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分子生物学实验技术讲义
分子生物学实验技术
基因是什么？
这是一个颇让人为难的问题。
尽管近半个世纪以来人们采用分子生物学技术、基因工程技术在认识基因和人为改造基因方面都做得非常出色，可是科学家们仍然不能对基因给出一个圆满的定义。
我国著名遗传学家谈家桢先生曾撰一文《基因概念的发展》详尽说明基因概念是随着日益增多的科学事件的发展而发展的这一事实，也提示人类对基因本质的认识还有很长的路要走。
基因一词是英语“gene”的音译，是“开始”、“生育”的意思。
它源于印欧语系，后变为拉丁语的“gens”（氏族）以及现代英语中genus（种属）、genius（天才）、genital（生殖）等诸多词汇。
1909年，丹麦学者约翰逊提出基因这一名称，用它来指一种生物中控制任何遗传性状而其遗传规律又符合孟德尔定律的遗传因子。
在孟德尔定律之前，人们对生物遗传曾经提出了诸多的说法。
如普遍流行的融合遗传论就是认为双亲的遗传物质在子代中像血液一样混合，被稀释且不能分开，但孟德尔的实验结果则相反，现代隐性基因并不在杂交子一代中消失，它所决定的性状还能在子二代中出现。
据此孟德尔提出了“遗传颗粒”学说。
20世纪初孟德尔理论在许多动植物中得到了进一步的验证。
最有代表性的是1910年美国科学家摩尔根发现果蝇的白眼性状的伴性遗传现象，即白眼性状始终在雄果蝇中出现，第一次把一个特定的基因定位于一条的染色体（决定性别的性染色体）上使遗传学和细胞学终于殊途同归。
有人曾对此作了一个形象的比喻：
若将孟德尔学说比作是从生物雄壮的交响乐中分解出七个音符，那么孟德尔的染色体遗传理论则不仅证实了六弦琴上六根琴弦的存在，而且证明了这七个音符就是从这只六弦琴上发出来的。
孟德尔学说和摩尔根的基因论都把基因看作是一个界线分明的独立遗传单位，甚至到本世纪50年代初人们在对基因的化学本质（核酸）及DNA双螺旋结构有了明确认识后，仍然认为基因是不可分的基本遗传单位，如同当初人们分子是物质的基本粒子一样。
这种观念直到1957年得到纠正。
著名遗传学家本泽尔在经过10年艰苦工作，取得了三大发现后提出了全新的基因概念，于是彻底冲破了经典基因不可分的概念。
他认为：
（1）作为基因的单位，可以精确到单核苷酸或碱基水平，称为突变子。
（2）作为交换单位，同突变单位一样，仍以单核苷酸为基本单位，称为互换子。
（3）作为功能单位，基因也是可分的。
本泽尔的功劳不仅在于提出了全新的基因概念，而且把“基因”作为一种概念引入到遗传学实验中来了。
本泽尔把突变子或互换子像绘制染色体图一样排列在基因图谱上，这是遗传学上一次从宏观到微观的飞跃。
1969年，夏皮罗等人从大肠杆菌中分离开分离到乳糖操纵子并使它在离体条件下转录，证实了一个基因可离开染色体而独立发挥作用。
1970年，梯明发现了仅以RNA作为遗传物质的逆转录病毒，提示遗传物质不仅仅是DNA，也可以是RNA，从而使中心法则内容得到扩展。
时隔20年后的1977年，人们又在猿猴病毒（SV40）和腺病毒（AdV）中发现某些基因中存在内部间隔区，间隔区的顺序与基因所决定的蛋白质序列没有任何关系——这使科学家们大吃一惊。
随后，基因的这种可分割、不连续的现象在酵母tRNA基因、国蝇的rRNA基因、人的胶原蛋白基因中也得到了证明。
这样基因的概念中又多了一项新内容：
基因结构具有不连续性。
因为这是生物界尤其是真核生物中普遍存在的现象，为了便于称呼，人们把这种分裂基因中能实现遗传信息表达的部分称作外显子，而不表达部分称作内含子。
1980年法国科学家斯洛宁姆斯基在酵母线粒体DNA的研究中证实，一个基因的内含子可能是另一个基因的外显子，也就是说，内含子也可能是具有功能的，剪接酶并没有把它们带到死亡中去，生物界中DNA的所有成员可能没有废料。
与基因分裂或不连续性的概念相反的是基因的重叠性。
1977年桑格等在噬菌体X174DNA
中和1978年菲尔斯等在SV40DNA中均发现了几个基因共用同一段DNA序列的情况。
虽然这种现象在自然界并不普遍，但是至少生命基因确实存在着阅读框架的重叠现象，这体现了生物的“节约”原则。
对经典的、近代的以至现代的基因概念的挑战还不止这些。
比如，一个基因一个多肽假说，在相当长的时间被证明是正确的，可是近年来发现一些基因绝不产生任何蛋白质或者多肽，而仅产生RNA，各种tRNA、rRNA基因就是这样。
因此人们只有加以补充：
基因的功能在于决定蛋白质或核酸。
但是这仍不能解释一些事实：
DNA中确实存在一些片段，它根本不产生任何物质而仅以文字或结构起作用。
例如，操纵区和启动区，它仅起识别蛋白质（酶）的作用，由此来开放或关闭它“下属”的活动。
而另一些基因，如假基因，眼下甚至还看不出有什么作用。
这样就很难从产物上给基因下一个统一的定义。
本世纪70年代末，大肠杆菌中发现了一种奇特的现象，基因可以在染色体及染色体外的DNA之间往返“飞行”。
其实这种基因的跳跃现象在50年代初就被一位女科学家麦克琳托克在研究玉米组织分化现象时发现，只不过她的发现当时并未引起人们的普遍关注而已。
随后不久基因跳跃现象又在人的免疫球蛋白基因得到了证实，这样人们才充分意识到基因的稳定性是相对的。
医学家们还进一步设想或许基因的这种不稳定性可能与癌症和传染性疾病也可能有很大关系。
麦克琳托克作为首次发现基因不稳定性的人，于1983年获得了诺贝尔生理学及医学奖。
由于基因在高等生物中相当庞大，人类基因组中究竟含有多少基因，基因的表达又是如何调控等都是目前悬而未决的问题。
现在国际上提出的“人类基因组计划”和“人类基因组后计划” 的国际合作研究，目的就在于回答这些问题。
基因究竟是什么？
我们从以上的下上叙述中可粗略地知道基因是含特定遗传信息的核苷酸序列（DNA或RNA），是遗传物质的最小功能单位。
但是目前为止还没有人能给它下个完整的定义。
基因的概念将随着科学事实的不断发展而发展。
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）
1：
核酸抽提原理
简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。
裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。
经典的裂解液几乎都含有去污剂 （如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等） 和盐 （如 Tris、EDTA、NaCl 等）。
盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 （如 Tris），还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 （如 EDTA）、维持核酸结构的稳定 （如 NaCl） 等。
去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。
裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。
