稳定表达PTENEGFREGFRvⅢ人恶性胶质瘤细胞系的建立及其分析鉴定.docx
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稳定表达PTENEGFREGFRvⅢ人恶性胶质瘤细胞系的建立及其分析鉴定
稳定表达PTEN、EGFR、EGFRvⅢ人恶性胶质瘤细胞系的建立及其分析鉴定
稳定表达PTEN、EGFR、EGFRv人恶性
胶质瘤细胞系的建立及其分析鉴定#
董裕翠，任欢**
5
10
15
（哈尔滨医科大学免疫教研室，哈尔滨150081）
摘要：
目的：
分别建立稳定表达抑癌基因PTEN、表皮生长因子受体（EGFR）及突变型EGFRv
的恶性胶质瘤细胞系，从基因、蛋白及细胞水平验证外源性PTEN、EGFR和EGFRv基
因对U87MG细胞的影响。
方法：
采用PCR方法扩增PTEN基因编码区序列，构建重组表
达载体pcDNA3.1-/PTEN。
分别将pcDNA3.1-/PTEN和pLWERNL转染U87MG细胞，筛
选后建立稳定细胞系。
应用RT-PCR和Westernblotting法检测PTEN、EGFR在不同抗性细
胞克隆的表达。
MTT法检测外源性PTEN、EGFR和EGFRv基因对细胞增殖的影响。
结
果：
构建真核表达载体pcDNA3.1-/PTEN及稳定表达细胞系U87MG-PTEN和
U87MG-EGFR，并经RT-PCR及westernblotting验证。
转染外源性PTEN抑制细胞增殖
（P0.05），转染EGFRv促进细胞增殖（P0.05），转染EGFR对细胞增殖无显著影响
（P0.05）。
结论：
成功建立稳定表达抑癌基因PTEN、原癌基因EGFR及其突变体EGFRv
的人恶性胶质瘤细胞系。
为进一步研究所转染基因对相关下游细胞信号转导通路的影响及
对恶性胶质瘤发生发展的作用打下良好基础。
关键词：
恶性胶质瘤；PTEN基因；EGFR基因；EGFRv基因；稳定转染
中图分类号：
R
20
EstablishmentandIdentificationofHumanGlioblastoma
CellLineStablyexpressingPTEN/EGFR/EGFRv
DongYucui,RenHuan
DepartmentofImmunology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081
25
30
35
40
Abstract:
Objective：
ToestablishhumanglioblastomacelllineU87MG-PTEN,U87MG-EGFR
andU87MG-EGFRstablyexpressingPTEN,epidermalgrowthfactorreceptorEGFRand
EGFRvⅢ,respectively.Ongeneexpression,proteinexpressionandcellproliferationlevelsto
verifytheeffectofexogenousPTEN,EGFRandEGFRvⅢgeneontheU87MGcells.Methods：
ThePTENgeneCDSwasamplifiedbyPCR,theninsertedintoeukaryoticexpressionvector
pcDNA3.1-toconstructrecombinantvectorpcDNA3.1-/PTEN.pcDNA3.1-/PTENand
pLWERNLweretransfectedintoU87MGcellsrespectively.TheexpressionofPTENandEGFR
indifferentG418resistantcellcloneswasdetectedbyRT-PCRandWesternblotting.Theeffect
ofexogenousPTEN,EGFRandEGFRvⅢgeneonthecellproliferationwastestedbyMTT
assay.Results：
TheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1-/PTENwasconstructed.Thestable
celllinesU87MG-PTENandU87MG-EGFRwereestablishedandverifiedbyRT-PCRand
Westernblotting.StableexpressionofexogenousPTENcansuppressthegrowthofhuman
glioblastomacelllineU87MGP0.05,stableexpressionofexogenousEGFRvⅢcanincrease
thegrowthofU87MGP0.05,whereasstableexpressionofEGFRhasmuchlesseffectonthe
U87MGcellsgrowthP0.05.Conclusion：
Wehavesuccessfullyestablishedhuman
glioblastomacelllineU87MG-PTEN,U87MG-EGFRandU87MG-EGFRstablyexpressing
PTEN,EGFRandEGFRvⅢ,respectively.Thiswilllaydownagoodbasistofurtherstudythe
effectoftransfectedgeneontherelateddownstreamsignalingpathwaysinglioblastomaandthe
developmentofGBM.
