赛润ELISAclassic风疹病毒IgGIgM.docx

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赛润ELISAclassic风疹病毒IgGIgM

赛润ELISAclassic风疹病毒IgGIgM

`赛润ELISAclassic风疹病毒IgG/IgM

1.用途

2.诊断意义

3.赛润ELISAclassic-检测原理

4.试剂盒组成

5.检测所需物质，试剂盒未提供

6.储存和稳定性

7.赛润ELISAclassic的检验步骤

7.1注意事项

7.2样品准备和储存

7.3试剂盒反应试剂的准备工作

7.4检测程序概要

7.5检测过程

8.检测结果评估

8.14PL单点定量法

8.2检验有效性标准

8.3计算赛润ELISAclassic风疹病毒IgG/IgM（定量）

8.4检测结果分析

9.性能特性

9.1重复性

9.2敏感性和特异性

10.风疹病毒IgG抗体的亲和力评估

11.警告

11.1警告和安全措施

11.2废料处理

12.参考文献

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　V9.03/07-1

赛润ELISAclassic风疹病毒IgG/IgM

酶联免疫测定法体外诊断人体抗体（IgG/IgM）

-只限用于体外诊断-

IgG试剂盒（定量）编号ESR129G

IgM试剂盒（定量）编号ESR129M

检测评估标准:

DadeBehringBEP®III/BEP®2000,DSX,手动操作

1.用途

赛润ELISAclassic风疹病毒IgG/IgM用于定性和/或定量检测人体内血清、脑脊液或血浆中抗风疹病毒的抗体。

检测抗风疹病毒IgG和IgM对于风疹病毒的血清学研究具有特殊的价值，如判断机体免疫状态及初次感染。

2.诊断依据

风疹病毒是一种人类病原体，属于RNA病毒的披膜病毒科，可通过飞沫和直接接触等方式传播，潜伏期一般为10-21天。

大约50%的感染病例初期伴有弥散性斑疹，随后这些微小的斑疹可能融合。

出生后感染通常并无大碍，有25-30%的患者尽管出现心肌炎，神经炎，耳炎，支气管炎，脑炎等并发症，也属于亚临床感染。

风疹病毒感染的临床诊断都应有血清学证据的支持，因为皮疹和关节炎这些临床症状也可以由其它病毒引起。

（见1.，2.）

妊娠期风疹感染可能导致胎儿受到严重损伤及多系统疾病。

因此，妊娠期风疹的诊断就尤显重要。

当其他的检验系统（如血细胞凝集抑制实验）的结果为弱阳性或可疑，不能由此判断免疫状态的时候，免疫球蛋白G-酶联免疫吸附试验（IgG-Elisa）在确认检验结果和判断免疫状态方面就非常重要了。

通常来讲，IgM-Elisa（免疫球蛋白M-酶联免疫吸附试验）的阳性结果是初次感染的指标。

患者感染后，抗风疹病毒的IgM抗体通常存在1-2个月，但也可能在可检测水平上维持一年。

由于风疹再次感染也可能产生IgM（免疫球蛋白M）抗体，在这种情况下，对所有IgM检测结果阳性的患者取双份血进行检测是至关重要的，而且我们也应清醒的认识到，没有任何一个血清检测的特异性和敏感性是100%（见2.,3.）。

