狐狸酶活的研究.docx

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狐狸酶活的研究

狐狸主要消化酶变化规律的研究

　小肠是碳水化合物、蛋白质及脂肪等营养物质的主要消化场所。

小肠液中消化酶的活性可能是影响采食、消化及生长的主要限制因素[1-2]。

在研究胃肠道消化酶的试验中,由于消化液的分泌、胃肠道的蠕动等环境温度[3]及摄食行为[4]的影响,消化酶的活性呈现某些规律性波动。

胃肠道的消化能力在狐的生长过程中起着极其重要的作用。

但是,仔狐在前期消化能力很有限,原因是消化道发育不成熟和消化酶分泌不足,只能靠母乳提供生长所需的营养物质。

本文通过对不同断奶日龄仔狐在断奶前后主要消化酶活性测定,探讨不同日龄仔狐酶活发育规律,从而为仔狐营养需要奠定理论基础。

1.试验材料和方法

1.1试验动物

试验动物采用相同饲养管理条件下、发育正常、健康的初生（1d）,7d、14d、21d、28d、35d、42d的蓝狐和银狐（每日龄各4只），所有试验动物均由唐山市狐狸养殖场提供，集中屠宰。

样品采集制备依照Owskzy的方法修改完成。

开腹后立即结扎幽门瓣、回盲瓣、胰腺管,以防止样品相互污染，摘取胰脏,剥除脂肪组织和结缔组织；取含内容物的各肠段,将其中的内容物和肠粘膜刮出样品放入液氮中速冻，-70℃冻存备用。

1.2样品前处理

肠内容物：

取出冷冻的小肠内容物，自然解冻后，肠道食糜按WN=1/5加入冰上预冷至4℃的去离子水，匀浆，匀浆玻璃管外设冰浴，匀浆液用冷冻离心机4℃12000r/min离心15min（5ml），取上清液等分成若干份贮存在-30℃冰柜中保存，以备进行酶活性分析。

胰脏：

解剖后在冰盒冷却的铁板上迅速截取胰脏，生理盐水冲洗后干纱布蘸干水分，秤重并记录，立即放入液氮速冻后，转移至-70℃保存。

胰腺上清液的制备:

从冰箱中取出的胰腺，用其重量的11倍体积的4℃的去离子水匀浆45秒，匀浆玻璃管外设冰浴。

匀浆液在4℃下离心15Smin（16000r/min），将上清液置-20℃下保存，用于酶活性测定。

胰腺酶原的激活:

配制O.O5mol/1Tris-HCL（pH=7.10）的缓冲液，内含有0.05mol/LCaCL2。

将肠激酶溶解在Tris缓冲溶液中配成0.1%的肠激酶-Tris缓冲液，在胰腺组织上清液中加入等体积的肠激酶一Tris缓冲液，370C温浴1h。

即可激活胰蛋白酶原和糜蛋白酶原[5]。

1.3实验项目

肠道各段内容物及胰脏淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶、胃蛋白酶、乳糖酶、蔗糖酶和麦芽糖酶活性。

1.4测定方法及酶活定义

酶活定义及标准曲线的制备及具体测定方法见附录。

1.4.1淀粉酶的测定

依照Bernfeld的方法改进后完成。

用移液管将0.1ml小肠液移入一试管，并在水浴中调温至38℃，加入0.1ml已同样预热至38℃的底物溶液（1%淀粉磷酸缓冲液，pH6.9），3分钟后加入0.2ml显色剂溶液（含3,5-二硝基水杨酸），终止反应，置试管于沸水浴中5分钟，冷水流冷却后加2ml蒸馏水，用分光光度计于540nm处以空白为参比测定吸光度。

用0.1ml蒸馏水代替小肠液测定空白值。

1.4.2胰蛋白酶的测定

依照Bernfeld的方法改进后完成。

用移液管将1ml底物缓冲液（底物为苯甲酰-精氨酸-P-硝基苯铵盐酸盐（BAPNA），缓冲液为0.005mol/LTris缓冲液，内含CaCl2,ph7.8）移入一试管，加0.18ml蒸馏水，38°C水浴5分钟，加0.02ml小肠液，38°C水浴60分钟，用30%乙酸终止反应，在410nm处以空白为参比测吸光度。

