棉花GhLAR基因过表达载体的构建开题报告.docx

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棉花GhLAR基因过表达载体的构建开题报告

石河子大学毕业论文（设计）选题指南

农学院学院农学专业09级

（2）班年级

指导教师

李艳军

职称

讲师

填报时间

2011年4月3日

课题名称

棉花GhLAR基因过表达载体的构建

课题来源

1科研题目√2生产现场3自拟题目

课题类型

1论文型√2设计型

完成课题所需时间

一年

所需学生人数

1

实习（考察）地点

论文（设计）地点

绿洲生态实验室

立题依据

天然彩色棉是一种成熟吐絮时，棉纤维自身具有棕、绿等天然色彩的棉花。

由于纺织利用不需印染，可以降低化学印染的成本（约占纺织品成本的一半），减少淡水和能源消耗，避免环境污染，符合当前人们注重环保、崇尚自然的消费潮流，具有十分广阔的市场前景。

在全世界，目前已知天然彩色棉品种资源全部属于棕色和绿色系列，颜色单调、纤维品质差、色牢度及色饱和度不足成为限制彩色棉产业发展的技术瓶颈。

由于现有彩色棉缺乏除棕色、绿色之外的其它颜色的种质资源，用传统的遗传育种手段无法解决目前彩色棉颜色单调和色饱和度低的问题，利用基因工程手段来解决这些难题是一条可行的途径。

因此，克隆彩色棉纤维色素合成相关基因，明确基因的功能，将对利用基因工程的手段解决目前彩色棉品种颜色单调、着色不均匀、色牢度和色饱和度低的难题具有十分重要的理论意义和应用价值。

本课题预期目标

以棉花LAR基因为目标基因，采用Gateway高效克隆技术，构建该基因RNA超表达载体，为进一步转化植物研究LAR基因功能奠定基础，为利用基因工程培育棉花新种质提供参考。

提供的外部条件

（1）查阅了大量的文献，为课题的研究创造了一定的条件；

（2）试验仪器设备己具备；

（3）具备相应的数据处理统计分析软件。

主要参考资料.

[1]DuX-M（杜雄明）,ZhangT-Z（张天真）,YuanY-L（袁有禄）.Adancesandprospectofcoloredcotton.ChiAgriSci（中国农学通报）,1997;13（3）:

30-32（inChinesewithEnglishabstract）

[2]BushmanW,ThompsonJF,VargasL,etal.Controlofdirectionalityinlambdasitespecificrecombination[J].Science,1985,230（4278）:

906–911.

[3]HartleyL,TempleGF,MichaelA,etal.DNACloningUsingInVitroSite-SpecificRecombination[J].GenomeResearch,2000,10（11）:

1788–1795.

[4]LandyA.Dynamic,structural,andregulatoryaspectsoflambdasite-specificrecombination[J].AnnuRevBiochem,1989,58:

913–49.

[5]马建,厉志,刘艺苓,等.应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体[J].大豆科学,2008,27（4）:

565–568.