鉴于风疹感染对胎儿带来的严重后果，抗风疹IgM检测为阳性的怀孕患者，应该用另一种反应原理的酶联免疫吸附试验对IgM再次进行检测。

此外，也应进行其他的确认检测，如IgA（免疫球蛋白A）抗体试验，免疫印迹或亲和力试验。

（见2.）。

多数情况下，妊娠期的初次感染不会导致胎儿子宫内感染。

因此，为评价可能引起胎儿损伤的风险（5.），应该进行产前诊断（4.）。

3.赛润ELISAclassic-检验原理

用抗原包被微量板孔，制成固相载体。

加患者血清到板孔中，其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。

除去多余物质后，加入碱性磷酸酶标记的IgG、IgA和IgM抗体，使之与上述免疫复合物反应。

洗板，除去多余的结合物，加入底物（对硝基苯磷酸盐）。

其与酶结合的免疫复合物反应，产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。

4.试剂盒的组成

试验成分

IgG试剂盒IgM试剂盒

数量/剂量

微孔条（此微孔条可拆下单独使用，每条有8孔，共96孔，已经包被了抗原）

1个微孔条框架

包被的抗原为灭活抗原

1212

标准血清（立即可用）

人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液；抗HIV抗体、抗乙肝病毒（HBV）表面抗原和抗丙肝病毒（HCV）抗体均为阴性；

防腐剂：

<0.1%叠氮化钠

染色剂：

紫红色O

2×2毫升2×2毫升

阴性质控血清（立即可用）

人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液；抗HIV抗体、抗乙肝病毒（HBV）表面抗原和抗丙肝病毒（HCV）抗体均为阴性；

防腐剂：

<0.1%叠氮化钠

染色剂：

里沙明绿V

1×2毫升1×2毫升

酶标记的抗人IgG,IgA,IgM（立即可用）

羊抗人IgG,IgA,IgM（多克隆），标记碱性磷酸酶后在蛋白稳定剂中储存。

防腐剂：

0.01%甲基异噻唑啉酮

0.01%溴化硝基二垩烷

13毫升13毫升

浓缩洗液（可稀释至1000毫升）

氯化钠溶液，含吐温20和30mMTris

防腐剂：

<0.1%叠氮化钠

1×33.3毫升1×33.3毫升

稀释缓冲液

磷酸盐缓冲液，内含蛋白和吐温20

防腐剂：

<0.1%叠氮化钠

0.01克/升的溴酚蓝钠盐

2×50毫升2×50毫升

终止液

1.2N氢氧化钠

15毫升15毫升

底物（立即可用）

对硝基苯磷酸盐，不含其它溶剂的缓冲液

防腐剂：

<0.1%的叠氮化钠

（未开封瓶子中的底物可能会轻微变黄，但不会影响其质量）

13毫升13毫升

带有标准曲线和评估表的质量控制文件

（抗体以IU/毫升或U/毫升计量）

11

5.检测所需物质，试剂盒未提供

-普通实验室所配的仪器装置

-IgM检测：

另需赛润含对照抗原的类风湿因子Rf—吸附剂（Rf－吸附剂/对照抗原（产品编号T200/20ml））

-分光光度计，波长405纳米，建议参考波长范围620纳米-690纳米（例如650纳米）

-37℃温箱

-湿盒

-蒸馏水。

6.储存及稳定性

试剂

储存

稳定性

微孔条

（包被抗原）

开封后放在2-8℃装有干燥剂的密封铝箔袋中。

4星期

质控血清/标准血清

开封后保存于2-8℃。

有效期内；

24个月

酶标记抗体

立即可用的溶液于2-8℃储存。

避免污染（使用无菌枪尖）。

有效期内；

24个月

稀释缓冲液

开启后于2-8℃储存。

有絮状沉淀时丢掉

未开封

18个月

有效期内；

36个月

洗涤液

浓缩液开封后保存于2-8℃。

工作液在2-8℃。

工作液在室温下。

盛过工作液的瓶子应按常规方法清洗，并丢弃混浊溶液。

有效期内

2星期

1星期

底物

2-8℃储存，避光。

避免污染（使用无菌枪尖）。

当溶液变为黄色时应予以丢弃（水作空白，吸光度大于0.25时）。

有效期内

24个月

终止液

开封后保存于室温。

有效期内

7.赛润ELISAclassic的检验步骤

7.1注意事项

只有全部使用赛润ELISAclassic试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产品。

尤其是标准血清，对照血清以及酶标记物，必须使用试剂盒配备的，不要使用其它批号产品。

稀释缓冲液，洗液，终止液和底物溶液可用于所有赛润ELISAclassic试剂盒。

ELISAclassic试剂盒内所有试剂均必须正确地存放。

应在未开封的情况下，保存于2-8℃，并在有效期（见标签说明）内使用。

详细的稳定性和储存资料在“6.储存及稳定性”内将加以详述。

每一种试剂都是经过校准以保证最佳的检测结果。

这些试剂如果未经规定被稀释或改动都会导致检测的敏感性的降低。

在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。

所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，避免试剂受到微生物污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

