狐狸酶活的研究.docx

1、狐狸酶活的研究狐狸主要消化酶变化规律的研究小肠是碳水化合物、蛋白质及脂肪等营养物质的主要消化场所。小肠液中消化酶的活性可能是影响采食、消化及生长的主要限制因素1-2 。在研究胃肠道消化酶的试验中,由于消化液的分泌、胃肠道的蠕动等环境温度3 及摄食行为4 的影响,消化酶的活性呈现某些规律性波动。胃肠道的消化能力在狐的生长过程中起着极其重要的作用。但是, 仔狐在前期消化能力很有限, 原因是消化道发育不成熟和消化酶分泌不足, 只能靠母乳提供生长所需的营养物质。本文通过对不同断奶日龄仔狐在断奶前后主要消化酶活性测定, 探讨不同日龄仔狐酶活发育规律,从而为仔狐营养需要奠定理论基础。1. 试验材料和方法1

2、.1 试验动物试验动物采用相同饲养管理条件下、发育正常、健康的初生(1 d) , 7 d、14 d、21d、28 d、35 d 、42d的蓝狐和银狐 (每日龄各4只) ，所有试验动物均由唐山市狐狸养殖场提供，集中屠宰。样品采集制备依照Owskzy的方法修改完成。开腹后立即结扎幽门瓣、回盲瓣、胰腺管, 以防止样品相互污染，摘取胰脏, 剥除脂肪组织和结缔组织；取含内容物的各肠段, 将其中的内容物和肠粘膜刮出样品放入液氮中速冻，-70冻存备用。1.2 样品前处理肠内容物：取出冷冻的小肠内容物，自然解冻后，肠道食糜按WN=1/5加入冰上预冷至4的去离子水，匀浆，匀浆玻璃管外设冰浴，匀浆液用冷冻离心机4

3、 12000r/min离心15min(5ml)，取上清液等分成若干份贮存在-30冰柜中保存，以备进行酶活性分析。胰脏：解剖后在冰盒冷却的铁板上迅速截取胰脏，生理盐水冲洗后干纱布蘸干水分，秤重并记录，立即放入液氮速冻后，转移至-70保存。胰腺上清液的制备:从冰箱中取出的胰腺，用其重量的11倍体积的4的去离子水匀浆45秒，匀浆玻璃管外设冰浴。匀浆液在4下离心15Smin(16000r/min)，将上清液置-20下保存，用于酶活性测定。 胰腺酶原的激活:配制O.O5mol/1 Tris-HCL(pH=7.10 )的缓冲液，内含有0.05 mol/LCaCL2。将肠激酶溶解在Tris缓冲溶液中配成0.

4、1%的肠激酶-Tris缓冲液，在胰腺组织上清液中加入等体积的肠激酶一Tris缓冲液，370C温浴1h。即可激活胰蛋白酶原和糜蛋白酶原5。1.3 实验项目肠道各段内容物及胰脏淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶、胃蛋白酶、乳糖酶、蔗糖酶和麦芽糖酶活性。1.4 测定方法及酶活定义酶活定义及标准曲线的制备及具体测定方法见附录。1.4.1淀粉酶的测定依照Bernfeld的方法改进后完成。用移液管将0.1ml小肠液移入一试管，并在水浴中调温至38，加入0.1ml已同样预热至38的底物溶液（1%淀粉磷酸缓冲液，pH6.9），3分钟后加入0.2ml显色剂溶液（含3,5-二硝基水杨酸），终止反应，置试管于沸水浴中5分钟，

5、冷水流冷却后加2ml蒸馏水，用分光光度计于540nm处以空白为参比测定吸光度。用0.1ml蒸馏水代替小肠液测定空白值。1.4.2 胰蛋白酶的测定依照Bernfeld的方法改进后完成。用移液管将1ml底物缓冲液（底物为苯甲酰-精氨酸-P-硝基苯铵盐酸盐（BAPNA），缓冲液为0.005mol/LTris 缓冲液，内含CaCl2,ph7.8）移入一试管，加0.18ml蒸馏水，38C水浴5分钟，加0.02ml小肠液，38C水浴60分钟，用30%乙酸终止反应，在410nm处以空白为参比测吸光度。用0.2ml蒸馏水代替小肠液测定空白值。1.4.3 胰糜蛋白酶的测定测定方法同胰蛋白酶。特异性底物为GPPN