相邻课题情况或子课题情况

无

填报人（签字）：

填报日期：

2011年4月3日

系（教研室）审核意见：

系（教研室）主任（签字）

年月日

院毕业论文（设计）工作领导小组审核意见：

学院（签章）

组长（签字）：

年月日

注：

1.本表用于各专业教师拟订毕业论文（设计）课题和各院的毕业论文（设计）工作领导小组审核毕业论文（设计）课题的可行性用。

2.根据教师拟订该毕业论文（设计）课题所需学生人数，应在“相邻课题情况或子课题情况”栏内填写出每个学生应做的子课题情况，保证一生一题。

3.每个毕业论文（设计）课题应填写该表一份。

各院分专业整理存档。

石河子大学毕业论文（设计）任务书

农学院学院农学专业09级

（2）班年级

课题名称

棉花GhLAR基因过表达载体的构建

毕业论文（设计）起止时间

2011.4.20-2013.6（共108周）

指导教师

李艳军

职称

讲师

学生姓名

王涛

学号

2009123449

任务下达日期

2011年4月20日

课题内容

（1）PCR扩增GhLAR基因；

（2）利用gateway技术构建棉花LAR基因的超表达载体。

课题任务的具体要求

（1）态度认真严谨，有较强的动手能力。

（2）能够掌握分子生物学领域的基本操作技能，并学习对数据进行分析处理。

拟定的工作进度

（1）2011.4－2012.3资料文献收集阅读

（2）2012.4－2012.12开展试验，分析结果

（3）2013.1－2013.2撰写论文

（4）2013.2－2013.6论文评阅，答辩

主要参考文献

[1]DuX-M（杜雄明）,ZhangT-Z（张天真）,YuanY-L（袁有禄）.Adancesandprospectofcoloredcotton.ChiAgriSci（中国农学通报）,1997;13（3）:

30-32（inChinesewithEnglishabstract）

[2]BushmanW,ThompsonJF,VargasL,etal.Controlofdirectionalityinlambdasitespecificrecombination[J].Science,1985,230（4278）:

906–911.

[3]HartleyL,TempleGF,MichaelA,etal.DNACloningUsingInVitroSite-SpecificRecombination[J].GenomeResearch,2000,10（11）:

1788–1795.

[4]LandyA.Dynamic,structural,andregulatoryaspectsoflambdasite-specificrecombination[J].AnnuRevBiochem,1989,58:

913–49.

[5]马建,厉志,刘艺苓,等.应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体[J].大豆科学,2008,27（4）:

565–568.

任务下达人（签字）日期：

2011年4月20日

任务接受人（签字）日期：

2011年4月20日

注：

1．此任务书由指导教师填写，任务下达人为指导教师，指导教师和接受任务的学生均应签字。

2．此任务书最迟必须在学生毕业实践环节开始前一周下达给学生。

石河子大学

毕业论文（设计）开题报告

课题名称：

棉花GhLAR基因过表达载体的构建

学生姓名：

王涛

学号：

2009123449

学院：

农学院

专业、年级：

农学2009-

（2）班

指导教师：

李艳军

职称：

讲师

毕业论文（设计）起止时间：

2011.4.20～2013.6

一、本课题来源及研究的目的和意义

随着社会的发展和进步，人们越来越追求产品的健康、环保、无污染。

国际有机农业委员会预测，在未来的30年内，全世界有机棉花的产量将占到棉花总产量的30%，约400万吨。

但是有机棉的生产只是解决原棉生产的无污染，还不能避免纺织品化学印染带来的化学品对人们健康的危害。

天然彩色棉花是一种成熟吐絮时，棉纤维自身具有棕、绿等天然色彩的棉花，由于纺织利用不需印染，可以降低化学印染的成本（约占纺织品成本的一半），减少淡水和能源消耗，避免环境污染，符合当前人们注重环保、崇尚自然的消费潮流，具有十分广阔的市场前景。

在全世界，目前已知天然彩色棉品种资源全部属于棕色和绿色系列颜色单调、纤维品质差、色牢度及色饱和度不足成为限制彩色棉产业发展的技术瓶颈。

近年来，科研人员利用远源杂交、复合杂交和连续定向选育的方法使彩色棉的纤维长度、强力和产量得到大幅度提高，有些品种在纤维品质和产量方面已接近推广的白色棉花品种。

但是，由于现有彩色棉缺乏除棕色、绿色之外的其它颜色的种质资源，用传统的遗传育种手段无法解决目前彩色棉颜色单调和色饱和度低的问题。

人们寄希望利用基因工程技术来创造新色彩彩色棉品种，但是由于人们对天然彩色棉纤维色素形成分子机制还不清楚，利用转基因技术改良彩色棉纤维色泽品质的研究进展缓慢。

因此，克隆彩色棉纤维色素合成相关基因，明确色素形成及调控的分子机制，将对利用基因工程的手段解决目前彩色棉品种颜色单调、着色不均匀、色牢度和色饱和度低的难题具有十分重要的理论意义和应用价值。