请从标记处剪开密封袋。

如果铝袋破损或者已开启装有干燥剂的铝袋而未以夹子封紧的，则不要继续使用微孔条。

开始试验前，将所有试剂置于室温。

从试剂管中吸取试剂的时候，应注意使用无菌技术以防污染。

为避免假阳性结果，吸加酶结合物时，吸嘴应确保不接触或喷洒于小孔的顶避，注意不要盖错瓶盖或管盖。

试验结果的可重复性依赖于充分混匀试剂。

使用前振荡装有对照血清的小管和所有稀释过的溶液（例如使用混合器）。

小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。

请注意在吸取标本/对照血清，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果长，将会导致不同的“预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。

只有严格遵守赛润ELISAclassic试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。

如果实验中未严格遵守质量控制认证文件上的有效性特异准则，则试验结果无效。

洗涤不充分将影响试验结果：

应该小心进行洗涤。

洗涤步骤应遵守相关洗涤器（平底孔，孔直径7毫米，深10.9毫米）指导手册进行，所有的孔内均应加入相同体积的洗涤缓冲液。

洗涤结束时，应将微孔板倒扣于纸巾上并轻轻敲打，以确保所有孔内均无洗涤缓冲液。

避免产生泡沫！

如果使用自动洗板机，注意正确操作。

7.2检验前的准备工作和储存

避免使用高血脂、溶血或黄疸的标本，尽管在我们的检测中没有发现有副影响。

明显被污染的标本（血清或血浆）不能用于检测。

样品不应加热灭活。

7.2.1样品准备

赛润ELISAclassic风疹病毒IgG

开始试验前，患者的待测样品必须以稀释缓冲液稀释如下（V1+V2）：

V1+V2=1+100加10微升患者待测样品

于1000微升稀释缓冲液

稀释后及加入微孔板前，样品必须充分混匀。

赛润ELISAclassic风疹病毒IgM

类风湿因子抗体是自身IgM型的抗体，可与IgG免疫复合物结合。

非特异性风湿因子抗体的存在将导致IgM检测的假阳性结果。

另外，也存在弱结合的病原体特异性IgM抗体被强结合的IgG抗体取代的可能性。

在这种情况下，IgM的检测将得到假阴性的结果。

因此，在进行IgM检测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预处理。

特别类风湿因子Rf—吸附剂（产品编号T200,20ml）不仅包含抗人IgG抗体，还含有一定量的对照抗原，对照抗原同时能与类风湿因子及可识别宿主细胞膜成份的抗体结合。

因此，无须再进行微量孔包被对照抗原的平行试验。

在进行以下SERIONELISAclassicIgM检测时，此类RF—吸附剂需作为附加试剂另行购买:

