

同时也适合临床医学检验专业中专、专科生使用以及临床医学专业专升本学生和临床医学专业本科生选用。

第一篇石蜡切片技术

第一章组织标本的处理

第一节取材··············································5

第二节组织的固定········································6

第三节大体标本的处理和固定·····························14

第四节陈列标本的固定···································15

第五节脱钙·············································16

第六节组织的冲洗·······································18

第二章石蜡包埋技术

第一节脱水··············································19

第二节透明··············································21

第三节浸蜡··············································22

第四节包埋··············································22

第三章切片技术

第一节切片刀············································25

第二节切片机············································27

第三节石蜡切片的制作····································27

第四节特殊组织石蜡切片的制作····························29

第五节石蜡切片的异常及处理······························29

第四章染色与染色剂

第一节染色的基本原理····································31

第二节染色剂染色的化学基础······························33

第三节染色剂的分类······································34

第四节常用染色剂及配制··································35

第五节苏木素—伊红染色法································39

第六节封固剂············································41

第五章特殊染色技术

第一节结缔组织染色法····································43

第二节脂类染色法·······································47

第三节糖原及粘液染色法··································48

第四节色素染色法········································50

第五节神经组织染色法····································52

第六节核酸及核蛋白染色法································52

第七节肌肉组织染色法····································53

第八节病原微生物染色法··································54

第九节特殊染色技术的应用································57

第二篇免疫组织化学和亲和免疫组织化学技术

第一章免疫组织化学技术

第一节基本原理··········································62

第二节染色步骤··········································67

第三节常用试剂的配制····································72

第二章亲和免疫组织化学技术

第一节基本原理··········································77

第二节染色步骤··········································80

第三篇分子生物学技术

第一章核酸原位杂交技术

第一节核酸原位杂交的基本原理····························83

第二节核酸原位杂交的主要过程····························84

第三节核酸原位杂交的基本操作步骤························86

第四节常用试剂的配制····································87

第五节核酸原位杂交的应用································89

第二章原位PCR技术

第一节基本原理··········································91

第二节基本类型··········································91

第三节基本步骤··········································92

第四节原位PCR技术的应用·······························93

第一篇石蜡切片技术

切片技术的应用到现在已有一百年多的历史了。