Keywords:
Glioblastoma;PTENgene;EGFRgene;EGFRvⅢgene;stabletransfect
基金项目：
本课题受高等学校博士学科点专项科研基金资助（项目编号20092307110006）
作者简介：
董裕翠，1982-，女，讲师，主要研究恶性脑胶质瘤信号转导模式及靶向治疗。
通信联系人：
任欢，1967-，女，教授，主要研究恶性肿瘤的靶向治疗及免疫逃逸机制。
E-mail:
huanren2009@126
-1-
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65
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80
在恶性胶质瘤中，表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）的过表
达及突变占45%[1]。
EGFR基因扩增常伴随结构的变异，其中第三类突变体（EGFRv）是
恶性胶质瘤中最常见的基因组突变体，该受体缺失2-7外显子。
抑癌基因PTEN（human
phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen）在正常情况下通过调控原癌基因
磷脂酰肌醇（PI）-3-激酶（PI3K）来抑制该信号通路的活化从而发挥调节功能。
恶性胶质
瘤中36%的PTEN基因发生了缺失或突变[1]。
研究证实，EGFR、PTEN等基因的异常表
达正是促进与之相关信号转导通路网络异常活跃的重要因素。
因此，EGFR下游区域密切相
关的细胞信号转导网络可能是在维持恶性胶质瘤细胞基因表型及功能状态中起关键作用的
主效通路。
人恶性胶质瘤细胞U87MG表达低水平EGFR基因，不表达EGFRv基因，PTEN基因发
生剪接位点突变，第3外显子缺失，因而不能发挥其功能。
本实验将建立分别表达PTEN和
EGFR的两种人恶性胶质瘤细胞系，研究外源性PTEN、EGFR和EGFRv基因的表达及对
U87MG细胞增殖的影响。
1材料与方法
1.1主要材料
人恶性胶质瘤细胞U87MG、LN229和U87MG-EGFRv为本教研室保存，质粒载体
pcDNA3.1-由本校遗传学教研室馈赠，含EGFR基因的表达载体pLWERNL由Dr.Frank
FurnariLudwigInstitute,SanDiego,CA惠赠，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，
DNAmarker、限制性内切酶（EcoR、Kpn、Sal和Nco）购自TaKaRa公司，T4DNA
连接酶购自NEB公司，G418为EMDBiosciences公司产品，EGFR兔单克隆抗体、PTEN
兔单克隆抗体、HRP标记抗兔抗体购自CellSignaling公司，β-actin一抗购自武汉博士德公
司，四甲基偶氮唑蓝MTT为Sigma公司产品。
1.2重组质粒pcDNA3.1-/PTEN的构建
0>.引物设计
根据GeneBank中PTEN的cDNA序列，分别在引物5'端加上EcoR和Kpn酶切位
点，设计引物P1（上游引物:
CCGGAATTCGGCTCCCAGACATGACAG，下游引物:
CGG
GGTACCAAGTTTATTTTCATGGTGTTT），用于扩增PTEN基因编码区。
根据包含
PTEN基因第三外显子的原则设计引物P2（上游引物：
CATGACAGCCATCATCAAAG，
下游引物：
GTCAAGATCTTCACAAAAGG），用于检测突变型和野生型PTEN的表达。
根据GeneBank中EGFRcDNA序列，设计引物P3（上游引物:
CTTCGGGGAGCAGCGATG
CGAC，下游引物：
ACCAATACCTATTCCGTTACAC），检测EGFR基因的表达。
根
据GeneBank中β-actincDNA序列，设计参照引物P4（上游引物：
ATTGGCAATGAGCGG
TTCCGC，下游引物：
CTCCTGCTTGCTGATCCACATC）。
引物由上海英俊生物技术
公司合成。
.人PTENcDNA的扩增
按Trizol试剂说明书提取LN229细胞（LN229中含完整的PTEN基因，能表达内源性
的PTEN蛋白
[2,3]
5min。
以LN229cDNA为模板，P1为引物，扩增PTEN编码区序列。
反应条件:
98变
-2-
性10s，65退火10s，72延伸70s（30个循环）。
PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴
定。
85
.人PTEN真核表达载体的构建
将回收纯化的PCR产物及质粒pcDNA3.1-分别用EcoR和Kpn双酶切，低熔点琼
脂糖电泳分离、胶回收纯化后，经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，
重组质粒分别经Sal和Nco酶切及基因测序鉴定。
.