巨细胞，单纯疱疹病毒，麻疹，腮腺炎，风疹病毒，刚地弓形虫，带状疱疹病毒

首先应该使用稀释缓冲液（V2）对类风湿因子吸附剂（Rf-吸附剂/对照抗原）（V1）进行如下稀释：

V1+V2=1+4加200微升Rf-吸附剂/对照抗原　

于800微升稀释缓冲液中

然后将患者的待测样品（V1）在此Rf-稀释缓冲液（V3）中进行稀释：

V1+V3=1+100加10微升患者待测样品

于1000微升Rf-稀释缓冲液中

7.2.2样品储存

密封的患者样品可在冰箱中2-8℃保存7天。

≤-20℃可保存更久。

避免样品反复冻融。

已稀释的样品可在2-8℃保存一星期。

7.3试剂和反应试剂的准备工作

7.3.1微孔条

微孔条置于一框架内，并与干燥剂一同封于铝袋之中。

应将不需要的微孔条取下并重新放入铝袋。

将袋口折叠2-3次，并以夹子夹紧，确保铝袋的密封性。

7.3.2对照血清/标准血清

对照和标准血清立即可用，不必进一步稀释。

试验时，可直接使用。

对于每次试验和每批检测体系，无论使用的微量板数目的多少，均应包括阴性阳性对照孔。

临界值血清应作双份测定。

如果是定量试验，标准血清也应作双份。

不要用RF吸附剂处理对照血清！

7.3.3抗人IgG,IgA或IgM抗体稀释液，用AP标记（即用）

禁止将不同试剂盒的酶标抗体混合。

同一试剂盒才能具最佳检测效果。

7.3.4洗液

以1：

30稀释浓缩洗涤缓冲液（V1）至终体积V2。

例如：

浓缩缓冲（V1）

终体积（V2）

33.3毫升

1000毫升

1.0毫升

30毫升

7.3.5样品的稀释缓冲液（即用）

7.3.6底物（即用）

试验时戴手套以避免污染。

必须以无菌枪尖吸取底物溶液。

7.3.7终止液（即用）

7.4检测程序概要

　定量的风疹病毒IgG/IgM

进行IgM检测时先用类风湿因子吸附剂预处理血清，

请参见7.2.1；

　　室温孵育15分钟或4℃过夜

　样品稀释液（病人血清）

1+100

↓

将稀释的样本，和立即可用的对照血清/标准血清，加到微量孔内（100微升）

↓

孵育60分钟/37℃

湿盒中

↓

洗涤

↓

加入立即可用的酶标记抗体溶液（100微升）

↓

再孵育30分钟/37℃

湿盒中

↓

洗涤

↓

加入底物溶液（100微升）

↓

再孵育30分钟/37℃

湿盒中

↓

加入终止液（100微升）

↓

在405纳米处读数

7.5检测过程

7.5.1将检测所需数目的微孔条放到微孔板框上并准备好一张草签。

7.5.2在微量孔内分别加入100微升的已稀释样本或立即可用的对照血清。

留一个孔为底物空白使用，例如：

定量的IgG/IgM

微量孔

孔A1

孔B1

孔C1

孔D1

孔E1

底物空白

阴性对照

标准血清

标准血清

标本1……

7.5.3将样品于湿盒内37℃（±-1℃）孵育60分钟（±5分钟）。

7.5.4孵育后以洗液缓冲液洗涤板孔（使用自动洗板机或手工洗板）：

-吸去或甩去洗液

-每孔内加入300微升洗液

-吸去或甩去洗液

-重复洗涤过程3次（共4次！

）

-将微孔板翻转过来在纸巾上拍打，使微孔中不再含有液体

7.5.5加入酶标记抗体。

于适当孔内（底物空白除外）加入100微升IgG/IgM/IgA酶标记抗体

7.5.6湿盒内37℃（±1℃）孵育30分钟（±1分钟）*。

7.5.7孵育后，以洗液清洗板孔（洗涤见上）

7.5.8加入底物

于每孔内加入100微升底物溶液（包括底物空白孔）

7.5.9湿盒内37℃（±1℃）孵育30分钟（±1分钟）*。

7.5.10终止反应

每孔内加入100微升终止液，轻微振荡微孔板以混合溶液。

7.5.11读取消光度

以底物空白为空白对照液，60分钟内读取405纳米的OD值，建议参考波长范围为620纳米-690纳米（例如650纳米）。

8.检测结果评估

赛润ELISAclassic风疹病毒IgG/IgM（定量）

8.14PL单点定量法

