离体蟾蜍心脏收缩能力和心率的实验研究实验报告.docx
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离体蟾蜍心脏收缩能力和心率的实验研究实验报告
实验报告
课程名称：
生理科学实验实验类型：
动物实验
实验项目名称：
离体蟾蜍心脏收缩能力和心率的实验研究
同组学生姓名：
指导老师：
实验12离体蟾蜍心脏收缩能力和心率的实验研究
（浙江大学医学院2010级临床医学专业1B班第5组，浙江，杭州，310058）
【摘要】目的了解离体心脏灌流的方法，观察钾、钙离子浓度、肾上腺素、乙酰胆碱对离体蟾蜍心脏活动的影响并探讨作用机制。
方法取离体蟾蜍蛙心，分别用任氏液、无钙、高钙、高钾、乙酰胆碱、肾上腺素等灌流。
结果蟾蜍离体心脏在1ml任氏液加25ul任氏液灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.84±0.16，0.81±0.17，两者有显著差异；1ml任氏液加25ul任氏液灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.95±1.53，3.89±1.49，两者无显著差异；1ml任氏液加25ul任氏液灌流前后，心率（次/分）分别为49.00±6.09，48.90±6.81，两者无显著差异。
蟾蜍离体心脏在无钙任氏液灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.80±0.16，1.18±0.29，两者无显著差异；无钙任氏液灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.83±1.38，1.58±0.42，两者有显著差异；无钙任氏液灌流前后，心率（次/分）分别为48.50±5.95，54.60±14.84，两者无显著差异。
蟾蜍离体心脏在22×10-4mol/L高钙溶液灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.61±0.23，0.53±0.23，两者有显著差异；22×10-4mol/L高钙溶液灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.74±1.17，5.39±1.62，两者有显著差异；22×10-4mol/L高钙溶液灌流前后，心率（次/分）分别为50.20±7.87，49.90±8.32，两者无显著差异。
蟾蜍离体心脏在5.9×10-3mol/L高钾溶液灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.54±0.23，0.77±0.35，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在5.9×10-3mol/L高钾溶液灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.48±1.06，2.04±0.82，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在5.9×10-3mol/L高钾溶液灌流前后，心率（次/分）分别为50.70±9.71，49.50±8.38，两者无显著差异。
蟾蜍离体心脏在9×10-8mol/L乙酰胆碱溶液灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.52±0.26，0.63±0.28，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在9×10-8mol/L乙酰胆碱溶液灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.44±1.12，2.45±0.93，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在9×10-8mol/L乙酰胆碱溶液灌流前后，心率（次/分）分别为50.40±9.56，48.90±8.72，两者有差异。
蟾蜍离体心脏在3×10-6mol/L阿托品灌流后在进行9×10-8mol/L乙酰胆碱灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.68±0.30，0.55±0.28，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在3×10-6mol/L阿托品灌流后在进行9×10-8mol/L乙酰胆碱灌流前后，终末收缩张力（g）分别为2.49±0.89，3.46±1.20，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在3×10-6mol/L阿托品灌流后在进行9×10-8mol/L乙酰胆碱灌流前后，心率（次/分）分别为48.50±8.22，48.60±8.06，两者无显著差异。
