脂肪酶的微生物生产技术综述.docx

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脂肪酶的微生物生产技术综述

脂肪酶的微生物生产技术综述

By夏远川

脂肪酶是一种普遍存在于动植物和微生物体内的酶，也是最早研究的酶类之一，早在1834年就有关于兔胰腺脂肪酶活性的报道。

[1]

脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，一般用于催化水解和合成反应，在油水界面上，它催化三酰甘油的酯键的水解，生成甘油一酯、甘油二酯或直接生成甘油和脂肪酸。

[2]脂肪酶还可催化酯类化合物的醇解、酯化、酯交换等反应，且不需要辅酶，在工业生产和研究工作中均有广泛应用。

[3]

脂肪酶按作用时的适应温度可分为高温脂肪酶、中温脂肪酶、低温脂肪酶；按适宜pH可分为碱性脂肪酶、中性脂肪酶、酸性脂肪酶。

脂肪酶的主要工业应用方向：

1、洗涤工业：

在洗涤剂中添加脂肪酶可使洗涤剂对脂质类污渍的去除效果大大提高，并可减少表面活性剂及无机助剂（尤其是三聚磷酸钠）的用量，大大减少洗涤剂带来的环境污染。

用于洗涤剂的脂肪酶为碱性脂肪酶，在碱性范围内有活性、活性不受表面活性剂影响、对氧系漂白剂稳定、热稳定性好，并且由于大多数加酶洗涤剂都适当配有蛋白酶，因此用于洗涤剂的脂肪酶还应具抗蛋白酶降解的能力。

[4]

1988年，丹麦NOVO公司将碱性脂肪酶应用于洗涤剂中并推向市场。

1992年，这家公司构建了商业上第一株产脂肪酶菌株。

[1]

2、食品工业：

油脂改性是食品加工过程中的一个重要环节，脂肪酶可通过催化酯交换、酯转移、水解等反应，改变油脂的的物理化学性质，使便宜的、营养价值低的油脂升级为昂贵的、营养价值高的油脂；此外脂肪酶还可用于合成广泛应用于食品工业的糖酯类产品、合成不带副产物或毒性物质的芳香味酯类化合物、合成抗坏血酸酯类抗氧化剂如异抗坏血酸等。

[5]

3、造纸工业：

使用脂肪酶处理纸浆可减少胶黏物（绝大多数胶黏物都含有大量酯键）对造纸毛毯网间空隙的堵塞，提高纸机的运行效率和成纸品质，并降低环境污染，减少废水处理的负荷。

此外脂肪酶脱墨技术在废纸利用方面也起到非常大的作用，与传统脱墨技术相比脱墨效果更好环境污染更低，具有很大的优势。

[6]

4、皮革生产：

脂肪酶应用于制革和毛皮加工过程中的脱脂，相对于传统的脱脂方法具有脱脂均匀、脱脂废液中的油脂更易分离回收、减少甚至不使用表面活性剂、降低生产成本、提高成品质量等诸多优点，将碱性脂肪酶与脱脂剂在碱性条件下进行毛革两用皮革的脱脂，可大大提高脱脂效果。

[7]

此外脂肪酶在饲料工业、生物表面活性剂、化妆品、生物传感、聚合物合成、手性化合物拆分、生物柴油等方面都具有重要的应用前景。

由于微生物生长繁殖快、所产脂肪酶种类多、微生物脂肪酶具有比动植物来源的脂肪酶更广的作用条件范围，且多为胞外酶，更适合于工业规模生产和获得高纯度产品，因此成为工业用脂肪酶的主要来源。

[7]上世纪初，微生物学家Eijjkmann发现了微生物脂肪酶并报道了一些能够产生和分泌脂肪酶的细菌，从此拉开了微生物脂肪酶研究的序幕，80年代后期至今，非水解酶学与界面酶学的理论研究及工业应用取得了突破性进展，极大促进了微生物脂肪酶的开发利用。

[1]

产脂肪酶的微生物在自然界中分布广泛，如植物油处理加工厂、工业废水、牛奶厂及被油污染的环境中均可以筛选到产脂肪酶的微生物，国内外研究较多的有根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶、青霉脂肪酶、毛霉脂肪酶、地酶脂肪酶和细菌脂肪酶。