二、本课题所涉及的问题在国内（外）研究现状及分析

天然彩色棉并不是近年来才有的，而是自古就存在。

据考证，四千多年前的古印第安人、公元前的墨西哥乌雅族人和近代的中国江浙都有栽培利用天然彩色棉的历史。

后来由于白色棉品质提高和印染工业的飞速发展，天然彩色棉由于颜色单调且不稳定、纤维品质差和产量低等缺点而逐渐被人们冷落。

二十世纪末，健康和环保理念逐渐深入人心，世界范围内掀起了一股绿色消费的热潮。

天然彩色棉重新回到人们的视野。

1982年，SallyVFox开始彩色棉的现代育种，利用美国农业部加利福尼亚试验站保存的彩色棉种质开始进行单株选择。

经过对纤维色泽和品质的多代单株选择和混合选择，于1988年获得第一批可以用于机器纺织的彩色棉品系，1990年她的两个品系获得美国专利。

随后秘鲁、巴西、埃及、法国、独联体国家和中国等纷纷开展彩色棉的育种和生产。

尽管有许多媒体和文献报道天然彩色棉有棕红、粉红、咖啡色、黄色、米色等各种颜色，但基本上都可归为棕色和绿色两类。

近年来，科研人员采用杂交和连续定向选择的方法使彩色棉的纤维品质和产量大幅提高，但是用传统的遗传育种方法无法解决目前彩色棉颜色单调和着色不均匀等问题。

如果无法提供颜色鲜艳、色彩种类丰富的彩色棉产品，将极大地限制彩色棉产业的发展。

从20世纪40年代初，就有人开始研究彩色棉色素。

他们利用各种方法对彩色棉色素进行分离提取，最终得到了纯粹的白色棉，从而证明彩色棉色素是独立于纤维素而存在的物质。

Ryser（1983）利用细胞化学并结合薄层层析方法，在棕色短绒里发现了单宁的前体儿茶素及单宁的衍生物，认为吐絮时短绒表现出的棕色主要是这些物质所致，并且推测棕色纤维的颜色也可能是位于液泡里的由儿茶素衍化的单宁作用的结果。

Yatsu（1983）研究发现棕色棉色素中含有棉花皮素、槲皮素、黄柏素、单宁衍生物等，绿色棉色素不稳定，色素组成比棕色棉复杂，分离提纯受温度、压力、酸碱度影响较大，因此结构分析困难。

Schmutz（1995）等对绿色棉氯仿/甲醇萃取物的研究表明，绿色棉色素结构分为无色和有色两个部分，存在于蜡质中，无色部分鉴定为苯乙烯酸及其衍生物，氯仿/甲醇提取物中黄色化合物的紫外和可见光谱和咖啡酸的酯类似，但没有做进一步研究。

在国内，于伯龄（2001）曾经报道印度种棉花中含有的色素是棉花皮素和槲皮素-7-葡萄糖甙，但并未说明该色素是否从棉花纤维中提取，也没有提供必要的文献出处。

赵向前（2005）对天然棕色棉和绿色棉纤维中色素的成分进行了研究，结果表明甲醇室温提取的棕色棉纤维色素可能是黄酮类化合物，而绿色棉纤维色素除含有黄酮类化合物外，还含有分子结构类似于卢丁的黄酮醇化合物。

詹少华（2004，2006，2007）在纯化棕色棉纤维色素的基础上，通过化学性质鉴定，以及和已知的白色棉种皮色素比较，初步推断棕色棉色素的化学结构，认为棕色棉纤维中的色素不是黄酮类化合物，而是由单宁物质氧化形成的醌类化合物。