蟾蜍离体心脏在6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.42±0.22，0.40±0.31，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.49±1.15，7.99±3.06，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，心率（次/分）分别为52.20±9.69，52.30±9.32，两者无显著差异。
蟾蜍离体心脏在6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.42±0.22，0.40±0.31，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.49±1.15，7.99±3.06，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，心率（次/分）分别为52.20±9.69，52.30±9.32，两者无显著差异。
蟾蜍离体心脏在5×10-6mol/L普洛奈尔灌流后再进行6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.48±0.23，0.48±0.24，两者无显著差异；蟾蜍离体心脏在5×10-6mol/L普洛奈尔灌流后再进行6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，终末收缩张力（g）分别为2.25±1.17，2.23±1.08，两者无显著差异；蟾蜍离体心脏在5×10-6mol/L普洛奈尔灌流后再进行6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，心率（次/分）分别为47.30±9.51，48.90±9.48，两者有差异。
结论各因素主要通过改变蟾蜍离体蛙心的胞内钙离子浓度或是作用于心脏受体，最终影响心肌的兴奋-收缩耦联和自律性，导致心肌收缩能力和心率的改变。
【关键词】蟾蜍，终末收缩压，终末舒张压，心率，乙酰胆碱，肾上腺素。
作为蛙心起搏点的静脉窦能按一定节律自动产生兴奋，因此，只要将离体的蛙心保持在事宜环境中，在一定时间内仍能产生节律性兴奋和收缩活动。
心脏正常的节律性活动需要一个适宜的理化环境，离体心脏也是如此[1]。
离体心脏脱离了机体的神经支配和全身体液因素的直接影响，本实验通过改变灌流液的某些成分，观察其对心脏的活动作用。
1.材料与方法
1.1.实验对象中华蟾蜍指名亚种蟾蜍（ZhuoshanToad）10只，雌雄不拘，体重82.5±10.2g。
1.2.实验试剂肾上腺素（adrenalinehydrochloride）,乙酰胆碱（acetylcholinechloride），普萘洛尔（propranololhydrochloride）,阿托品（atropinesulfate），氯化钾，氯化钙，任氏液（Ringer’ssolution）。
1.3.实验仪器RM6240多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂），JZJ01张力换能器（成都仪器厂）。
1.4.实验方法
1.4.1.仪器连接和参数张力换能器接RM6240多道生理信号采集处理系统第1通道,RM6240多道生理信号采集处理系统采样频率：
800Hz，时间常数：
直流，滤波：
30Hz，灵敏度：
7.5g。
调零。
1.4.2.离体蟾蜍心脏标本制备蟾蜍毁脑脊髓，蟾蜍仰卧于蛙板，打开蟾蜍胸腔，暴露心脏，结扎下腔静脉，靠头端结扎左主动脉，在左、右主动脉下穿线，在左主动脉根部剪一斜口，将插管插入动脉圆锥，在心室收缩时将插管插入心室，结扎固定，游离心脏。
1.4.3.心脏与换能器连接将蛙心插管固定在夹具上，用与张力换能器连接的蛙心夹在心室舒张期夹住心尖，调节微调使心脏舒张末期张力至1g。
1.4.4.稳定扫描速度调整为5s/div。
向插管加1mL任氏液，稳定10min以上。
试验开始前，如前负荷小于1g，再调至1g稳定。
1.4.5.心搏曲线稳定后记录正常的心搏曲线45s。
加任氏液25l，稳定45s（意义？
）。
1.4.6.无钙任氏液1ml替换插管内的任氏液，心搏曲线稳定后记录45s。
1.4.7.用任氏液洗脱3次，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，向灌流液中加0.045mol/LCaCl2溶液25l，心搏曲线稳定后记录45s。
1.4.8.用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，在任氏液中加0.2mol/LKCl溶液20l，心搏曲线稳定后记录45s。
1.4.9.用新鲜任氏液换洗数次，加入1ml任氏液，待曲线稳定后记录45s，在任氏液中加6×10-6mol/L的acetylcholine（ACh）溶液15l，心搏曲线稳定后记录45s。
再加2×10–4mol/Latropine（Atr）15l，心搏曲线稳定后记录45s。
1.4.10.用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，在任氏液中加6×10-5mol/L的adrenaline（Adr）溶液10l，心搏曲线稳定后记录45s。