[8]在不同条件下进行菌种选育可得到适宜不同生产条件的脂肪酶的生产菌种。

1、菌种的分离筛选

（1）采样

应从富含油脂的环境中采取样品进行筛选，常见的有：

1、食堂餐厅和小餐馆排污处、户外烧烤摊、厨房、油脂化工厂排污池等长期被油脂污染的土壤、油垢、污水。

2、小笼包蒸屉垫等经常接触油脂的家居用品。

3、产油作物如菜籽等。

4、如需筛选能生产在特殊条件下保持活性的脂肪酶的菌种，则需相应改变取样范围。

例：

付建红等人[9]在2009年公开的专利中，筛选低温条件下保持活性的脂肪酶的生产菌时采取的样本为新疆高寒地区的含油冻土样本。

（2）富集培养

用于筛选脂肪酶生产菌的富集培养基含有酯类物质，通常为橄榄油或聚乙烯醇橄榄油乳化液，根据所需脂肪酶的不同调节pH和培养温度。

刘瑞娟等人[10]在2009年发表的文章中，低温碱性脂肪酶产生菌筛选时使用了pH值为9.5的富集培养基。

[10]

（3）分离鉴定

初筛通常使用平板指示剂法，根据所使用指示剂不同有以下几种常用方法：

1、维多利亚蓝B指示剂染料法：

通过在含酯类的培养基中加入维多利亚蓝B来筛选脂肪酶产生菌，能产生脂肪酶的菌落会在平板上形成蓝色增色圈。

[11]

2、三丁酸甘油酯琼脂平板透明圈法：

在培养基中添加三丁酸甘油酯乳化液，对待分离样本进行培养，根据菌株是否生长及菌株透明圈的大小对菌株进行性质分类，圈大且清晰的为优良的生产菌株。

[12]

3、罗丹明B平板测定法：

在含酯类的培养基中添加罗丹明B来筛选脂肪酶产生菌，产脂肪酶的菌株会在平板上形成红色水解圈，在350nm的紫外光下，水解圈具有橘黄色荧光。

[13]

4、溴甲酚紫显色培养基测定法：

在含酯类的培养基中添加溴甲酚紫，产脂肪酶的菌株会在平板上形成黄色的水解圈。

[14]

复筛时除使用平板法外还可使用摇瓶法：

在发酵培养基中培养菌株，离心后测定脂肪酶活性，筛选出产脂肪酶能力更强的菌株，多次重复即可筛选出样本中产脂肪酶能力最强的菌株。

如王莎莉等人[15]在2016年使用添加有橄榄油和曲拉通的复筛/发酵培养基，筛选得到单位酶活为2.14U/mL的高产脂肪酶菌株。

摇瓶法与平板法的不同在于其在测定菌株是否产脂肪酶的基础上测定了菌株产脂肪酶的能力，因此比平板法更适用于复筛阶段。

摇瓶法的核心在于测定酶活，常用的脂肪酶活性检测方法有碱滴定法、对硝基苯酚法和铜皂法[16]：

1、碱滴定法：

以橄榄油作为底物，酚酞作为指示剂，使用NaOH标准溶液进行滴定，滴定时的空白对照组采用95%乙醇使脂肪酶样品失活。

此法脂肪酶酶活力单位定义为：

在一定条件下，1min释放出1mol脂肪酸的酶量定义为一个脂肪酶活力单位（U）。

碱滴定法稳定性较差，易产生误差，但耗时较短，可用于粗略的测定。

2、对硝基苯酚法：

以对硝基苯酚棕榈酸酯作为底物，加入样品酶反应一定时间后以乙醇或丙酮终止反应，在405nm测定吸光度并根据对硝基苯酚的吸光度-浓度曲线计算生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。

此法脂肪酶酶活力单位定义为：

在一定条件下，1min释放出1mol对硝基苯酚的酶量定义为一个脂肪酶活力单位（U）。

江慧芳等人[16]在2007年发表的文章中将终止反应的乙醇或丙酮改为三氯乙酸，使反应终止方法更有效，相对碱滴定法而言结果更稳定、重复性更好，且比铜皂法用时更短，是进行大量脂肪酶活力的快速测定的较好选择。

3、铜皂法：

铜皂法通过在脂肪酸中加入Cu+化合物作为显色剂，形成绿色络合物后测定吸光度为原理。

通常采用橄榄油为底物，与样品酶反应后采用苯或甲苯萃取生成的脂肪酸，加入显色剂后在710nm下测定吸光度，并根据油酸标准溶液吸光度工作曲线计算生成的脂肪酸量，进而计算出酶活力。

此法脂肪酶酶活力单位定义为：

在一定条件下，1min释放出1mol脂肪酸的酶量定义为一个脂肪酶活力单位（U）。

铜皂法结果稳定重复性好但用时较长，适用于脂肪酶活力的精确测量。

以上三种常用的脂肪酶活测定方法中，碱滴定法属于滴定分析法，对氨基苯酚法和铜皂法属于光谱法；此外还有许多利用脂肪酶的水解特性来测定脂肪酶活性的方法[1]：

色谱法、放射性、界面张力测量学、比浊法、电导分析法、免疫法、显微镜观察法等。

根据轻工业联合会提出的GB/T23535-2009脂肪酶制剂国家标准中，测定脂肪酶（以淀粉质（或糖质）为原料，经微生物发酵、提纯制得的中性脂肪酶制剂）酶活的方法为碱滴定法。