Hua（2007，2009）等对彩色棉和白色棉纤维成熟过程中色素沉积和纤维素合成的特点进行了比较研究，指出黄酮可能是彩色棉纤维中合成的主要色素类型。

对于彩色棉色素成分，不同的学者有不同的观点，棉花纤维细胞中色素的种类和性质以及形成机理，仍然是一个尚未深入研究的空白点。

据报道美国FOX公司、中国科学院遗传与发育研究所、中国农科院生物技术所的一些科研人员正尝试利用基因工程的手段创造红、蓝、黑等新色泽彩棉种质，但由于彩色棉色素形成的机制还不清楚，进展十分缓慢。

只有了解棉纤维色素的种类、性质和形成机理，才有可能追索其生物合成途径中的相关基因，才有可能用基因工程手段来改变棉花纤维细胞的颜色。

高等植物的许多器官都具有颜色，类黄酮是植物最主要的色素物质。

类黄酮是一类在植物界广泛存在的低分子量的多酚类次生代谢产物，主要包括查尔酮、黄酮、黄酮醇、黄烷双醇、花色素苷和原花色素等六大类。

目前自然界中已经发现的类黄酮化合物超过6000多种，也是目前研究最为深入的次生代谢途径之一。

科学家们利用蛋白质纯化、转座子标签、PCR及鉴别筛选等手段已从矮牵牛、玉米、金鱼草等植物中分离克隆了许多结构基因和调控基因，如CHS、DFR、Rc、Rd等，并且已经利用转基因技术，将控制类黄酮次生代谢的关键基因或其反义序列导入植物，成功改变了花的颜色或类黄酮物质的积累量。

由于缺乏彩色棉纤维色素物质化学结构的直接分析的证据，目前人们对天然彩色棉色素形成的生化和分子机制还不清楚，但是基于对彩色棉色素提取物的初步研究和对大多数植物色素都是类黄酮化合物的事实，且有研究表明彩色棉纤维中的色素物质可能为类黄酮物质，该物质是花、果实和种子等植物器官的主要显色物质。

类黄酮物质种类繁多，结构复杂多样。

在植物次生代谢中，黄酮类的生物合成是目前研究最为深入的次生代谢途径类（Grotewold,2006）。

儿茶素又称单宁，它是黄酮类化合物生物合成中的一个重要分支产物，最早它被认为是由无色花色素在无色花色素还原酶（LAR）的催化下合成的[8]。

本研究通过PCR从9DPA棕色棉纤维cDNA中扩增出GhLAR基因的ORF，利用Gateway技术构建了GhLAR基因的植物过表达载体，为研究该基因在彩色棉色素形成中的功能奠定基础。

上述研究虽证实彩色棉纤维细胞中存在类黄酮物质及代谢途径，但纤维色素是否就是类黄酮物质？

是否还存在其它色素物质？

如果是类黄酮，那么是类黄酮中的哪一种或哪几种？

目前还没有这方面的分子证据，需要进一步的实验研究。

三、课题提出的任务要求及实现预期目标的可行性分析

通过参加棉花育种课题组的实验以及认真学习《分子生物学》、《基因工程原理》和查阅大量文献资料后，已经具备完成本项实验的所有条件。

本研究以棉花LAR基因为目标基因，采用Gateway高效克隆技术，构建该基因RNA干扰载体和超表达载体，为进一步转化植物研究LAR基因功能奠定基础。

课题组成员具有丰富的分子生物学理论知识与实验操作技能，能够指导本实验顺利完成；绿洲生态实验室有先进仪器设备，完全能够满足实验需要。

四、本课题需要重点研究的、关键的问题及解决的思路

重点研究的、关键的问题：

1、运用Gateway技术构建LAR载体过程中的重组效率

解决的思路：

（1）BP反应过程应提高PCR产物和供试载体的纯度及浓度，加入的PCR产物的量应多于供试载体量；

（2）BP反应后可对入门载体进行线性化酶切，回收含有目的片段的条带后再进行LR反应；（3）LR反应时应降低卡那霉素的筛选浓度，25-30µgmL-1较为合适，浓度过高导致单克隆数目较少；（4）LR反应中加入的目标载体的量应多于入门载体量；（5）pGWB系列载体拷贝数较低，转化大肠杆菌后应将菌液全部涂板，以提高单克隆数目。