1.4.11.用任氏液洗脱数次，收缩曲线基本恢复后，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，在任氏液中加5×10-4mol/Lpropranolol（Pro）溶液10l，心搏曲线稳定后记录45s，再加入6×10-5mol/L的Adr溶液10l，心搏曲线稳定后记录45s。
1.5.数据统计结果以xs表示，统计学分析采用Studentt-test方法。
2.结果
2.1.各处理因素灌流前后张力和心率的变化见表1。
表1.各处理因素灌流前后张力和心率的变化
Groups
EDT（g）
EST（g）
Heartrate（bpm）
control
perfusion
control
perfusion
control
perfusion
25ulRinger’ssolution
0.84±0.16
0.81±0.17**
3.95±1.53
3.89±1.49
49.00±6.09
48.90±6.81
Ca2+-freeRinger’ssolution
0.80±0.16
1.18±0.29**
3.83±1.38
1.58±0.42**
48.50±5.95
54.60±14.84
Ca2+22×10-4mol/LRinger’ssolution
0.61±0.23
0.53±0.23**
3.74±1.17
5.39±1.62**
50.20±7.87
49.90±8.32
K+5.9×10-3mol/LRinger’ssolution
0.54±0.23
0.77±0.35**
3.48±1.06
2.04±0.82**
50.70±9.71
49.50±8.38
9×10-8mol/LACh
0.52±0.26
0.63±0.28**
3.44±1.12
2.45±0.93**
50.40±9.56
48.90±8.72*
3×10-6mol/LAtr+9×10-8mol/LACh
0.68±0.30
0.55±0.28**
2.49±0.89
3.46±1.20**
48.50±8.22
48.60±8.06
6×10-7mol/LAdr
0.42±0.22
0.40±0.31**
3.49±1.15
7.99±3.06**
52.20±9.69
52.30±9.32
5×10-6mol/LPro+6×10-7mol/LAdr
0.48±0.23
0.48±0.24
2.25±1.17
2.23±1.08
47.30±9.51
48.90±9.48*
注：
n=10;*p<0.05,**p<0.01vscontrol;#p<0.05,##p<0.01vs9×10-8MAChgroup
加乙酰胆碱组和加肾上腺素组由于第4组数据在平均值加减两个标准差以外，未被作为可用数据纳入结果。
2.2.蟾蜍离体心脏在1ml任氏液加25ul任氏液灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.84±0.16，0.81±0.17，两者有显著差异；1ml任氏液加25ul任氏液灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.95±1.53，3.89±1.49，两者无显著差异；1ml任氏液加25ul任氏液灌流前后，心率（次/分）分别为49.00±6.09，48.90±6.81，两者无显著差异。
2.3.蟾蜍离体心脏在无钙任氏液灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.80±0.16，1.18±0.29，两者无显著差异；无钙任氏液灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.83±1.38，1.58±0.42，两者有显著差异；无钙任氏液灌流前后，心率（次/分）分别为48.50±5.95，54.60±14.84，两者无显著差异。
2.4.蟾蜍离体心脏在22×10-4mol/L钙溶液灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.61±0.23，0.53±0.23，两者有显著差异；22×10-4mol/L高钙溶液灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.74±1.17，5.39±1.62，两者有显著差异；22×10-4mol/L高钙溶液灌流前后，心率（次/分）分别为50.20±7.87，49.90±8.32，两者无显著差异。
2.5.蟾蜍离体心脏在5.9×10-3mol/L钾溶液灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.54±0.23，0.77±0.35，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在5.9×10-3mol/L高钾溶液灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.48±1.06，2.04±0.82，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在5.9×10-3mol/L高钾溶液灌流前后，心率（次/分）分别为50.70±9.71，49.50±8.38，两者无显著差异。