通过利用非线性方程，可以保证根据消光信号的定量数值精确计算出抗体活性，该方程可在不对OD值作任何改动的情况下调整S型曲线。

赛润ELISAclassic抗体浓度的确定是通过逻辑对数模型（4PL,4参数）计算得出的，此模型可精确适用于相关曲线。

它是基于以下公式：

参数A,B,C,D分别代表曲线的准确形状：

1.下端渐近线→参数A

2.曲线斜率→参数B

3.转折点→参数C

4.上端渐近线→参数D

标准曲线是由德国维润赛润研发有限公司（维尔茨堡市）在严格条件下经过多次试验制定的。

使用者无需花费大量的时间和使用昂贵的仪器来制作标准曲线。

每一个试剂盒内均附有专用的标准曲线和评估表用来计算抗体浓度。

如有需要也可取得相关的评估软件。

为了校正正常试验偏差和建立试验对照，每轮试验均需使用标准血清作为对照。

该对照血清的有效范围参考值是由厂商的质量控制部门确定的，在此范围内可保证抗体浓度测定的正确性。

标准血清不一定是阳性对照，且在某些ELISA试验中标准血清数值可能是临界值或阴性结果。

8.2有效性标准

-底物空白的OD值必须<0.25

-阴性对照值必须为阴性（请参见试剂盒内所附定量表）

-赛润ELISAclassic试验：

标准血清的平均OD值必须在有效范围内，此范围在试剂盒的特异性质量控制认证书上给定（减去底物空白之后！

）

-赛润ELISAclassic试验：

阳性对照的平均OD值必须在有效范围内，此范围在试剂盒的特异性质量控制认证书上给定（减去底物空白之后！

）

如果未达到以上标准，试验无效且必须重做。

8.3赛润ELISAclassic风疹病毒IgG/IgM的定量计算

IgG抗体活性以IU/ml计算，以世界卫生组织风疹病毒参考血清为标准。

该血清浓度为1000IU/ml。

IgM抗体活性以U/ml计算，以风疹病毒IgM参考血清（莱比锡,德国）为标准。

该血清浓度为30U/ml。

8.3.1非自动评估

每个试剂盒内均备有一个标准曲线和一个评估表，因而每一个OD值就可得到一个抗体活性值。

标准血清的参考值和有效范围会在求值表格（质量控制认证）中给定。

所有的OD值在评估前必须先减去空白A1。

方法1：

定性评估

为确定临界值范围，请将已测得标准血清的OD平均值与质量控制证书上给出的数据相乘（见专用公式），例如：

OD=0.502×MW（STD）临界值上限

OD=0.352×MW（STD）临界值下限

如果得到的标准血清的平均消光度值是0.64,那么临界值的范围即为0.225-

0.321。

方法2：

用评估表格来确定抗体活性。

1.计算标准血清两个OD值的平均值，并检查其是否在给定的有效范围内。

2.然后，将所得结果转入“标准血清OD范围”栏，在此进行求值。

3.已测得的患者样品值通过读取“IU/ml或U/ml”来求得相应的抗体活性。

例如：

标准血清OD范围

0.57-0.61

0.62-0.65

IU/ml或U/ml

其它

<0.06

<0.07

0.07-0.12

0.13-0.22

<5

5-10

11-19

0.23-0.32

20-30

0.33-0.40

31-40

例如：

测得的标准血清平均消光度值为0.64。

对其而言，结果的确定与OD值范围0.62-0.65一栏相关。

由患者的OD值0.23可得出其单位范围为20-30。

方法3：

利用标准曲线进行抗体活性的连续求值。

通过将当前患者样品测量结果乘以校正系数F，可纠正所谓的“测定间差异“（不同测量时间及不同试验室引起的差异）。

此系数的计算如下所示：

此步骤对于校正当前检测与批次标准曲线之间的偏差是非常必要的。

首先，日间测定差异可通过计算（校正系数F）得以纠正：

1.计算标准血清两个OD值的平均数，检查此平均数是否在给定的有效范围之内。

2.计算校正因子F：

给定的参考数值除以标准血清消光度值平均数。

F=标准血清参考消光度值/标准血清消光度值平均数。

3.将患者样品所有测得值均乘以校正因子“F”。