G418对U87MG细胞的毒性试验
90
95
U87MG在5%CO2、37条件下培养于DMEM培养基（含10%胎牛血清、100U/ml青
霉素和100μg/ml链霉素）。
取生长状态良好的细胞制成单细胞悬液，接种于6孔板中，待
细胞贴壁后，更换含有G418的浓度分别为100、200、300、400、500、600、700、800、900
和1000μg/mlDMEM培养基，每种浓度设2个平行孔，每隔3天换药1次，以10-14天细胞
全部死亡的最低G418浓度为最佳筛选浓度。
1.3稳定转染细胞系的建立
按照LipofectamineTM2000操作说明书，用表达载体pcDNA3.1-/PTEN和pLWERNL
分别转染U87MG细胞。
转染约48小时后，在含G418的选择性培养基中筛选细胞2-3周，
获得抗性细胞克隆，扩增培养、鉴定后，建立稳定细胞系。
1.4稳定细胞系的鉴定
100
.
RT-PCR法
分别收集pcDNA3.1-/PTEN和pLWERNL转染后挑取的细胞克隆，按Trizol试剂说明
书提取细胞总RNA，取1μg进行反转录。
以P2为引物的PCR反应条件：
94预变性3min，
94变性30s，58退火30s，72延伸45s（30个循环），72延伸10min。
以P3为引物
的PCR反应条件：
94预变性2min，94变性30s，58退火30s，72延伸60s（30个循
105
110
115
环），72延伸10min。
以P4为引物的PCR反应条件：
98变性10s，54退火15s，72
延伸30s（28个循环）。
取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
.WesternBlotting法
分别收集pcDNA3.1-/PTEN和pLWERNL转染后挑取的细胞克隆，经裂解液裂解细胞，
Bradford法测蛋白浓度。
样品于100水浴5min,取等量蛋白上样进行SDAS-PAGE电泳,
电泳后将蛋白转移至硝酸纤维膜上,5%脱脂奶粉封闭,随后与特异性一抗孵育4过夜，次日
与辣根过氧化物酶HRP标记的二抗室温孵育1小时后，暗室中用ECL化学发光试剂作用杂
交膜显影成像于X胶片上。
1.5细胞增殖实验
分别取对数生长期U87MG、U87MG-PTEN、U87MG-EGFR和U87MG-EGFRv细胞，
胰酶消化后制成单细胞悬液，按每孔4×103个细胞接种于96孔板中，每孔体积100μL。
用
含10%胎牛血清的培养液培养24小时后，更换无血清培养液。
以U87MG为对照组，
U87MG-PTEN、U87MG-EGFR和U87MG-EGFRv为试验组，每组细胞设4个复孔，6个
时间检测点，分别于第1、2、3、4、5、6天检测。
在指定时间点每孔加入MTT5mg/ml20μl，
37孵育4h后吸弃孔内培养基，每孔加入DMSO100μl，室温振荡10min，在酶联免疫检测
-3-
120
125
130
仪490nm波长下测定其吸光度值，以细胞增殖百分率为纵坐标、时间为横坐标绘制细胞生
长曲线图。
1.6统计学方法
本实验数据以均数±标准差（X±S）表示，采用SPSS软件包进行统计学处理，组间样
本均数比较采用方差分析，以P0.05作为有无显著性差异的判断标准。
2结果
2.1重组质粒的鉴定
重组质粒pcDNA3.1-/PTEN，经Sal酶切可得到长度4480bp和2185bp两条片段，经
Nco酶切可得到长度3342bp、2588bp和735bp三条片段，与预期片段一致（图1）。
经基