最早应用的只是冰冻切片，随着冰冻切片的应用和实践又进一步利用石蜡的硬度，将要检查的组织块浸渍并包埋于这种坚实的介质之中，制成了石蜡切片。

后来又利用明胶，火棉胶等物质的韧性来包埋组织，制成了明胶切片和火棉胶切片。

切片技术随着生物学和医学的发展，经过不断地改进而逐渐的完善起来，随着光学仪器和切片机器的日益的精密和不断向前发展。

现代切片技术巳成为生物形态学微观结构研究的一个重要方面，更是病理检验技术中不可缺少的一个组成部分。

将各种组织制成非薄的切片标本，需要经过一系列比较繁杂的过程，每一步都要求病理技术工作者要认真，耐心，细致地使整个过程一环扣住一环，才能获得优良结果。

制作切片的主要过程有：

（1）取材，

（2）固定，（3）脱水，（4）包埋，（5）切片，（6）染色，（7）封固。

在这七个主要过程中，又包括着若干步骤，（详见切片制作程序表）。

冰冻切片石蜡切片火棉胶切片

︳↓︳

——————————→取材←——————————

↓

固定

↓

冰冻←————————冲水

∣↓

∣脱水———————————

∣↓↓

∣透明乙醚酒精

∣↓↓

∣浸蜡胶液渗透

∣↓↓

∣石蜡包埋火棉胶包埋

↓↓↓

冰冻切片切片切片

↓↓↓

染色染色染色

↓↓↓

封固封固封固

凡欲制作切片的组织，首先必须固定，以防止组织自溶而产生死后变化。

组织经过固定之后，再以流水冲洗。

如为冰冻切片，即可直接将组织冰冻进行切片。

如欲制石蜡切片或火棉胶切片，为了使石蜡或火棉胶渗透到组织中去，以能包埋组织，在固定水洗之后，还须经过脱水，媒剂（透明），石蜡火棉胶的渗透，才能包埋切片。

在切片以后，为了便于观察，还要对其进行不同的染色，最后将切片封固，制成长久保存的组织切片标本。

第一章组织标本的处理

第一节取材

取材是制作切片程序中的首要步骤，取材不当，将直接影响病理诊断和科研工作的效果。

组织标本的选用非常重要，不能随意的切取组织来制作组织切片，否则病理检验的结果是不会令人满意的。

一、取材工具：

取材刀具必须锋利。

切取标本不应该挤压和揉擦，不应使用有钩镊子或血管钳等手术器械镊取标本，以免损害组织造成人为组织变化，给诊断带来困难或导致错诊，漏诊。

二、标本的选取：

应选择病变或可疑病变的组织。

必要时选取病变与正常组织交界处。

切取标本的原则是求准而不是求量多，所以切取组织宜小不宜大，以不超过24x24mm2为佳，厚度以3—5mm为度，过大过厚会影响对标本的固定，另方面也影响切片的制作。

特殊目的者应属例外。

1、了使组织切片的结构清楚，取材要及时，组织块必须争取时间及时固定。

组织的固定以愈新鲜愈好。

2、取材时对大体标本（肉眼标本）绘制图象，进行仔细描述。

包括形状、大小，硬度，颜色，病灶（或可疑病变）部位等。

对所取的组织应定位编号。

3、切取各组织块时，切勿挤压损伤，对典型或具有教学和科研价值的肉眼标本，

不能因取材而对标本造成人为的“病变”。

肠粘膜组织上沾有少量粪便，也不应以手拭去或以水洗去。

4、下的组织块应尽量防止其弯曲扭转，如胃肠等组织，应先平展于草纸上粘着以后，慢慢地放入固定液中（故应在动手剖验之前做好准备工作）。

固定液的量要充足，应为固定组织的10倍。

5、组织采取应在正常与病灶交界之处。

组织形状最好为方形或长方形状，这样有利于制片。

切不可以形状定位，组织厚薄要均匀。

因为组织块的厚度决定固定的速度，要充分满足它在一定时间内全部达到适宜的固定。

如组织厚薄不均，在脱水时将会引起标本变形或曲，而影响制片。

在典型病变部位不妨多切数块，以备日后添制教学切片或研究的需要。

6、微量标本和易碎标本，为避免破损或丢失应以纱布包裹，但包裹前纱布必须浸湿，以免标本粘附纱布上。

7、各组织块应包括各脏器的重要结构，如肾脏组织包括皮质部分和髓质部分。

在有浆膜的脏器（如胃等）组织块中，要至少有一块带有浆膜。

8、组织内的钙化病灶或骨质，应在充分固定之后进行脱钙，组织内的非病理性异物应予剔除。

9、标本上（组织块）附着的软组织如脂肪等，如属非病变成分，则应在不影响病理诊断的原则下，尽量剥去或切除，以利制片。

10、组织块的固定时间不宜过长或过短，不同的固定液，固定时间有所不同，固定后的组织需要用流水冲洗，再进行脱水制片。

11、切取镜检组织块后，可将剩余的组织放入70%洒精中保存，这样有利于日后再取材切片时的细胞染色。

第二节组织的固定

一、固定的意义

固定是指将各种组织浸入防腐剂内，使细胞内的物质为不溶性。

固定的作用即是用一种方法将组织尽可能保持在它原来的形态，且能适于某些研究程序。

凡是需要制作作病理检验标本的各种组织，无论是制作切片标本，还是制作巨体标本，首先必须固定。

在制作切片过程中，固定最为重要的步骤，一张优秀的组织学切片是建立在适当而完全的固定基础之上的。

固定不良在以后制片的任何阶段皆不能补救。

因此制片的优劣首先取决于最初固定适当与否。

重要的是，被固定组织在动物死后或从活体切取后要尽可能立即固定。

及时的取材给迅速固定提供了先决条件。

如果不迅速固定，造成固定不良，将导致染色不良后果。

组织的良好固定，应该是一次性的；某些固定剂还具有助染的作用，可使细胞各部易于着色。

固定不良的组织，即使进行补充固定也起不到改善染色的效果。

二、固定的目的和效果

固定组织的目的是设法得到接近正常生命状态的细胞结构，有人说“形态学的美是良好固定产物”，这说明固定的特殊重要作用。

1、抑制自溶和腐败：

组织的固定能保持细胞与生活时的形态相似。

因为当机体生命活动停止、或局部器官、组织割离机体之后，组织细胞的代谢功能即行丧失，新鲜组织如果不经固定，任意放置，由于细胞内酶对蛋白质的分解，以及细胞的孳生等各种因素的作用，则易因细胞繁殖而致组织腐烂。