用0.2ml蒸馏水代替小肠液测定空白值。

1.4.3胰糜蛋白酶的测定

测定方法同胰蛋白酶。

特异性底物为GPPNA（Sigma,62505）。

1.4.4脂肪酶的测定

取100ml三角瓶4个，每瓶加入1m10.025mol/L磷酸盐缓冲液和0.8m1聚乙烯醇橄榄油乳化液，至38℃水浴中保温5min，然后在两个瓶中各加入小肠液0.2ml，从加入小肠液开始精确计算时间，继续保温15min，取出后立即加入95%乙醇3m1，以停止酶作用，加入2滴酚酞指示剂，用0.005mo1/1NaOH标准液进行滴定。

另外两个瓶子不加小肠液，也继续保温15min后，立即取出，各加入3m195%乙醇，然后加入0.2ml小肠液，用0.005mol/LNaOH标准液进行滴定，作为对照。

1.4.5胃蛋白酶的测定

使用南京建成试剂盒进行测定。

1.4.6二糖酶的测定

使用南京建成试剂盒进行测定。

1.5数据处理　

数据用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，采用Duncan法进行多重比较。

2.试验结果

2.1幼狐不同日龄各部位淀粉酶活性变化

日

龄

胰腺

十二指肠

空肠

回肠

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

1d

64.14±13.27a

19.61±4.26a

10.15±2.05a

11.96±1.26a

36.74±7.26a

30.63±5.27b

29.24±9.18a

54.42±17.69a

7d

193.08±46.37ab

56.83±10.66a

14.14±3.59a

13.05±2.61a

19.98±4.16a

18.61±5.63a

80.97±17.47b

30.82±9.29a

14d

374.20±59.33c

497.49±88.95c

19.67±2.59ab

13.78±2.44a

32.60±1.43a

33.53±12.02b

97.22±14.80b

40.60±12.19a

21d

300.42±73.49bc

302.08±49.49b

17.58±8.30ab

14.86±2.81a

24.66±8.66a

17.95±4.28a

81.93±15.24b

30.45±5.30a

28d

724.47±110.91d

1078.51±10.06e

35.17±3.76b

43.32±10.78b

14.74±1.11a

29.97±2.93b

100.42±16.96b

42.78±5.47a

35d

698.88±80.80d

1254.53±84.55e

26.65±2.00ab

94.53±11.95c

27.01±5.37a

30.27±6.83b

102.06±7.28b

103.87±26.15b

42d

1413.72±222.53e

20776.71±161.21f

115.28±24.85c

117.62±18.21c

168.06±45.54b

32.08±4.64b

288.76±46.48c

193.23±42.52b

由以上数据可以看出幼狐小肠和胰腺的淀粉酶活性随着日龄的增加而逐渐升高。

而且初生时胰腺的淀粉酶活性并不是最高，随后随着日龄的增加胰腺的淀粉酶活性迅速增加，在后期个日龄段活性最高，其次是回肠较高。

这说明不同部位淀粉酶活性不同，导致对日龄的消化率不同。

初生时蓝狐胰腺淀粉酶较低，说明此时胰腺发育尚不完善，淀粉酶的提供主要依靠原来母体。

蓝狐胰腺淀粉酶活性随着日龄的增加而增加，到42日龄时仍有增加趋势。

