吴梧桐主编生物制药工艺学学习笔记.docx

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RevisedonNovember25,2020

吴梧桐主编生物制药工艺学学习笔记

第一章生物药物概论

1、生物药物的分类：

（1）基因重组多肽、蛋白类治疗剂

（2）基因药物（3）天然生物药物（4）合成与部分合成的药物。

DNA重组药物和基因药物的区别：

DNA重组药物即应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等；

基因药物即以基因物质（DNA或RNA）为基础，研究而成的基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。

2、生物药物的作用特点：

药理学特性：

（1）药理活性高

（2）治疗的针对性强，治疗的生理、生化机制合理，疗效可靠。

（3）毒副作用较少，营养价值高。

（4）生理副作用常用发生。

理化特性：

（1）生物材料中的有效物质含量低，杂质种类多且含量相对较高。

（2）生物活性物质组成结构复杂、稳定性差。

（3）生物材料易染菌，腐败。

（4）生物药物制剂的特殊要求。

3．DNA重组药物有：

（1）细胞因子干扰素类：

α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素

（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子：

白介素-2（IL-2）和突变型白介素-2（Ser125-IL-2）肿瘤坏死因子类主要有TNF-α和TNF-α受体。

（3）造血系统生长因子类：

粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO）干细胞生长因子（SCF）（4）生长因子类：

胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDFD）、转化生长因子（TGF-α和TGF-β）、神经生长因子及各种神经营养因子。

（5）重组多肽与蛋白质类激素：

重组人胰岛素（rhInsulin）、重组人生长激素（rhGH）、促卵胞激素（FSH）、促黄体生成素（LH）和绒毛膜促性腺激素（HCG）、重组人白蛋白和重组人血红蛋白（6）心血管病治疗剂与酶制剂：

Ⅷ因子、水蛭素、tpA、rtpA、尿激酶、链激酶、葡激酶、天冬酰胺酶、超氧化歧化酶、葡萄糖脑苷酶及DNsae等（7）重组疫苗与单抗制品：

重组乙肝表面抗原疫苗、乙肝基因疫苗、AIDS疫苗、流感疫苗、痢疾疫苗和肿瘤疫苗。

4术语

药物：

用于预防、诊断、治疗保健的一类物质。

药品：

是指用于预防、治疗、诊断人体疾病，有目的地调节人体生理功能并规定有适应证或者功能主治、用法和用量的物质，包括中药材、中药饮片、中成药、化学原料药及其制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清、疫苗、血液制品和诊断药品等。

药品根据其来源可分两大类：

天然药物即植物药、动物药和矿物药；合成药包括化学合成药与微生物合成药。

天然药物一般来源于自然界，很少有人工加工过程，药物成分相对较复杂。

生化药物：

（biopharmaceutics）是利用生物体、生物组织、细胞或其成分，综合应用生物学与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的原理与方法加工制造而成的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。

DNA重组药物：

即应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等。

基因药物：

以基因物质（RNA和DNA及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酸等。

生化药物：

是运用生物化学的理论、方法、技术与研究成果，从生物体（包括动物、植物、微生物和海洋生物）分离、纯化得到的一些重要生理活性物质，经药效学和毒理学研究证明对于疾病的防治是安全有效的一大类药物，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、维生素、激素、糖类、脂类、核酸、核苷酸及其衍生物。

反义药物：

是以人工合成的10~几十个反义寡核苷酸序列与模板DNA或mRNA互补形成稳定的双链结构，抑制靶基因的转录和mRNA的翻译，从而起到抗肿瘤和抗病毒作用，目前有20多种反义药物进入临床试验，其中ISIS是FDA批准的第一个反义药物，用于治疗AIDS病患者的巨噬细胞病毒性视网膜炎。