也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 （如 GIT、GuHCl 等） 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。
最常用的纯化方法，一是 PC 抽提 + 醇沉淀，二是介质纯化。
第一种方法是利用 PC 对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。
第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。
高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC 操作的麻烦。
当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。
其它杂质 – 如多糖、多酚等 - 的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。
2：
裂解方法的评价
含蛋白酶的裂解方法，仍然可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。
裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。
蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组 DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA “缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。
另外一个思路是，如果基因组 DNA 与蛋白质 “缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：
如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA 的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致 DNA 的损失。
另外，象有些样品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。
高浓度蛋白质变性剂 （如 GIT、GuHCl 等） 的裂解方法，是抽提 RNA 的首选。
总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质 “缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。
高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，并且能迅速抑制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA 的完整性。
除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。
不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。
控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。
该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。
SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。
控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。
该方法不一定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。
PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。
该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。
也正因为不纯化，所以，假阴性 （即没有扩增出来的阳性） 比例也比较高。
该方法最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部分消除样品内抑制 PCR 反应杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰胺等。
再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。
操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。
该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是否是阳性还是阴性。
降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。
含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。
该方法成功与否与两个因素有关：
一是 CTAB 的质量，二是洗涤的彻底程度。
CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB，批号不同，效果就可以差别很大。
洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时， CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。
3：
纯化方法评价
PC 抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法。
稳定、可靠、经济、方便。
PC 抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 （杂质为蛋白质），该方法完全可以获得高质量的核酸。
虽然每次 PC 抽提都会损失一部分核酸 （因为不可能将水相全部移取），以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。
该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。
高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。
与 PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。
更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度 （蛋白质残留） 不够稳定。
介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。