十二指肠淀粉酶活性1-21日龄时差异不显著（P>0.05），28日龄之后显著增加（P<0.05）。

空肠淀粉酶活性在28日之前没有显著差异（P>0.05），28日龄之后显著高于前期（P<0.05）。

7日龄回肠淀粉酶活性显著高于1日龄（P<0.05），7-28日龄增长缓慢，差异不显著（P>0.05），35日龄之后显著增加（P<0.05）。

银狐胰腺淀粉酶活性随着日龄的增加而增加，到42日龄时仍有增加趋势。

银狐的十二指肠和回肠淀粉酶活性在28日龄之前变化不大，各日龄间差异不显著（P>0.05），28日龄之后酶活显著增加（P<0.05）。

空肠在整个试验阶段淀粉酶活性的差异不大。

2.2幼狐不同日龄各部位胰蛋白酶活性变化

日

龄

胰腺

十二指肠

空肠

回肠

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

1d

1.27±0.24a

1.67±0.22b

6.75±2.31b

6.34±0.14a

0.65±0.22a

0.11±0.03a

0.53±0.19a

0.24±0.10a

7d

1.65±0.22ab

0.91±0.29a

7.76±1.04b

6.35±1.60cd

3.31±0.84a

0.34±0.15a

1.69±0.18a

0.39±0.05a

14d

1.78±0.15b

1.01±0.35a

5.85±1.29b

7.63±1.42d

3.62±0.90a

0.43±0.04a

2.12±0.07a

0.46±0.05a

21d

2.04±0.12b

1.54±0.29b

9.68±1.48c

8.92±3.45b

6.50±0.51b

1.43±0.22a

7.42±1.12b

6.13±0.17b

28d

3.04±0.45c

1.79±0.17b

7.00±0.66b

7.59±1.48d

8.62±1.07bc

1.16±0.13a

15.41±2.15c

13.51±1.57a

35d

3.58±0.41d

2.51±0.03c

2.65±0.67a

7.66±1.45d

9.71±1.97c

13.92±1.82c

10.86±4.16c

13.79±0.55b

42d

4.16±0.35e

3.55±0.49d

2.32±0.38a

3.62±0.32bc

13.52±2.11d

11.51±1.42b

12.42±2.32d

13.43±0.93c

幼狐不同日龄胰蛋白酶活性不同，胰腺的胰蛋白酶活性要较肠道内胰蛋白酶的活性低，胰腺胰蛋白酶随着日龄的增加而逐渐增加。

其它部位两个物种之间呈现出不同的发育规律。

蓝狐胰腺胰蛋白酶活性随着日龄的增加缓慢增加，到42日龄时活性最高，为4.16U/ml。

十二指肠胰蛋白酶随着日龄的增加先增大后减小，在21日龄时达到最大，为9.68U/ml，随后逐渐降低。

空肠胰蛋白酶随着日龄的增加而增加，42日龄时酶活性最高，达到13.52U/ml。

回肠胰蛋白酶活性随着日龄的增加先增大后减小，在28日龄时最大，为12.42U/ml，35日龄时显著减少（P<0.05），42日龄时由于所增加，但仍小于28日龄。

银狐胰腺胰蛋白酶的活性先减小后增大，前期变化不大，28日龄之后显著增加，到42日龄时达到最大值，为3.55U/ml。

十二指肠胰蛋白酶活性先增加后减小，在21日龄达到最大，为8.92U/ml，随后活性逐渐降低，到42日龄时为3.62U/ml。

空肠胰蛋白酶活性随着日龄的增加而增加，1-28日龄增加缓慢，差异不显著（P>0.05），35日龄显著增加（P<0.05），42日龄时又有所降低，为11.51U/ml。