核酸疫苗：

将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的免疫应答以达到防病治病的目的。

第二章生物制药工艺学技术基础

1、生物活性物质的浓缩与干燥的方法：

生物活性物质的浓缩：

（1）盐析浓缩

（2）有机溶剂沉淀浓缩（3）用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩（4）用聚乙二醇（PEG）浓缩（5）超滤浓缩（6）真空减压浓缩与薄膜浓缩

生物活性物质的干燥：

（1）减压干燥

（2）喷雾干燥（3）冷冻干燥

2简述生物活性物质分离纯化的主要原理：

根据混合物中的不同组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，或者将混合物置于某一相中，外加一定作用力，使多组分分配于不同区域，从而达到分离的目的。

主要纯化原理有：

（1）根据分子的形状和大小不同进行分离

（2）根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离（3）根据分子极性大小及溶解度的不同进行分离。

（4）根据物质吸附性质的不同进行分离（5）根据配体特意性进行分离

3、保存菌种、菌种退化、检查菌种退化

常用的菌种保存方法：

斜面低温保藏法、液体石蜡封藏法、冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法、甘油冷冻保藏法、其他如沙土管保藏法。

菌种的退化意味着随时间的推移菌种的一个或多个特性逐步减退或消失，最终导致营养细胞的死亡。

一般把菌株的生活力、产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降统称为退化。

检查菌种退化：

（1）单位容积中发酵液的活性物质含量

（2）琼脂平皿上的单菌落形态，（3）不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征，如形成孢子的能力；（4）发酵过程的pH变动情况（5）发酵液的气味、色泽

4重组DNA技术基本原理，如何获取目的基因

基因工程是通过体外重组将甲生物体的基因转入乙受体生物体内进行表达的生物技术。

获取目的基因的方法有：

（1）鸟枪克隆法

（2）人工合成目的基因1、酶促方法2、化学合成法

5常见的基因载体有，如何构建基因重组体

在体外将含目的基因的DNA片段和具有自我复制功能、并带有选择标记的载体分子进行酶切连接，获的重组DNA分子。

常见的基因载体有：

链霉菌质粒、芽孢杆菌载体、质粒、噬菌体（phage）、黏粒（cosmid）、病毒载体等。

6DNA重组体有主要有哪几种表达系统各有什么特点

基因工程包括转录、翻译及翻译后加工等过程。

根据宿主细胞种类不同，分为原核基因工程和真核基因工程。

原核基因工程以原核细胞作为表达宿主，如大肠杆菌、枯草杆菌等；而真核基因工程则以真核细胞为表达宿主，如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。

（1）大肠杆菌表达系统：

遗传背景比较清楚，使用安全、技术操作简便，繁殖力强（20~30min即可繁殖一代），便于大规模培养，成本较低，表达水平较高（可达总蛋白的5%~6%），下游技术成熟、易于控制。

目前使用最广泛、最成功的表达系统。

（2）酵母表达系统：

①是真核表达体系，对表达蛋白可进行折叠和翻译后的修饰与糖基化；②表达量高，如明胶表达量达14。

8g/L;③培养成本低；④适用高密度发酵；⑤杂蛋白少，产物易纯化。

（3）哺乳动物表达系统：

中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和猴肾细胞（COS）优点是能识别和剪切外源基因的内含子并加工成为成熟的mRNA.但其培养技术难度大，成本高，研究与生产周期长。

三体系表达特点比较

表达体系

产物

产生部位

培养方式

提纯

产物活性

潜在危险

大肠杆菌

多肽、蛋白质或融合蛋白质

菌体内

容易

部分可获得高产

一般

对原核者好

真核者稍差

不大

酵母

多肽、蛋白质或糖基化蛋白

菌体内或分泌出细胞

容易

可高产

菌体内，稍复杂

真核的接近天然

不大

哺乳动物细胞

完整糖基化蛋白质

分泌出细胞

较难成本高

可高产

简单

几乎可为天然产物

需注意有致癌因素

7生物制药工艺中试放大的目的，如何进行中试放大。

中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性研究工作，对小试工艺能否成功地进入规模化生产至关重要。