2.6.蟾蜍离体心脏在9×10-8mol/L乙酰胆碱溶液灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.52±0.26，0.63±0.28，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在9×10-8mol/L乙酰胆碱溶液灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.44±1.12，2.45±0.93，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在9×10-8mol/L乙酰胆碱溶液灌流前后，心率（次/分）分别为50.40±9.56，48.90±8.72，两者有差异。
2.7.蟾蜍离体心脏在3×10-6mol/L阿托品灌流后在进行9×10-8mol/L乙酰胆碱灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.68±0.30，0.55±0.28，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在3×10-6mol/L阿托品灌流后在进行9×10-8mol/L乙酰胆碱灌流前后，终末收缩张力（g）分别为2.49±0.89，3.46±1.20，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在3×10-6mol/L阿托品灌流后在进行9×10-8mol/L乙酰胆碱灌流前后，心率（次/分）分别为48.50±8.22，48.60±8.06，两者无显著差异。
2.8.蟾蜍离体心脏在6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.42±0.22，0.40±0.31，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，终末收缩张力（g）分别为3.49±1.15，7.99±3.06，两者有显著差异；蟾蜍离体心脏在6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，心率（次/分）分别为52.20±9.69，52.30±9.32，两者无显著差异。
2.9.蟾蜍离体心脏在5×10-6mol/L普洛奈尔灌流后再进行6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，终末舒张张力（g）分别为0.48±0.23，0.48±0.24，两者无显著差异；蟾蜍离体心脏在5×10-6mol/L普洛奈尔灌流后再进行6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，终末收缩张力（g）分别为2.25±1.17，2.23±1.08，两者无显著差异；蟾蜍离体心脏在5×10-6mol/L普洛奈尔灌流后再进行6×10-7mol/L肾上腺素灌流前后，心率（次/分）分别为47.30±9.51，48.90±9.48，两者有差异。
3.讨论
3.1.本实验研究的心脏收缩末期张力和舒张末期张力主要与心脏的收缩能力和前负荷有关，实验中的前负荷包括插管中的液体与张力夹的作用。
蟾蜍离体蛙心用1ml任氏液外加25ul任氏液灌流，蛙心舒张末期的张力发生显著变化，可能与插管液过多，或是进行实验时，张力并未稳定所致。
3.2.心脏的收缩能力受多种因素的影响，凡能影响心肌细胞兴奋-收缩耦联过程中各个环节的因素都可能影响收缩能力[2]。
蛙心用无钙任氏液灌流后，终末收缩张力减小，这是因为胞外严重低钙使心肌兴奋性降低，且胞质内Ca2+浓度下降，使横桥的激活数量下降，导致心肌的收缩能力降低；终末舒张张力减小的是因为收缩张力变小使得舒张势能减小，舒张的能力减弱，从实验结果中看到，终末舒张张力的变化和收缩张力的变化相反，此均是由于舒张势能所致。
相对地，蟾蜍离体心脏在22×10-4mol/L钙溶液灌流后，终末收缩张力变大，是由于胞外钙离子浓度增大，钙离子内流增多，使得终池释放的钙离子增多，胞内钙离子浓度上升使得活化的横桥数目变多，所以收缩能力上升。
蟾蜍离体心脏在5.9×10-3mol/L高钾溶液灌流后，终末收缩张力降低，是因为细胞外液Ca2+、K+存在竞争性抑制关系[3]，K+浓度升高可使Ca2+内流减少，使得兴奋-收缩耦联作用减弱，心肌收缩力下降。
3.3.离体蛙心在9×10-8mol/L乙酰胆碱溶液灌流后，终末收缩张力下降，舒张张力上升，心率减慢。
乙酰胆碱为胆碱能受体激动药[4]可通过激动M胆碱能受体激活IP3，二酰甘油等级联机制，产生负性频率和负性肌力作用。
蟾蜍离体蛙心在3×10-6mol/L阿托品灌流后再进行9×10-8mol/L乙酰胆碱灌流后，终末收缩张力升高，终末舒张张力降低。