回肠1-14日龄逐渐增加，但是差异不显著（P>0.05），21-28日龄显著增加（P<0.05），随后变化趋于平缓。

2.3幼狐不同日龄各部位脂肪酶活性变化

日

龄

胰腺

十二指肠

空肠

回肠

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

1d

547.3±83.0a

2884.8±251.1b

184.5±65.8a

141.0±9.9a

139.0±21.2a

153.0±21.2a

225.0±30.6a

139.5±4.9a

7d

778.3±126.5ab

1284.3±185.7a

284.5±79.9ab

192.0±50.9ab

177.0±23.0b

266.0±19.3c

273.0±46.3ab

153.0±12.5a

14d

1113.8±139.5b

4347.8±155.1c

602.0±113.1c

204.0±33.9b

216.0±53.3bc

333.7±24.8d

241.5±59.5a

202.5±9.0bc

21d

855.3±69.8ab

3250.5±317.0b

412.5±51.7b

226.8±24.5bc

243.0±4.2bc

336.0±21.4d

262.5±62.8a

187.5±9.0b

28d

4004.0±274.2c

4488.0±121.0c

634.0±139.5c

266.0±24.2c

305.3±58.7c

342.3±21.1d

357.0±38.7b

214.0±24.2c

35d

4455.0±353.3d

6349.8±488.8d

220.0±28.4a

282.0±14.7c

175.5±42.8b

360.0±28.1d

182.5±50.4a

208.5±13.3bc

42d

5777.8±312.6e

9798.3±710.2e

402.0±77.9b

169.5±46.1ab

238.5±38.1bc

202.5±23.2b

184.5±49.6a

201.0±17.3bc

幼狐脂肪酶的活性随着日龄的增加不同部位呈现出不同的变化规律，不同物种之间胰腺酶活高于肠道脂肪酶活性。

蓝狐和银狐呈现出不同的变化规律。

其中蓝狐胰腺脂肪酶活性随着日龄的增加而增加，1-21日龄增长缓慢，21日龄之后显著增加（P<0.05）。

十二指肠脂肪酶的活性随着日龄的增加呈现不规律性变化，总体要较空肠和回肠脂肪酶活性高。

空肠脂肪酶活性在1-28日龄随着日龄的增加而逐渐增加，35日龄时较28日龄小（P<0.05），随后基本稳定。

回肠脂肪酶活性随着日龄的增加先增加后减小，28日龄时显著高于其它日龄（P<0.05），其它日龄之间差异不显著。

银狐胰腺脂肪酶活性随着日龄的增加而增加，42日龄增加到最大，为9798.3U/ml。

银狐各肠段脂肪酶活性随着日龄的增加先增加后减少。

其中十二指肠1-35日龄逐渐增加，35日龄时活性最高，为282.0U/ml，42日龄显著降低（P<0.05）。

空肠脂肪酶1-14日龄显著增加（P<0.05），14-35日龄变化平缓，42日龄显著降低（P<0.05）。

回肠脂肪酶活性1-14日龄逐渐增加，21日龄之后变化趋于平缓。

2.4幼狐不同日龄小肠内容物乳糖酶活性变化

日

龄

十二指肠

空肠

回肠

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

1d

1514533±60747e

919075±74063a

746783±40989b

1332459±111554b

385211±10489a

480465±56565a

7d

1546600±75556e

1852485±187370c

1592542±79224e

2390857±55216d

890158±86336d

866901±57928b

14d

1254608±143199d

2046849±172625d

1709400±66222e

3258905±103550e

765592±35850c

808419±66614b

21d

1020275±53584c

1943647±77874cd

1258617±99008d

3106968±160607e

711633±54257c

529773±90543a

28d

1052958±46632c

1455537±72861c

1083483±46221c

2382066±187446d

922533±82357d

1740682±95857e

35d

455717±40161b

1196002±17814b

834144±41903b

1917273±159996c

541022±78337b

1496436±79324d

42d

249750±10294a

1019029±58933a

595453±158217a

1031260±71107a

411008±28614a

1202309±111983c

幼狐小肠内容物各个部位乳糖酶活性变化随着日龄的增加呈现出先增加后减小的趋势。

各个部位之间也存在不同，相同日龄的仔狐空肠乳糖酶的活性要较其它部位高。

蓝狐十二指肠乳糖酶随着日龄的增加而逐渐减小，42日龄时最小。

空肠乳糖酶活性1-14日龄显著增加（P<0.05），14日龄之后随着日龄的增加乳糖酶活性显著降低（P<0.05），在42日龄时最小。

回肠乳糖酶活性随着日龄的增加先增加后减小。

银狐十二指肠和空肠乳糖酶随着日龄的增加先增加后减小，均是在14日龄时活性最大。

7日龄回肠乳糖酶显著高于1日龄（P<0.05），随后缓慢降低，28日龄显著高于21日龄（P<0.05），随后又逐渐降低。

2.5幼狐不同日龄小肠内容物麦芽糖酶活性变化

日

龄

十二指肠

空肠

回肠