6、A ( Sigma, 62505 )。1.4.4 脂肪酶的测定取100ml三角瓶4个，每瓶加入1m1 0.025mol /L磷酸盐缓冲液和0.8m1聚乙烯醇橄榄油乳化液，至38水浴中保温5min，然后在两个瓶中各加入小肠液0.2 ml，从加入小肠液开始精确计算时间，继续保温15min，取出后立即加入95%乙醇3m1，以停止酶作用，加入2滴酚酞指示剂，用0.005mo1/1 NaOH标准液进行滴定。另外两个瓶子不加小肠液，也继续保温15min后，立即取出，各加入3m1 95%乙醇，然后加入0.2 ml小肠液，用0.005mol/LNaOH标准液进行滴定，作为对照。1.4.5 胃蛋白酶的测定使用南

7、京建成试剂盒进行测定。1.4.6 二糖酶的测定使用南京建成试剂盒进行测定。1.5 数据处理数据用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，采用Duncan法进行多重比较。2.试验结果 2.1 幼狐不同日龄各部位淀粉酶活性变化日龄胰腺十二指肠空肠回肠蓝狐银狐蓝狐银狐蓝狐银狐蓝狐银狐1d64.1413.27a19.614.26a10.152.05a11.961.26a36.747.26a30.635.27b29.249.18a54.4217.69a7d193.0846.37ab56.8310.66a14.143.59a13.052.61a19.984.16a18.615.63a80.9717.4

8、7b30.829.29a14d374.2059.33c497.4988.95c19.672.59ab13.782.44a32.601.43a33.5312.02b97.2214.80b40.6012.19a21d300.4273.49bc302.0849.49b17.588.30ab14.862.81a24.668.66a17.954.28a81.9315.24b30.455.30a28d724.47110.91d1078.5110.06e35.173.76b43.3210.78b14.741.11a29.972.93b100.4216.96b42.785.47a35d698.8880.80d

9、1254.5384.55e26.652.00ab94.5311.95c27.015.37a30.276.83b102.067.28b103.8726.15b42d1413.72222.53e20776.71161.21f115.2824.85c117.6218.21c168.0645.54b32.084.64b288.7646.48c193.2342.52b由以上数据可以看出幼狐小肠和胰腺的淀粉酶活性随着日龄的增加而逐渐升高。而且初生时胰腺的淀粉酶活性并不是最高，随后随着日龄的增加胰腺的淀粉酶活性迅速增加，在后期个日龄段活性最高，其次是回肠较高。这说明不同部位淀粉酶活性不同，导致对日龄的消化率

10、不同。初生时蓝狐胰腺淀粉酶较低，说明此时胰腺发育尚不完善，淀粉酶的提供主要依靠原来母体。蓝狐胰腺淀粉酶活性随着日龄的增加而增加，到42日龄时仍有增加趋势。十二指肠淀粉酶活性1-21日龄时差异不显著（P0.05），28日龄之后显著增加（P0.05），28日龄之后显著高于前期（P0.05）。7日龄回肠淀粉酶活性显著高于1日龄（P0.05），35日龄之后显著增加（P0.05），28日龄之后酶活显著增加（P0.05）。空肠在整个试验阶段淀粉酶活性的差异不大。2.2 幼狐不同日龄各部位胰蛋白酶活性变化日龄胰腺十二指肠空肠回肠蓝狐银狐蓝狐银狐蓝狐银狐蓝狐银狐1d1.270.24a1.670.22b 6.7

11、52.31b 6.340.14a 0.650.22a 0.110.03a 0.530.19a 0.240.10a 7d1.650.22ab0.910.29a7.761.04b 6.351.60cd 3.310.84a 0.340.15a 1.690.18a 0.390.05a 14d1.780.15b1.010.35a 5.851.29b 7.631.42d 3.620.90a 0.430.04a 2.120.07a 0.460.05a 21d2.040.12b1.540.29b 9.681.48c 8.923.45b 6.500.51b 1.430.22a 7.421.12b 6.130.1

12、7b 28d3.040.45c1.790.17b7.000.66b 7.591.48d 8.621.07bc 1.160.13a 15.412.15c 13.511.57a 35d3.580.41d2.510.03c 2.650.67a 7.661.45d 9.711.97c 13.921.82c 10.864.16c 13.790.55b 42d4.160.35e3.550.49d 2.320.38a 3.620.32bc 13.522.11d 11.511.42b 12.422.32d 13.430.93c 幼狐不同日龄胰蛋白酶活性不同，胰腺的胰蛋白酶活性要较肠道内胰蛋白酶的活性低，胰腺胰