其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高 （虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高）。
其致命弱点是样品过量。
介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状 （如Glassmilk、磁性小珠等）。
颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。
柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力 （不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留）。
不过，介质纯化方法的成本是最高的。
4：
醇的沉淀
醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质 – 主要是盐 – 的分离。
实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。
醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。
就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。
实际操作中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用醇也可以使核酸沉淀下来；或者含有盐，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来 （当然，得率可能会降低）。
知道这一点的意义在于：
不要迷信标准方法的唯一性；相反，当使用标准方法碰到问题 – 主要是纯度问题 – 时，完全可以通过调整沉淀条件来改善。
最有参考价值的是 TRIzol 提供的一个沉淀方案：
一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。
另外一个问题就是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯度。
如果核酸抽提的起始样品是比较“脏”的，原则上不要使用低温沉淀。
低温沉淀能提高沉淀效率：
当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。
醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我没有发现这二者对质量有大的影响，虽然许多人“发现”乙醇沉淀的核酸纯度更高。
异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较白。
这是现象，提示结论：
异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。
结合丢失和洗涤两个方面综合考虑，则建议：
少量核酸用异丙醇沉淀 （量少，洗涤不是问题，不丢失为先），大量核酸用乙醇沉淀 （量大，丢失不是问题，洗涤方便为先）。
至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法，我没有碰到过 （我几乎不使用低温沉淀，难道低温沉淀比较容易出现盐沉淀？
）；我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。
当然，也不要忘记异丙醇沉淀的最大优点是体积小，可以使绝大部分的小量抽提操作在 1.5ml 离心管内完成。
但由于其沉淀物很紧凑，洗涤时其中心部分不容易被洗涤到，所以，洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是：
一定要使沉淀悬浮起来，一定要放置一段时间使沉淀最终变成蓬松的白色。
如果再洗涤一次，质量决不会有问题的。
PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。
虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点。
LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。
5：
洗涤
洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时 （使核酸沉淀最终蓬松）；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。
教科书中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻”，这一描述本身没有问题，且十分方便，但因为他来自国外，自然就有了“水土不服”的问题。
如果离心管是经过硅化的，因为液体几乎不挂壁，所以上清可以去除得非常彻底；好的管子，即使没有经过硅化，残留量也非常少，也没有什么问题；差的管子，液体的挂壁非常可观，其残留量多到会影响后续的实验。
唯一不受管子质量影响的操作，就是倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。
一定要牢记的是，残液中都含有上一步操作中的杂质，其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。
挥发时去掉的是乙醇，杂质是不会被挥发去除的。
另外，核酸沉淀的大小也决定了洗涤的强度。
沉淀越大，放置时间相对要长一点，洗涤次数也要考虑增加。
6：
核酸质量的检测问题
将抽提好的核酸直接用于后续的实验，是唯一可靠的检测方法；除此之外的检测方法，都是相对的，而且并不十分可信。
目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光广度仪。
电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 （超出电泳分离范围），该方法还是非常可信的；另外，电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。
紫外分光广度仪检测的是纯度和核酸含量，然而，由于紫外分光广度仪不能确保非常准确，而该仪器的灵敏度又非常高，所以，提供的结果并不十分可信。
一般讲，同时进行紫外和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更准确的判断。
但由于这两个方法都有缺陷，所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用大惊小怪。
7：
PC 抽提
PC 抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。
苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。
PC 抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。
彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。
许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。
剧烈的混匀操作，是会对部分打断大分子的基因组 DNA，但该破坏作用不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。
手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对 PCR 和酶切，都是完全适用的。
如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀 – 此时的关键是：
裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。
用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。
超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。
另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组 DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。
8：
样品与裂解液的比例
起始样品用多大，并没有具体的说法。
如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。
不要因为 1ml 裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg 样品。
裂解液的用量，表面上与抽提的结果 （纯度及得率） 没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。
裂解液的用量原则是：
确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。
浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。
另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。
9：
蛋白质是如何残留的
PC 纯化：
a-取上清时取到中间层及下层；b- PC 用量不足；c-混匀不彻底；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白质。
高盐沉淀：
a-取上清时取到了蛋白沉淀；b-裂解不彻底；c-裂解液用量不足，使裂解体系太粘稠；d-溶解度问题 （可以使用低温沉淀加以改善）。
介质：
a-裂解不彻底；b-裂解体系太粘稠。
10：
小分子物质 （苯酚、盐） 是如何残留的
醇沉淀：
洗涤不彻底。
其原因与管子、操作手法等有关。
介质：
颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。
柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致，极少数由操作者未严格按要求操作所致。
11：
标准化的概念
所谓的标准化，指的是一套程序，确保不同的人能获得质量接近的产物的程序。
标准化并不是以获得最高质量为目标，而是以稳定为目标。
标准化的核心是质控。
事实上，核酸抽提的每一步操作，都有一个核心；重要的是找到可观察的指标或者现象作为参考，从而确保实验的成功。
如悬浮的核心是没有块状物的存在，彻底消化的核心是没有块状物的存在，PC 抽提的核心是混匀-两相成为乳状，取上清的核心是用小一点的移液器移取液体，吸取时 Tip 的尖头尽可能接近液面，吸取速度要慢，并且要留下 1mm 以上的液体不要再吸。
去上清的核心是先倒空，再短暂离心将残留液体离到管低，用移液器彻底移出。
洗涤的核心是彻底悬浮沉淀，并且要放置一段时间 （时间长短与沉淀大小有关） 使沉淀内部也能被洗涤到。
按这样的方法抽提的核酸，其质量是非常稳定的。
柱离心式实际上就是非常标准化的核酸沉淀与洗涤的操作。
一般而言，柱式操作出问题，系统性的与试剂盒有关，偶然性的与操作有关。
这一点，应该是可以理解的。
一个方法，其标准化程度越高，其稳定性就越好。
步骤越少，标准化就越容易。
产品的开发也要以高标准化程度为目标。
12：
QC 的概念
QC 概念远没有 QT 概念深入人心。
最高境界的产品追求的是免检，或者是 Trouble-free。
另外，现在的许多产品也是不允许 QT 的 （因为是一次性的），因此就只能靠 QC 来保证质量了。
QC 是将精力集中在过程中：
原料、操作等。
只要严格按照标准去做，最终的结果就有保证。
事实上，很多实验人员是不做检测而直接将抽提好的核酸用于后续实验的；他们之所以可以这么做，是因为他们有意无意之中非常的注意 QC。
也有不少人，尤其是新手，Pay no attention to QC，只知道最后的 QT。
一旦发现问题，就去逆推原因；但因为过程中所出现的现象根本就没有注意，几乎不可能准确找出真正的原因的。
如果 QC 做得好，最后的 QT 是否全部做/部分做/完全不做，取决于时间、经验、后续实验的成本等因素。
13：
EP 管的问题
几乎没有人会认为 EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关，与某些现象 （如核酸在 -20C 保存一天后发生了降解） 有关系，但事实是，EP 管的质量的确与核酸抽提的质量以及核酸保存时的稳定性有关。
硅化可以提供最高质量的 EP 管，使某些奇怪的现象消失或者大大减轻。
最糟糕的 EP 管对液体有较强的吸附力，在倾倒液体时残留多，核酸在管中保存的过程中会发生变性。
这样的管子是很有市场的，因为便宜；而正因为便宜，其材料总是不令人放心的。
我个人认为，只有硅化过的 EP 管，才可能按照标准操作获得满意的结果。
否则，某些操作步骤必须调整，才可以获得稳定的质量。
14：
核酸抽提中的温度问题
核酸抽提中的温度问题，也是一个值得关注的问题。
首先要明确的一点是，任何一个温度条件，对某些方面有利，同时也一定会有不利的一面。
如沉淀，低温操作会提高得率，但也会增加杂质的残留。
任何一步操作该用什么温度为好，应该是利弊权衡的结果。
基本上，除了一些特殊的步骤，如消化等外，用室温是最好的选择。
那些认为“低温操作可以防止降解”之类的理由，并没有多少可信度的。
15：
如何阅读操作手册
拿到操作手册后，要倒着阅读：
先阅读问题解答，再看操作步骤下面的说明，再看操作步骤。
问题解答是别人在使用过程中曾经碰到过的问题集锦，操作步骤下面的说明是商家的警告。
没有一个商家会将他的操作步骤写得非常复杂，因为这是满足使用人员习惯的结果。
一句话，PS 和 By the Way 之类的话中含有真正的有用素材。
16：
其它
核酸抽提的每一步操作，都是利弊权衡的结果。
消化要
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