因测序、BLAST比对，重组质粒的插入片段序列与GenBank数据库中PTEN编码区序列相
符。
图1pcDNA3.1-/PTEN酶切鉴定结果
Fig.1RestrictiveendonucleasedigestionofpcDNA3.1-/PTEN
135
2.2
M:
DNAmarker1:
Sal酶切质粒2:
Nco酶切质粒
G418最佳筛选浓度的确定
800、900、1000μg/ml组于第2天，500、600、700μg/ml组于第3天，300、400μg/ml
组于第5天开始出现抑制细胞生长现象，第10天，除200、300μg/ml组有细胞存活外，其
余各组细胞全部死亡。
因此，可以认为在本实验条件下G418最佳筛选浓度为400μg/ml。
140
2.3稳定细胞系的鉴定
.
RT-PCR水平
.
（1）：
用引物P2进行PCR扩增，在转染pcDNA3.1-/PTEN的三株细胞克隆中
可扩增出两条条带，即突变型PTEN（283bp）和野生型PTEN（328bp），而在U87MG细
胞只能检测到突变型PTEN（283bp）的表达（图2）。
下图为相对应细胞内参照基因β-actin
145
（336bp）的表达。
-4-
图2RT-PCR检测PTENmRNA的稳定表达
Fig.2RT-PCRanalysisofPTENmRNAstableexpression
M:
DNAmarker1:
U87MG细胞
2：
转染pcDNA3.1-/PTEN的9号克隆
150
3:
转染pcDNA3.1-/PTEN的10号克隆
4:
转染pcDNA3.1-/PTEN的14号克隆
.
（2）：
以P3为引物，进行PCR扩增，在U87MG和pLWERNL转染的U87MG
细胞9号克隆中可扩增出EGFR的条带（1044bp），且转染pLWERNL的细胞中EGFR基
因表达更强（图3）。
下图为相对应细胞中内参照基因β-actin（336bp）的表达。
155
图3RT-PCR检测EGFRmRNA的稳定表达
Fig.3RT-PCRanalysisofEGFRmRNAstableexpression
M:
代表DNAmarker1:
U87MG细胞
2:
转染pLWERNL的U87MG细胞9号克隆
160
165
.WesternBlotting水平检测
.1图4结果显示，转染pcDNA3.1-/PTEN的三株细胞克隆（9号，10号和14号）
表达PTEN蛋白（54kDa），这表明PTEN在此三株细胞克隆中得到了稳定表达，且14号
的蛋白表达最强，故将其建立稳定细胞系，即为U87MG-PTEN。
图4WesternBlotting检测PTEN蛋白的稳定表达
Fig.4WesternBlottinganalysisofPTENproteinstableexpression
1:
U87MG细胞
2：
转染pcDNA3.1-/PTEN的9号克隆
3:
转染pcDNA3.1-/PTEN的10号克隆4:
转染pcDNA3.1-/PTEN的14号克隆
-5-
.2图5结果表明，转染pLWERNL的U87MG细胞9号克隆表达EGFR蛋白
170
175
180
（170kDa），而在U87MG细胞和其余转染pLWERNL后所挑取的细胞克隆中均没有检测
到EGFR蛋白的表达，这表明EGFR蛋白在9号克隆中得到了稳定表达，故将其建立稳定
细胞系，即为U87MG-EGFR。
图5WesternBlotting检测EGFR蛋白的稳定表达
Fig.5WesternBlottinganalysisofEGFRproteinstableexpression