13、蛋白酶随着日龄的增加而逐渐增加。其它部位两个物种之间呈现出不同的发育规律。蓝狐胰腺胰蛋白酶活性随着日龄的增加缓慢增加，到42日龄时活性最高，为4.16U/ml。十二指肠胰蛋白酶随着日龄的增加先增大后减小，在21日龄时达到最大，为9.68U/ml，随后逐渐降低。空肠胰蛋白酶随着日龄的增加而增加，42日龄时酶活性最高，达到13.52 U/ml。回肠胰蛋白酶活性随着日龄的增加先增大后减小，在28日龄时最大，为12.42 U/ml，35日龄时显著减少（P0.05），35日龄显著增加（P0.05），21-28日龄显著增加（P0.05），随后变化趋于平缓。2.3 幼狐不同日龄各部位脂肪酶活性变化日龄胰腺十

14、二指肠空肠回肠蓝狐银狐蓝狐银狐蓝狐银狐蓝狐银狐1d547.383.0a 2884.8251.1b 184.565.8a 141.09.9a139.021.2a 153.021.2a 225.030.6a 139.54.9a 7d778.3126.5ab 1284.3185.7a 284.579.9ab 192.050.9ab 177.023.0b 266.019.3c 273.046.3ab 153.012.5a14d1113.8139.5b 4347.8155.1c 602.0113.1c 204.033.9b 216.053.3bc 333. 724.8d 241.559.5a 202.5

15、9.0bc 21d855.369.8ab 3250.5317.0b 412.551.7b 226.824.5bc 243.04.2bc 336.021.4d 262.562.8a 187.59.0b 28d4004.0274.2c 4488. 0121.0c 634.0139.5c 266.024.2c 305.358.7c 342.321.1d 357.038.7b 214.024.2c 35d4455.0353.3d 6349.8488.8d 220.028.4a 282.014.7c 175.542.8b 360.028.1d 182.550.4a 208.513.3bc 42d5777

16、.8312.6e 9798.3710.2e 402.077.9b 169.546.1ab 238.538.1bc 202.523.2b 184.549.6a 201.017.3bc 幼狐脂肪酶的活性随着日龄的增加不同部位呈现出不同的变化规律，不同物种之间胰腺酶活高于肠道脂肪酶活性。蓝狐和银狐呈现出不同的变化规律。其中蓝狐胰腺脂肪酶活性随着日龄的增加而增加，1-21日龄增长缓慢，21日龄之后显著增加（P0.05）。十二指肠脂肪酶的活性随着日龄的增加呈现不规律性变化，总体要较空肠和回肠脂肪酶活性高。空肠脂肪酶活性在1-28日龄随着日龄的增加而逐渐增加，35日龄时较28日龄小（P0.05），随后基本

17、稳定。回肠脂肪酶活性随着日龄的增加先增加后减小，28日龄时显著高于其它日龄（P0.05），其它日龄之间差异不显著。银狐胰腺脂肪酶活性随着日龄的增加而增加，42日龄增加到最大，为9798.3 U/ml。银狐各肠段脂肪酶活性随着日龄的增加先增加后减少。其中十二指肠1-35日龄逐渐增加，35日龄时活性最高，为282.0 U/ml，42日龄显著降低（P0.05）。空肠脂肪酶1-14日龄显著增加（P0.05），14-35日龄变化平缓，42日龄显著降低（P0.05）。回肠脂肪酶活性1-14日龄逐渐增加，21日龄之后变化趋于平缓。2.4幼狐不同日龄小肠内容物乳糖酶活性变化日龄十二指肠空肠回肠蓝狐银狐蓝狐银狐

18、蓝狐银狐1d151453360747e 91907574063a 74678340989b 1332459111554b 38521110489a 48046556565a 7d154660075556e 1852485187370c 159254279224e 239085755216d 89015886336d 86690157928b 14d1254608143199d 2046849172625d 170940066222e 3258905103550e 76559235850c 80841966614b 21d102027553584c 194364777874cd 12586179

19、9008d 3106968160607e 71163354257c 52977390543a 28d105295846632c 145553772861c 108348346221c 2382066187446d 92253382357d 174068295857e 35d45571740161b 119600217814b 83414441903b 1917273159996c 54102278337b 149643679324d 42d24975010294a 101902958933a 595453158217a 103126071107a 41100828614a 1202309111