五、完成本课题所必须的工作条件

室内实验在绿洲生态实验室进行，实验室条件良好，基本具备完成实验的相关设备；本实验室具备分子实验所需要的实验指南、所需要的载体菌株以及做序列分析的相关软件。

六、完成本课题的工作方案及进度计划

研究工作阶段

主要研究内容

起止日期

调查研究

资料文献收集阅读

2011.4－2012.3

试验分析

开展试验，分析结果

2012.4－2012.12

论文撰写

撰写论文初稿

2013.1－2013.2

论文评阅

论文修改

2013.3－2013.5

论文答辩

答辩

2013.6

七、主要参考文献

[1]DuX-M（杜雄明）,ZhangT-Z（张天真）,YuanY-L（袁有禄）.Adancesandprospectofcoloredcotton.ChiAgriSci（中国农学通报）,1997;13（3）:

30-32（inChinesewithEnglishabstract）

[2]BushmanW,ThompsonJF,VargasL,etal.Controlofdirectionalityinlambdasitespecificrecombination[J].Science,1985,230（4278）:

906–911.

[3]HartleyL,TempleGF,MichaelA,etal.DNACloningUsingInVitroSite-SpecificRecombination[J].GenomeResearch,2000,10（11）:

1788–1795.

[4]LandyA.Dynamic,structural,andregulatoryaspectsoflambdasite-specificrecombination[J].AnnuRevBiochem,1989,58:

913–49.

[5]马建,厉志,刘艺苓,等.应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体[J].大豆科学,2008,27（4）:

565–568.

[6]李明,丁博,牛有雄,等.小麦TaWRKY46-1基因克隆及建立在Gateway技术上的可诱导表达载体的构建[J].华北农学报,2011,26

（2）:

17–22.

[7]高东尧,夏兰琴,马有志,等.小麦Vp-1基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化[J].植物遗传资源学报,2009,10

（1）:

9–15.

[8]DevicM,GuilleminotJ,DebeaujonI,etal.TheBANYULSgeneencodesaDFR-likeproteinandisamarkerofearlyseedcoatdevelopment[J].ThePlantJournal,1999,19（4）:

387-398.

[9]将建雄,张天真.利用CTAB-酸酚法提取棉花组织总RNA[J].棉花学报,2003,15（3）:

166-167.

[10]KarimiM,InzeDepickerA.GATEWAYTMvectorsforAgrobacteriummediatedplanttransformation[J].TrenesinPlantScience,2002,7（5）:

193-195.

说明：

一、学生撰写《开题报告》应包含的内容：

1、本课题来源及研究的目的和意义。

2、本课题所涉及的问题在国内（外）研究现状及分析。

3、对课题提出的任务要求及实现预期目标的可行性分析。

4、本课题需要重点研究的、关键的问题及解决的思路。

5、完成本课题所必须的工作条件（如工具书、实验设备或实验环境条件、某类市场调研、计算机辅助设计条件等等）及解决的办法。

6、完成本课题的工作方案及进度计划。

7、主要参考文献（不少于5篇）。

二、本报告必须由承担毕业论文（设计）课题任务的学生在接到“毕业论文（设计）任务书”、正式开始做毕业论文（设计）的第二周末之前独立撰写完成，并交指导教师审阅。

三、每个毕业论文（设计）课题撰写本报告一份，作为指导教师、评阅教师审查学生能否承担该毕业设计（论文）课题任务的依据，并接受学校的抽查。

指导教师审阅意见：

论文“棕色棉GhLAR基因过表达载体的构建”利用Gateway技术的同源重组原理，将GhLAR基因通过BP反应和LR反应重组至植物表达载体pGWB17中，为进一步转化棉花研究该基因的功能奠定了工作基础。

该项研究选题适当，目的明确，设计合理，具有一定的可行性，同意开题。

开题报告成绩：

指导教师（签字）2011年5月30日

备注：