细胞内的蛋白质分解酶将蛋白质分解为氨基酸后脱离细胞而引起组织的自溶。

2、保存：

细胞经过固定，不但可以防止自溶和细菌性腐败，而且能沉淀或凝固组织内的各种成份和病理代谢产物，如蛋白质，脂及脂蛋白、脂肪、糖类、色素，其它碳水化合物，无机成份，微生物等都可以经过固定而保存下来，并在制片过程中不为其他试剂溶解破坏。

3、硬化：

固定剂的硬化作用能使柔软组织（如脑）的质地变硬而易于操作。

4、胶质物体的固化：

固定能使细胞正常的半液体状（溶胶）变为不能逆转的固体状（凝胶）粘度。

5、肉眼鉴别：

固定可将各种细胞和组织成分的析光率作不同程度的改变，增强组织的析光指数，这样能使各种染色成份较之未固定时更容易辨认。

6、对染色的影响：

某些固定剂尚具有一定的媒染作用而增进染色（如苦味酸对于染色的媒染作用）可使细胞各种部位易于着色，所以组织固定后有利于制片染色和在显微镜下的观察。

此外，固定剂有时也会影响染色效果，导致着色效果不理想（如福尔马林对水溶猩红S染色的影响）。

7、渗透和固定：

固定还可以使组织和细胞的各种渗透压不再发生改变，在制片时就能在最大范围内保持组织和细胞的原来形态。

三、固定的方法及注意事项：

为使组织固定充分，应做到固定容器要合适、固定时间要充足，固定液量要足够。

固定组织时，应选择合适的容器、一般容器的容积是组织的10~15倍以上。

标本瓶应选择瓶口较大的为宜，这样便于固定后的标本经小口瓶硬塞进去，这样不仅不利于标本易于取出，还可能造成人为挤压组织而致形态变化，对大件的标本应按巨检常规切片后放于容器固定。

组织固定的时间要足够，根据标本体积大小不同，固定时间应有所不同，组织越大越厚，固定时间应越长，反之。

一般4—12小时或更长。

在温箱内将固定液稍加温，可使固定作用加快而缩短固定时间。

固定组织时，应该使用足量的固定液，多比少好，一般应为组织体积的5—10倍，最少也不应于五倍。

标本最好悬浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用器之底部，都不利于固定液对标本的渗入。

如标本块多时，固定时不应重叠。

不要先将标本块放入容器后再注入固定液，以免标本贴付于器皿，形成固定不均匀之弊。

新鲜标本应及时固定，否则或因组织陈旧，或因固定不当，而使组织原有结构消失而影响观察。

标本经固定后，应及时制作切片，如不能及时制片，而该固定液又不能作为保存液时，应改换适当的保存液。

在配制混合液时，应了解每种固定剂的理化性质，氧化剂不能与还原剂混合，以免引起化学反应，失去固定作用。

对于某些需要制作神经染色和酶反应等组织的固定，要求较一般严格，组织的大小，固定的时间，温度的适当都应慎重考虑，尤其是对于酶反应的固定液，一般都要置于冰箱，在低温的条件下进行固定。

固定不好，是得不到满意的切片和合乎标准的反应效果的。

任何固定液对人体都有损害作用，因此固定液的容器必须密闭，以防挥发损伤器官和眼睛，忌用手与固定剂直接接触，以免损伤皮肤。

四、固定剂的选择

理想的固定剂应该具备下列几种性能：

1、渗透性强：

固定剂必须能迅速渗入组织，这样组织内各种成分才能尽快地被固定在原位置，而不致弥散。

2、组织在固定液的作用下，不应发生显著的收缩和膨胀现象。

实际上经过固定后的组织，由于蛋白质发生凝固或沉淀，必然导致组织出现不同程度的收缩或膨胀。

因此，良好的固定剂应尽量减少组织发生这类变化。

3、固定剂应该有利组织切片和染色，这其中含有两种意义；

（1）固定剂对固定后的组织应有利于染色剂的染色。

例如：

重铬酸钾对于类脂质具有一定媒染作用；中性福尔马林比一般福尔马林所固定组织更优于核的染色。

（2）固定剂能将组织或细胞中某些必须观察的成分予充分固定而保存下来，以便染色。

例如：

酸可以渗入脂类物质使其固定下来而不至在制片过程中为酒精和二甲苯溶解或较少地溶解，并可用石蜡包埋进行切片。

糖原的证明，则宜使用非水溶性固定剂如无水酒精、Camoy氏固定液等。

4、固定液应该同时也是一种较好的保存液。

实际上，没有哪一种固定液，无任是单一固定液或混合固定液都能够完全达到上述要求。

各种固定剂性能和作用都不尽相同，因此，对标本的固定应根据组织的制片目的和要求去选择适当的固定剂。

五、固定剂的种类

组织制片技术上所使用的固定剂种类繁多，性能各有不同，有的为氧化剂，有的为还原剂；有的呈酸性，有的呈碱性；有的渗透力强，有的渗透力弱；有些易使组织收缩，有些则使组织发生轻微膨胀现象。