20、983c 幼狐小肠内容物各个部位乳糖酶活性变化随着日龄的增加呈现出先增加后减小的趋势。各个部位之间也存在不同，相同日龄的仔狐空肠乳糖酶的活性要较其它部位高。蓝狐十二指肠乳糖酶随着日龄的增加而逐渐减小，42日龄时最小。空肠乳糖酶活性1-14日龄显著增加（P0.05），14日龄之后随着日龄的增加乳糖酶活性显著降低（P0.05），在42日龄时最小。回肠乳糖酶活性随着日龄的增加先增加后减小。银狐十二指肠和空肠乳糖酶随着日龄的增加先增加后减小，均是在14日龄时活性最大。7日龄回肠乳糖酶显著高于1日龄（P0.05），随后缓慢降低，28日龄显著高于21日龄（P0.05），随后又逐渐降低。2.5幼狐不同日龄小

21、肠内容物麦芽糖酶活性变化日龄十二指肠空肠回肠蓝狐银狐蓝狐银狐蓝狐银狐1d81644640292b1222949116916a3554830812a63297542701a19092535449 a38414325227a7d1881152155358d2832335146717d114841486692c2466539172340c78720645537b1568678111145c14d2794494146902f3082314154981e1458595147777d3033580105302d86174150398b1631173151657c21d2268735110565e24424

22、5938421c1769349170479e2897696108033d111516039340c1154148101953b28d141158199342c283004146551d1950145237477e2641983187428c1512490128546d2679442200777d35d1317552196086c226300148915b1931033139464e254871931306c3444096145124f2828895149856de42d55557362341a2148140122140b56302764934b217336871587b177450935220

23、4e3024406199647e幼狐小肠内容物各个部位麦芽糖酶活性变化随着日龄的增加呈现出先增加后减小的趋势。蓝狐十二指肠各肠段麦芽糖酶活性呈现先增加后减小的趋势，其中十二指肠麦芽糖酶活性在14日龄时最大，空肠和回肠均是在35日龄时麦芽糖酶活性最大。银狐十二指肠和空肠麦芽糖酶活性1-14日龄显著增加（P0.05），14日龄之后变化趋于平缓。而回肠麦芽糖酶活性呈现逐渐增加的趋势，到42日龄时活性最大。2.6幼狐不同日龄小肠内容物蔗糖酶活性变化日龄十二指肠空肠回肠蓝狐银狐蓝狐银狐蓝狐银狐1d51553943628b1917846209954d35133028803a38930372145a3809

24、2629779a2872477100a7d692159170464c2627076182402e67635353544c652469 54545b35419435435a1090506156068de14d87790118549d2558275180159e89063166879d1236136102820d40574835799a1291178188681f21d85541375243d2687278165223e89423768946d942009113662c40988518211a127168471070ef28d55563663566b1517459245899c1233475450

25、05e1006798169711a72621070695b45179891362d35d47162347247b1232123162085b955020101932d77440174714b135122170588c77057950315c42d23994819403a57946358665a50471954390b82944263653b69502352966b48218533254b幼狐不同日龄各肠段蔗糖酶变化规律呈现先增加后减小的变化趋势，不同物种之间变化规律相同。蓝狐不同肠段蔗糖酶的活性先增加后减小，其中十二指肠在14日龄时达到最大值，空肠在28日龄时达到最大值，而回肠到35日龄时达到

26、最大值。银狐十二指肠和回肠蔗糖酶活性、先增加后减小，其中十二指肠在21日龄时达到最大值，空肠在14日龄是达到最大值。而回肠蔗糖酶活性先增大后减小再增大，在14日龄时达到最大值。2.7幼狐不同日龄胃蛋白酶活性变化日龄胃粘膜胃内容物蓝狐银狐蓝狐银狐1d237.7298.48a 85.5623.70a 50.115.19a 20.895.39ab 7d287.2232.09a 150.7420.79b 66.003.45ab 25.341.89ab 14d332.4428.16a 90.458.47a 62.3412.10bc 15.562.78a 21d232.8440.18a 176.0015.

27、46b 67.2319.01a 39.340.94b 28d363.0016.52b391.9318.02c 144.2310.37e 96.0018.85c 35d472.3931.77b426.5631.21c 131.0030.16de 143.3310.97d 42d429.4122.71b 473.4118.02d 121.673.33d 150.3414.82d 由表中数据可得，胃黏膜的胃蛋白酶活性要较胃内容物高。两个物种之间比较发现，胃粘膜胃蛋白酶活性随着日龄的增加先增加后减小在增加，而胃内容物胃蛋白酶活性呈现逐渐增加的趋势。蓝狐胃粘膜胃蛋白酶活性1-14日龄显著增加（P0.05），随后减小，21日龄之后在增加，到35日龄时达到最大，为472.3