1:
U87MG细胞2:
转染pLWERNL的U87MG细胞9号克隆
2.4细胞增殖实验
各组细胞生长曲线见图6。
统计学分析表明，在无血清状态下培养6天后，试验组细胞
U87MG-PTEN、U87MG-EGFRv与对照组细胞U87MG相比，吸光度值都有显著性差异
（P0.05）；而试验组细胞U87MG-EGFR与对照组细胞U87MG相比，吸光度值无显著性
差异（P0.05）。
这表明在无血清状态下，外源性PTEN的表达能抑制U87MG细胞的增殖，
EGFRv能促进U87MG细胞的增殖，而野生型EGFR对U87MG细胞增殖影响不显著。
185
Fig.6
图6各组细胞生长曲线图
cellproliferationunderserumfreeconditions
3讨论
抑癌基因PTEN和原癌基因EGFR功能状态及其基因变异方式与恶性胶质瘤的发生发展
190
195
等生物学行为有密切关系，并且影响胶质瘤的临床治疗效果和预后判定。
PTEN基因编码的
蛋白质具有双特异性蛋白/脂质磷酸酶活性[4]，在诱导细胞周期阻滞和凋亡以及细胞的粘附、
迁移、分化等多方面均起到了至关重要的作用[5-7]。
研究表明，外源性PTEN在PTEN突变
的恶性胶质瘤细胞中的表达，可诱导G1期阻滞，有效抑制肿瘤细胞生长。
在恶性胶质瘤发生和发展过程中,EGFR常常出现基因扩增和重排，导致基因突变使肿
瘤细胞表面的抗原表型发生变化，其中最常见的突变类型为EGFRv，其激活表现为配体
非依赖性酪氨酸激酶组成性激活[8]。
到目前为止，EGFRv在将近61%恶性胶质瘤被检测
到，而在多种正常组织中未检测到。
许多研究表明，EGFRv能促进细胞增殖，抑制细胞凋
-6-
亡，提高肿瘤细胞致瘤性[9]，EGFRvIII还能提高细胞活力，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[10]。
因其只在肿瘤细胞中表达,而在正常细胞中不表达,具有肿瘤特异性,而成为肿瘤靶向治疗的
200
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热点。
在本研究中，将重组真核表达载体pcDNA3.1-/PTEN和pLWERNL分别转染人恶性胶
质瘤细胞U87MG，从基因和蛋白两个水平验证了转染基因的稳定表达，分别建立了稳定表
达外源性PTEN、EGFR基因的细胞系U87MG-PTEN和U87MG-EGFR，并就外源性PTEN、
EGFR和EGFRv基因对细胞增殖的影响进行了研究。
MTT实验表明，PTEN能抑制
U87MG细胞的增殖，EGFRvIII能促进U87MG细胞的增殖，而EGFR对U87MG细胞增殖
影响不显著。
稳定细胞系U87MG-PTEN、U87MG-EGFR和U87MG-EGFRv的成功构建为进一步研
究所转染基因PTEN、EGFR和EGFRv对相关下游细胞信号转导通路的影响及对恶性胶质
瘤发生发展的作用打下良好的基础，从而明确胶质瘤中不同分子亚型的细胞下游相关信号转
导通路的差别，有助于正确区分不同分子亚型不同作用靶点，提出有效的、有针对性的治疗
靶点，为临床应用提供理论依据。
4结论
本研究成功建立稳定表达抑癌基因PTEN、原癌基因EGFR及其突变体EGFRv的人
恶性胶质瘤细胞系。
这为进一步研究所转染基因对相关下游细胞信号转导通路的影响及对恶
性胶质瘤发生发展的作用提供了良好的体外实验模型。
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