由于阿托品阻断了M胆碱受体，所以乙酰胆碱激动N胆碱受体的作用表现出来，使得心肌收缩能力增强。
而另一种体液因素肾上腺素却有不用的结果。
蟾蜍离体心脏在6×10-7mol/L肾上腺素灌流后，终末收缩张力增加，终末舒张张力减弱，这是因为肾上腺素主要作用于心脏的ß受体，产生正性的变力作用，使心脏收缩力增强。
而蟾蜍离体心脏在5×10-6mol/L普洛奈尔灌流后再进行6×10-7mol/L肾上腺素灌流，终末收缩张力和舒张张力均无显著变化，是因为普萘洛尔是ß肾上腺素受体阻断药[4]，它阻断了肾上腺素对心脏ß受体的作用。
3.4.实验结果误差的产生因素的思考
由于手术中伤及静脉窦或是心脏传导系统，导致离体蛙心心率失常，影响实验结果的准确性。
蛙心夹夹破蛙心的心尖，使得灌流液漏出，前负荷改变，影响实验结果的准确性。
第一次实验时，未待张力完全稳定便进行实验，使得第一次实验的终末舒张压力有差异。
换液时未完全洗净，使得上一次的灌流液有残留，影响下一次实验结果。
阻断药物如阿托品和普萘洛尔，尤其是作用较缓慢的普萘洛尔，未待齐完全作用，便加入受体激动剂，使得实验结果有误，如普萘洛尔后加入肾上腺素，使得心率上升。
3.5.对实验设计的建议
由于第一次加25ul任氏液是为了观察与后续药品最大剂量等同的液体后会不会对蛙心收缩产生影响，那么第一次所加任氏液应为最大剂量30ul。
参考文献
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[4]杨世杰.药理学[M].北京：
人民卫生出版社.2010：
56,82,95页
致谢
这次实验是在指导老师和许多同学的大力帮助下完成的，对此我深表感谢。
在本次实验非常艰难的过程中，我也体会到了做科研的不易，在此向所用科研人员致以敬意。
本次实验不仅教会了我实验技术，还让我懂得同组的相互配合和明确的分工有多重要，更让我懂得做实验要事先明确实验目的和步骤才能使实验高效完成。
为此，我再一次谢谢指导老师和同组的同学，没有你们的帮助，我无法在本次实验中收获那么大。
谢谢！
附录
附表1.离体蛙心加25ul任氏液的观察指标变化原始数据表
组别
终末舒张张力
终末收缩张力
心率
处理前
处理后
处理前
处理后
处理后
处理后
1
0.71
0.66
4.51
4.57
55.00
57.00
2
0.86
0.82
4.68
4.75
37.00
35.00
3
0.92
0.86
2.95
2.85
51.00
50.00
4
0.80
0.77
4.61
4.49
56.00
56.00
5
0.95
0.92
3.14
2.97
44.00
44.00
6
1.02
0.99
3.41
3.44
46.00
45.00
7
0.45
0.42
2.13
2.18
54.00
54.00
8
0.98
0.97
7.20
6.95
48.00
49.00
9
0.83
0.81
2.11
2.03
54.00
54.00
10
0.89
0.89
4.71
4.62
45.00
45.00
附表2.蟾蜍离体心脏无钙任氏液灌流的观察指标变化原始数据表
组别
终末舒张张力
终末收缩张力
心率
处理前
处理后
处理前
处理后
处理后
处理后
1
0.70
0.91
4.50
1.41
54.00
62.00
2
0.79
1.15
4.95
1.65
36.00
36.00
3
0.85
1.06
2.86
1.42
50.00
49.00
4
0.77
1.14
4.57
1.57
55.00
62.00
5
0.90
1.36
2.99
1.56
45.00
43.00
6
0.97
1.24
3.33
1.52
45.00
89.00
7
0.42
0.59
2.18
0.79
54.00
58.00
8
0.95
1.59
6.34
2.35
48.00
49.00
9
0.80
1.19
2.00
1.45
53.00
55.00
10
0.89
1.54
4.62
2.11
45.00
43.00
附表3.蟾蜍离体心脏22×10-4mol/L钙溶液灌流的观察指标变化原始数据表
组别
终末舒张张力
终末收缩张力
心率
处理前
处理后
处理前
处理后
处理后
处理后
1
0.40
0.30
3.57
5.68
59.00
59.00
2
0.59
0.44
4.95
8.45
35.00
34.00
3
0.62
0.46
3.12
5.42
51.00
51.00
4
0.60
0.54
4.05
5.17
57.00
53.00
5
0.83
0.71
2.62
5.41
48.00
47.00
6
0.90
0.84
3.33
4.26
46.00
46.00
7
0.25
0.21
2.30
3.75
56.00
55.00
8
0.85
0.80
5.94
7.37
51.00
51.00
9
0.29
0.27
2.75
2.89
58.00
62.00
10
0.75
0.72
4.72
5.50
41.00
41.00
附表4.蟾蜍离体心脏在5.9×10-3mol/L钾溶液灌流前后的变换原始数据表
组别
终末舒张张力
终末收缩张力
心率
处理
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