这些研究工作都是围绕着如何提高收率，改进操作，提高质量，形成批量生产等方面进行。

中试放大的方法有经验放大法，相似放大法和数学模型放大法。

主要采用经验放大法。

8术语

微生物纯培养：

系指只在单一种类存在的状态下所进行的生物培养。

所有微生物、植物和动物都可以进行这种培养，高等植物或动物的无菌培养（无菌饲养）也可说是一种纯培养。

纯培养最重要的是在于微生物的生理研究，方法是依靠灭菌和分离，是由巴斯德（L．Pasteur）和柯赫（R．Koch）建立起来的。

在自然界中，有的培养条件很困难，特别是具有密切共生关系的生物及进行寄生性营养的生物；也有一些在理论上不可能进行纯粹培养的生物。

诱变育种：

是指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。

诱变育种主要包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株3个部分。

蛋白质工程：

在基因水平上设计表达新功能蛋白。

转基因动物：

将外源基因导入哺乳动物的受精卵或胚胎中，使导入基因与受精卵染色体整合，并将外源基因稳定地子代，使子代表现外源基因的性状。

蛋白质组学：

研究细胞、组织或个体全部蛋白质的全部表达状态与功能状态，是后基因时代重要研究方向

第三章、生物材料的预处理

1、去处发酵液中的杂蛋白的方法：

（1）加入凝聚剂

（2）加入絮凝剂（3）变性沉淀（4）吸附（5）等电点沉淀（6）加各种沉淀剂

2、去处发酵液中的钙、镁、铁离子的方法：

（1）离子交换法去铁离子

（2）沉淀法钙与草酸钠或草酸镁的去处用草酸沉淀不完全，碱性条件下用磷酸盐，或三聚磷酸钠，生成络合物（污染河水）

3、影响絮凝效果的主要因素：

絮凝剂分子量、絮凝剂用量、pH及操作条件

絮凝剂分子量越大，链越长，吸附桥架效果就越明显，但分子链越大，絮凝剂在水中的溶解度降低；

絮凝剂浓度越低，增加用量有助于架桥，提高絮凝效果，但过多引起吸附饱和，在胶粒表面形成覆盖层，使胶粒稳定，降低絮凝效果；

pH的变化影响离子型絮凝剂功能团的电离度，电离度的提高使电排斥作用增强，架桥能力最佳；

搅拌应注意，刚开始搅拌迅速使絮凝剂分散，发挥絮凝作用，絮凝团形成后，高的剪切力会打碎絮凝团。

4细胞破碎：

方法

原理

特点

机械法

匀浆法

基于液相的剪切力

适用面广，处理量大，速度快，工业广泛使用，不适用某些高度分支微生物，产热大，可能会生物活性物质失活

珠磨法

研磨作用破碎

适用面广，处理量大，工业广泛使用，产热大，可能会生物活性物质失活

超声波

超声波的空穴作用破碎

产热大，散热不易，成本高，适用小量样品破碎

物理法

干燥法

菌体细胞膜渗透性变化，自溶

较剧烈，易引起蛋白质或其他组分变性

冻融法

胞内冰晶引起细胞膨胀破碎

较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，实验室使用

渗透压冲击法

渗透压突然变化，细胞快速膨胀变化

较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用

化学法

化学试剂处理

化学试剂溶解细胞或抽提某些细胞成分

需选择合适的试剂，减少对活性物质的破坏，可应用于大规模生产

制成丙酮粉

丙酮迅速脱水，破坏蛋白质与脂质结合的键

迅速脱水，减少蛋白质变性，促进某些结合酶释放

生物法

酶解法

用酶反应分解破坏细胞壁上特有的化学键

反应条件温和，但成本较高，一般仅适用于小规模应用

组织自溶法

利用组织中酶改变、破坏细胞结构、使组织自溶

反应条件温和、成本低，不适用于易受酶降解的目的物的提取