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

1d

816446±40292b

1222949±116916a

35548±30812a

632975±42701a

190925±35449a

384143±25227a

7d

1881152±155358d

2832335±146717d

1148414

±86692c

2466539±172340c

787206±45537b

1568678±111145c

14d

2794494±146902f

3082314±154981e

1458595±147777d

3033580±105302d

861741±50398b

1631173±151657c

21d

2268735±110565e

2442459±38421c

1769349±

170479e

2897696±108033d

1115160±39340c

1154148±101953b

28d

1411581±99342c

2830041±46551d

1950145±237477e

2641983±187428c

1512490±128546d

2679442±200777d

35d

1317552±196086c

2263001±48915b

1931033±139464e

2548719±31306c

3444096±145124f

2828895±149856de

42d

555573±62341a

2148140±122140b

563027±64934b

2173368±71587b

1774509±352204e

3024406±199647e

幼狐小肠内容物各个部位麦芽糖酶活性变化随着日龄的增加呈现出先增加后减小的趋势。

蓝狐十二指肠各肠段麦芽糖酶活性呈现先增加后减小的趋势，其中十二指肠麦芽糖酶活性在14日龄时最大，空肠和回肠均是在35日龄时麦芽糖酶活性最大。

银狐十二指肠和空肠麦芽糖酶活性1-14日龄显著增加（P<0.05），14日龄之后变化趋于平缓。

而回肠麦芽糖酶活性呈现逐渐增加的趋势，到42日龄时活性最大。

2.6幼狐不同日龄小肠内容物蔗糖酶活性变化

日

龄

十二指肠

空肠

回肠

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

1d

515539±43628b

1917846±209954d

351330±28803a

389303±72145a

380926±29779a

287247±7100a

7d

692159±170464c

2627076±182402e

676353±53544c

652469±54545b

354194±35435a

1090506±156068de

14d

877901±18549d

2558275±180159e

890631±66879d

1236136±102820d

405748±35799a

1291178±188681f

21d

855413±75243d

2687278±165223e

894237±68946d

942009±113662c

409885±18211a

1271684±71070ef

28d

555636±63566b

1517459±245899c

1233475±45005e

1006798±169711a

726210±70695b

451798±91362d

35d

471623±47247b

1232123±162085b

955020±101932d

774401±74714b

1351221±70588c

770579±50315c

42d

239948±19403a

579463±58665a

504719±54390b

829442±63653b

695023±52966b

482185±33254b

幼狐不同日龄各肠段蔗糖酶变化规律呈现先增加后减小的变化趋势，不同物种之间变化规律相同。

蓝狐不同肠段蔗糖酶的活性先增加后减小，其中十二指肠在14日龄时达到最大值，空肠在28日龄时达到最大值，而回肠到35日龄时达到最大值。

银狐十二指肠和回肠蔗糖酶活性、先增加后减小，其中十二指肠在21日龄时达到最大值，空肠在14日龄是达到最大值。

而回肠蔗糖酶活性先增大后减小再增大，在14日龄时达到最大值。

2.7幼狐不同日龄胃蛋白酶活性变化

日

龄

胃粘膜

胃内容物

蓝狐

银狐

蓝狐

银狐

1d

237.72±98.48a

85.56±23.70a

50.11±5.19a

20.89±5.39ab

7d

287.22±32.09a

150.74±20.79b

66.00±3.45ab

25.34±1.89ab

14d

332.44±28.16a

90.45±8.47a

62.34±12.10bc

15.56±2.78a

21d

232.84±40.18a

176.00±15.46b

67.23±19.01a

39.34±0.94b

28d

363.00±16.52b

391.93±18.02c

144.23±10.37e

96.00±18.85c

35d

472.39±31.77b

426.56±31.21c

131.00±30.16de

143.33±10.97d

42d

429.41±22.71b

473.41±18.02d

121.67±3.33d

150.34±14.82d

由表中数据可得，胃黏膜的胃蛋白酶活性要较胃内容物高。

两个物种之间比较发现，胃粘膜胃蛋白酶活性随着日龄的增加先增加后减小在增加，而胃内容物胃蛋白酶活性呈现逐渐增加的趋势。

蓝狐胃粘膜胃蛋白酶活性1-14日龄显著增加（P<0.05），随后减小，21日龄之后在增加，到35日龄时达到最大，为472.3