4.此时便可通过修正后的数值以标准曲线求得抗体活性U/ml或IU/ml。

赛润ELISAclassic风疹病毒IgG：

阳性结果：

>20IU/ml

临界值结果：

10-20IU/ml

阴性结果：

<10IU/ml

赛润ELISAclassic风疹病毒IgM：

阳性结果：

>3.5U/ml

临界值结果：

2.5-3.5U/ml

阴性结果：

<2.5U/ml

针对临界值结果的样品，应在1-2周后对相应的病人再取样，重新检测。

8.3.2通过SERIONeasybase4PL软件/SERION自动评估软件进行自动评估。

输入四个参数和标准血清参考值之后，联机软件就会计算出抗体活性。

如果标准血清的消光值超出有效范围，SERIONeasybase4PL软件就会显示如下信息：

“标准已超出允许范围”和/或“标准差异大于20%”。

SERION评估软件只用英语显示：

„Standardvaluesoutofrangesinfollowinggroups:

Group1-24.Standardvaluediffermorethan20%infollowinggroups:

Group1-24.”（“以下组样品标准值超出范围：

组1-24。

以下组样品标准值差异大于20%：

组1-24。

”）

在这种情况下，此轮试验无效，需重做。

只有更换批号时，参数和参数值才需要改变（评估表中标有参数与参考值）。

组别特异性数据的正确输入与否可以以标准血清的IU/ml或U/ml值为基础进行检验。

计算出的平均单位值需与组别特异性认证书所示的单位值相对应。

可自动校正测定值。

使用标准版本打印机会显示如下内容：

样本编号

OD值

IU/ml或U/ml

结果解释

8.4检测结果分析

我们采用血清学研究方法来判断风疹免疫情况及诊断风疹病毒及相关病毒的感染。

风疹病毒IgG抗体出现于初次感染后，并于1-2个月后消失。

鉴于所采用试验的敏感性，某些情况下IgM抗体在感染一年后仍可能检测到。

由于再次感染后IgM的出现，使得对于阳性结果的进一步研究成为必须。

而且，患者血清的配对试验也是非常重要的。

感染后，IgG抗体的产生晚于IgM。

抗体水平会达到一个最大值，然后再次跌落，保持在可检测的水平。

血清检测的结果分析只能与完整的临床诊断图谱共同使用。

当检测结果可疑时，应采用进一步的诊断手段。

感染有EB病毒或细小病毒B19将引起多克隆免疫应答，从而导致风疹病毒IgM试验的假阳性。

当可能感染这两种病毒时，有必要对患者2-3周后再次采血进行进一步的检测。

9.性能特征：

9.1重复性

测定内重复性通过在同一轮试验中检测20次不同反应的血清来判断。

测定间重复性通过分别在5天进行10次独立的血清检测分析来判断。

赛润ELISAclassic风疹病毒IgG：

平均消光值（OD）

检测内分析（CV%）

平均消光值（OD）

检测间分析（CV%）

样品

弱阳性

阳性

强阳性

0.704

1.352

1.853

8.3

6.6

3.5

0.607

1.291

1.688

11.6

10.4

8.9

赛润ELISAclassic风疹病毒IgM：

平均消光值（OD）

检测内分析（CV%）

平均消光值（OD）

检测间分析（CV%）

样品

弱阳性

阳性

强阳性

0.987

1.456

1.749

5.4

5.3

6.7

0.282

1.106

2.622

6.8

6.4

8.0

9.2敏感性和特异性

赛润ELISAclassic风疹病毒IgG：

在外部操作评估研究中（6.），我们检测了427名患者的血清（免疫，加疫苗，非免疫，风疹感染及潜在交叉反应血清），并对不同价位的风疹IgGELISA产品相比较。

结果表明，赛润ELISAclassic风疹病毒IgG的敏感性及特异性分别为99.11%和98.92%。

赛润ELISAclassic风疹病毒IgM：

在外部（7.）