[17]

2、菌种的改良

（1）自然选育：

不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。

李扬等人[18]从小笼包蒸屉垫中筛选得到了两株脂肪酶高产菌株J2和J3，分别属于出芽短梗霉属的两个变体，以对硝基苯酚法测得J2和J33发酵上清液中的脂肪酶酶活分别为10.61U/mL和14.43U/mL。

（2）诱变育种：

诱变育种即利用人为添加的诱变剂处理微生物细胞以提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产菌种的育种方法。

常用的诱变剂包括物理、化学和生物三大类。

1、物理诱变剂：

常用的物理诱变剂有：

紫外线、快中子、X射线、β射线、γ射线、激光。

袁强等人[19]采用紫外诱变的方法对产脂肪酶的细菌菌株进行诱变和筛选，得到诱变株命名为U12，脂肪酶酶活（60.25U/mL）比原始相对出发菌株酶活提高220%，经五次传代实验平均酶活为58.63U/mL，相对诱变原菌降低2.69%。

周延等人[20]研究了从土壤中筛选的脂肪酶产生菌，利用紫外线、快中子、快中子和磁场复合、γ射线、γ射线和磁场复合进行诱变育种，得到一株酶活为396.22U/mL的诱变株，比出发菌株高92倍。

在后续研究中初步探讨了快中子、γ射线及磁场复合处理在脂肪酶产生菌中诱变的作用，认为三种方法中，在产脂肪酶的诱变中，快中子诱变更为有效。

郑敏等人[21]利用XeCl准分子紫外激光照射少根根霉孢囊孢子，筛选到8株脂肪酶活提高幅度10%以上的菌株，其中包括一株酶活较出发菌株提高55.1%的突变株。

2、化学诱变剂：

可用于产脂肪酶的菌种选育的化学诱变剂有硫酸二乙酯（DES）、LiCl、亚硝基胍、盐酸羟胺等。

化学诱变剂一般不单独使用。

李忠英等人[22]以紫外线（UV）与硫酸二乙酯（DES）复合诱变处理，筛选出酶活为14.85U/mL的突变菌，比出发菌株提高48.2%。

苗长林等人[23]采用微博-亚硝基胍复合诱变法处理米黑根毛霉，筛选出一株酶活比出发菌提高105%的突变株。

3、生物诱变剂：

常见的生物诱变剂有噬菌体和转座子，中文期刊中鲜少有此类方法对脂肪酶产生菌进行诱变育种的报道。

（3）杂交育种

杂交育种是将不同菌株的遗传物质进行交换重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中。

杂交法局限大，杂交率低，因此利用此法选育脂肪酶高产菌株的报道很少。

但有与基因工程相结合的同源高效表达技术的研究。

如华中科技大学硕士研究生郭道义[24]通过运用PCR方法从高产脂肪酶的洋葱假单胞菌G63克隆了脂肪酶基因及其伴侣基因，将其克隆岛广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上，构建质粒pBBR-LipAB,通过三亲杂交，在辅助质粒pRK2013的帮助下，使该基因在原始菌株中高效表达，所构建的工程菌较原始菌株酶活提高3.6倍。

（四）原生质体融合

原生质体融合技术是将两个已经去细胞壁处理释放出原生质的细胞释放在高渗环境中，在助融剂或电场作用下使之发生细胞融合，实现遗传重组。

原生质体融合技术提供了充分利用遗传重组杂交的方法。

段学辉等[25]进行了假丝酵母和白地霉的原生质体融合研究，选育获得一株融合株CG16，其表型遗传性状和发酵性能稳定，产酶活力好，固态发酵脂肪水解酶活达到82.22U/g干物质，比亲本假丝酵母和白地霉的产酶活力分别提高了32%和171%。

（五）低能离子注入技术

生物离子注入技术的基本原理是利用低能离子与生物体作用产生辐射损伤，从而诱导产生可遗传变异，因此也属于辐射生物技术。

但它与γ射线及宇宙射线育种等有一定的区别。

低能离子注入技术在诱变过程中，除离子束的能量对生物体具有作用外，离子本身最终会留在生物体内，对其变异产生影响。

低能离子注入技术具有生理损伤小，、突变谱广、突变频率高等优点，并具有一定的重复性和方向性。

[26]

冀颐之等人[27]将出发菌株（根霉）单孢子悬浮液涂于N+离子注入载体硅片上，无菌风吹干后将其装入低能加速器（离子注入机）靶室中进行注入诱变，该实验获得的高产脂肪酶突变株N103，在摇瓶发酵条件下，测得脂肪酶水解酶活为175U/mL，为出发菌株的165%，且有较好的遗传稳定性。