一般地说，单一固定剂要想使组织固定后达到某种特殊染色要求是比较困难的。

因此，在标本固定中常使用两种以上成分（固定剂）的混合固定液。

六、用做固定剂的试剂

1、单一固定剂：

仅由一种化学物质加水溶解后用以固定标本的固定液叫单一固定液。

常用单一固定试剂有甲醛，洒精，冰醋酸，苦味酸，重铬酸钾，饿酸，氧化汞，丙酮等。

除福尔马林，酒精和丙酮常用作单一固定剂外，其它多作混合液中的一种成分。

甲醛formaldeloyde（H·CHO）

甲醛是一种气体，约有40%重量溶于水。

这是一种还原剂，颇易挥发，这种饱和溶液称为甲醛溶液；其商品名叫福尔马林。

10%福尔马林的组成系；

甲醛溶液（福尔马林）10ml

水90ml

甲醛是一种使用广泛、简便的固定剂，同时又是一种良好别的标本保存液。

经它固定的标本，可适应一些特殊染色。

它的渗透性较强，固定均匀，能增加组织的韧性，组织缩轻微，硬性大于酒精。

福尔马林主要是由甲醛的聚合形式构成，然而聚合形式的固定效果低于单体形式构成的10%福尔马林，为阻止在放置一定时间的重聚作用，一般将溶液的PH值调节至中性或偏碱性。

甲醛与蛋白质是在分子间的交联上起反应，最终产生一种不溶性产物。

它经过络合交联，使蛋白质固定，能较好地保存脂类；对肝糖也有固定作用，但必须及时固定及时处理，以免产生水解。

甲醛当长期贮存，特别于寒冷气候下，自行分解，可变混浊，有白色沉淀物，这种沉淀即三聚甲醛，是甲醛的一种聚合形式（加热可重新分解成甲醛）。

商品福尔马林用甲醇阻止聚合作用。

有时由于溶液不纯或甲醛氧化产生的甲酸成分使溶液呈酸性，酸性的甲醛溶液使标本嗜染酸性、严重时可导致细胞核的嗜酸性染色。

因此，在备用的甲醛中宜放入小量的碳酸镁或碳酸钠作为中和剂。

如果每100毫升的福尔马林固定液中加入5ml的吡啶，则可调整PH为7。

不过，这些方法不能永久保持其PH值；欲望使其长期保持中性，则需以磷酸缓冲液作溶剂进行配制。

其配制方法如下：

10%福尔马林1000ml

磷酸二氢钠（NaH2PO4）4g

磷酸氢二钠（Na2HPO4）6.5g

固定小的组织块数小时即可达到固定要求。

如需要快速固定时，可加温到70～80℃，经过10分钟即可达到固定要求。

在甲醛溶液中短时固定的标本，冲洗时间在10分钟至2小时即可，但固定时间较长的标本需要较长时间的流水冲洗。

一般要冲洗24小时，甚至延长48小时，否则，由于甲酸的沉淀将会影响染色的结果。

甲醛能保存脂肪和类脂体，对染色体，线粒体，高尔基体，具有良好的固定作用。

经甲醛固定的陈旧组织，尤以多血的肝脾组织内常可出现棕黑色的福尔马林色素颗粒，这种色素不溶于水，酒精及丙酮等，如欲与含铁血黄素加以区别，可用普鲁士兰反应进行鉴别。

福尔马林色素不含有铁，因此，福尔马林色素呈阴性反应，用中性或微碱性福尔马林固定的效果能显著增加对铁离子的检出速度且可完全避免福尔马林色素的形成。

此外也可以使用其他试剂以浸洗方法除去福尔马林色素的沉淀，如：

（1）苦味酸饱和酒精（90%）溶液浸洗30分钟后经70%酒精再水洗后进行染色。

（2）什端氏（Schriade）法：

70%酒精200ml

28%氨水1ml

将石蜡切片在脱蜡以后放于上述液体中30分钟，再用流水冲洗，而后染色。

若甲醛产生的色素沉淀仍未被其洗去，则可在Schriade氏液中延长时间。

此法并不损害组织。

（3）费罗氏（Verocay）法:

80%酒精100ml

1%KOH1ml

将切片在脱蜡至80%酒精后，浸入上液10分钟，再流水冲洗5分钟，入80%酒精之后水洗染色。

福尔马林固定的标本，经酒精脱水收缩较大，是其缺点。

酒精（C2H5OH）

可单独用作固定液；亦可作混合固定液，因为酒精（乙醇）是一种还原剂，所以不可与铬酸，重铬酸钾或锇酸等氧化剂相混合使用。

在氧量不足时酒精易氧化成乙醛；氧量充足则能生成酯酸，所以在正常情况下，酒精是偏酸性试剂。

酒精为常用的有机溶剂，能溶解多种有机物，高浓度酒精能凝固白蛋白，球蛋白和核蛋白，对肝糖有固定作用，核蛋白和肝糖经酒精固定成水溶性状态，因此，经酒精固定的标本如果固定后用水洗涤，则核着色欠佳，肝糖也将被水解。

作为一种脂溶剂，浓度在50%以上的酒精可溶解脂肪和类酯体，因此，对脂类的证明，高尔基氏体，线粒体等染色不宜使用酒精作固定剂。

酒精还可溶解血红蛋白和损害多数其他色素，因此，如果证明组织蛋白的色素时也不宜以酒精作为固定剂。

浓酒精有较大的收缩力，被它固定的组织收缩显著，表面发硬，因而酒精较难渗入到组织中去，组织必须用酒精固定时宜先用80%的酒精固定数小时，然后再换95%酒精，这样可以避免组织过度收缩，因此它的穿透力缓慢且与组织长期接触能使之硬化，如需要证明尿酸结晶和保存糖类，则须用100%酒精固定。

酒精既有固定作用，又有脱水作用，经酒精固定的标本不需洗涤，可用较高浓度酒精直接进行脱水，也可暂存于70%酒精中。

醋酸（CH3COOH）

纯醋酸为无色，具有强烈刺激性的酸性液体，温度低于17℃时呈固体状，形成冰样结晶体。

所以，一般称为冰醋酸。

醋酸因使胶原纤维肿胀，故不能单独使用；但在混合固定液中有抗其它试剂使细胞皱缩的作用。

因此，醋酸常同酒精配制成为混合固定液来抵消经过固定所引起组织的高度收缩和硬化的作用。

醋酸可与水，酒精等溶剂相混合。

一般使用浓度为0.3～5%，以5%为备用液。

用醋酸固定后的组织不必水洗，即可直接投入50%或70%酒精之中。

醋酸的渗透性很强，一般较小的组织块只须1小时即可。

醋酸可使核蛋白沉淀，因此染色质固定很快，是染色质良好的固定液。

对蛋白质具有保存作用，对脂类、糖不产生影响，高浓度醋酸则可溶解脂肪及类脂，并使线粒体和高尔基体被破坏或变形。

所以，一般配制含醋酸的混合液时，其浓度都不超过5%。

苦味酸（C6H2（NO2）3OH）

苦味酸是一种具毒性的黄色结晶体，味苦，在空气中干燥时有爆炸性，故需保湿保存，最好是储存在一层水下。

一般情况下，制片室将苦味酸制成饱和溶液作为常备用液，通常固定的浓度是饱和液，其饱和度为0.9%~1.2%。

苦味酸溶于酒精，二甲苯，固定后的组织经酒精脱水即可。

苦味酸也是一种良好的组织染色剂，经苦味酸固定剂固定的组织作三色染色可使颜色对比鲜艳。

苦味酸能沉淀一切蛋白质，并与其结合形成苦味酸盐，遇水时，其中有的部分可溶与水，因此在一般情况下，组织经苦味酸或含有苦味酸的固定剂固定后，这种水溶性苦味酸盐在与水接触前需先经酒精处理使其呈不溶性，可以70%酒精浸洗，在酒精内加上少量碳酸锂或氨水即可被洗去。

或者是不经水洗，直接投入70%酒精脱水。

在脱水过程中，苦味酸可被各级酒精溶解洗去。

即使不能全部洗去，亦不妨碍染色，脱水酒精虽被染黄，但亦不失其脱水效果。

通常苦味酸沉淀红